紫外可见分光光度计的使用(精)

光吸收遵循朗伯-比尔定律：
A lg T lg I 0 bc
I
I0 入射光辐射强度 I 透射光辐射强度
T 透射比
a 吸光系数
ε 摩尔吸光系数
溶液对光吸收过程
仪器组成单光束分光光度计
光源
0.575
单色器
检测器 显示
吸收池
双光束分光光度计
光源 单色 器
比
光束分裂器
值
吸收池
检测器
紫外可见分光光度计
主要内容
1、工作原理及仪器组成
2 、分光光度计的使用 ➢ 波长扫描 ➢ 定量测定
3 、注意事项
一、工作原理及仪器组成
物质的颜色与吸收光的关系： 当白光照射到物质上时，如果物质对白光中某种颜色
的光产生了选择性的吸收，则物质就会显示出一定的颜色。 物质所显示的颜色是吸收光的互补色。
3. Instrument
4 standards标准参数设置 键入标系的样品浓度及名称
5 吸光度自动校零 在开始测试前，需要进行吸光度校零。在样品室参比和样
品光路中分别放入空白样品。按按钮 进行吸光度校零。 6 在wavelength中设定扫描的最大吸收波长， 7 放入标样，选中第一个标样，点measure依次测定完成 后自动给出标准曲线。 8 选择SAMPLE进行样品测定，全部测定完后点击END，此 时 自动生成一个文件，打开此文件，另存为所需的文件名。 9 关机时，先退出UVsolution，再关电脑，最后关光度计上 的power。
为了使测定结果有较高的灵敏度,必须选择溶液最大吸收波 长的入射光。
▪ 控制吸光度A的准确的读数范围:由朗伯-比耳定律可知,吸 光度只有控制在0.2~0.7读数范围内时,测量的准确度较高.
▪ 选择参比溶液：参比溶液是用来调节仪器工作零点的。若 样品溶液，试剂，显色剂无色可用蒸馏水作参比溶液；反 之应采用不加显色剂的样品液作参比溶液。
2 运行UV Solution软件。软件将自动配置计算机的 串行口（RS 232 Port）见图
仪器在初始化过程中进行如下自检工作：
▪ ROM检测 ▪ RAM检测 ▪ 波长步进电机运转检测 ▪ 氘灯点亮检测 ▪ 钨灯点亮检测 ▪ 仪器波长校正
3 仪器主机开始初始化。见图
4 仪器主机初始化完毕，进入工作状态。
▪ 旋转镜将光分成两束，分别通过参比池和样 品池，然后聚集在PMT
二 分光光度计的使用-波长扫描
开始
方法设定
样品名输入 将空白样品分别放入参比池和样品池
进行用户基线校正 将样品放入样品池 开始测量
打印数据 开始测量
启动UV Solution软件
1. 打开仪器主机电源。用鼠标点击Windows开始菜单中的 [Hitachi Applications]选项中的[UV Solutions 2.0] 选项。或 者直接在桌面上双击UV Solution图标。
4. 用完后先关程序，再关仪器开关，关电源，关闭计算机。 5. 正确登记，将仪器及实验台擦干净。
思考题
1. 分光光度计由哪几部分组成？设计其光路图。 2. 紫外可见分光光度计对光源的要求是什么？ 一般采
用哪几种光源，各光源的波长范围是什么？ 3. 比色皿一般由什么材料制成？有哪几种规格？做实验
时，你是如何选择比色杯的规格及材料的？ 4. 为什么测定时使用参比池？参比溶液怎么选择？ 5. 在进行波长扫描与光度测定时需要设置哪些参数？
三 注意事项
1. 开机预热15分钟左右。 2. 测定时应注意：
参照池和吸收池应是一对经校正好的匹配的吸收 池，材料和规格一致。
使用前后应将洗手池洗净，测量时不能用手接触 窗口。
已匹配好的比色皿不能用炉子和火焰干燥，不能 加热，以免引起光程长度上的改变。
3. 测量条件的选择： ▪ 选择适宜波长的入射光:由于有色物质对光有选择性吸收,
显
示Βιβλιοθήκη Baidu
组成：光源、单色器、样品池、检测器
1．光源： ①能提供连续的辐射；②光强度足够大；③在整个光谱区 内光谱强度不随波长有明显变化；④光谱范围宽；⑤使用 寿命长，价格低。 钨灯——可见光区 320～2500nm 氢灯或氘灯——紫外光区 195－375nm
U3010（碘钨灯、氘灯）波长范围190-900nm
5 测量参数设置
1 在[Edit]菜单中选择[Method…]选项，或按按钮。出现下列窗口。
General:总体设置页面
▪ Measurement测量: Wavelength scan 波长扫描 Time scan 时间扫描 Photometry 定波长测量
▪ Operator操作者: 输入操作者的姓名 ▪ Instrument仪器:仪器型号由软件自动从仪器主机获得。 ▪ Use Sample Table使用样品表:选择是否使用样品表。 ▪ Comments备注:填写一些备注信息。 ▪ [Load]按钮:用于装载原来保存的方法文件。 ▪ [Save]按钮:保存当前的设置参数。 ▪ [Save As]按钮:将当前设置参数另存为一个方法文件。
在[Edit]菜单中选择[Method…]选项。出现下列设置窗口.
