包含体分离纯化
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注意事项：
超声破碎具体条件可根据实验情况而定，要掌握好功率和每次超声时 间，降低蛋白被降解的可能。 功率大时，每次超声时间可缩短，不能让温度升高，应保持在4℃左右， 超声时保持冰浴。 菌体破碎后总蛋白浓度的测定可用Bradford法或者紫外吸收法。 可通过SDS-PAGE电泳观察菌体破碎程度及目标条带占总蛋白的含量。
以包含体形式表 达的rGM