具体操作程序
Method:
1. general: Measurement测量方式选择Photometry（光度 计测量）
2. Quantitation定量参数设置页面：
在measure中选择波长wavelength，在Calibration中选择 “1st order”， “2st order”， “3st order”，也可以不校准。 在concertration中键入标准浓度单位。
2．单色器：包括狭缝、准直镜、色散元件 单色器是分光光度计的心脏部分，它的作用是把来自光源
的混合光分解为单色光并能随意改变波长。它的主要组成部 件和作用是：
①入射狭缝——限制杂散光进入。 ②色散元件——即棱镜或光栅，是核心部件，可将混合光 分解为单色光。 ③准直镜——把来自入射狭缝的光束转化为平等光，并把 来自色散元件的平等光聚焦于出射狭缝上。 ④出射狭缝——只让特定波长的光射出单色器。
3. 吸收池 玻璃——由于吸收紫外UV光，仅适用于可见光区； 石英——适用于紫外和可见光区
4．检测器：将光信号转变为电信号的装置 ▪ 光电管 ▪ 光电倍增管 ▪ 二极管阵列检测器 5．记录装置：讯号处理和显示系统
▪ Slit 1不存在，Mirror取代了光栅grating 1
▪ Grating2 variable-pitch aberration-corrected diffraction grating
基线校正
▪ 用户基线校正方法：可将scan speed 设小一些；进行样 品扫描时，可设大一些。 将空白样品分别放入样品室的 参比光路和样品光路。按按钮
▪ 系统基线校正方法。 使用空气作为参比和样品。按按钮 出对话框见图，选 择System后按[OK]按钮，进行系统基线校正。
测量
有两种方法可以开始测量： ▪ 使用菜单方式
颜
互
色 的
植物叶子呈现绿色是 因为植物中存在一种 吸收蓝紫光和红光的
补 色
产
载体——叶绿素
原
生
理
完全吸收
光谱示意 复合光 表观现象示意
完全透过 吸收黄色光
利用一定频率的紫外--可见光照射分析物，它将有选择 地被吸收。吸收光谱可以反映出物质的特征。
物质对光的选择性吸收－溶液对光的作用
溶液对光的作用示意图
选择[Spectrophotometer]菜单下Start]选项开始测量 ▪ 使用按钮方式 ：按按钮 开始测量 ▪ 如果要终止扫描按按钮 。
二 分光光度计的使用-光度法
开始
方法设定
样品名输入 将空白样品分别放入参比池和样品池
进行用户基线校正 将样品放入样品池 开始测量
打印数据 开始测量
测量参数设置
Instrument仪器参数设置页面
▪ Data mode读数显示方式，选择Abs吸光度，波长扫描的起止 范围一般为190-800，狭缝值一般为2
▪ Light一般选择“Auto”
Monitor显示页面
Processing数据处理页面
Report报告结果页面
样品名设置，备注信息及文件名输入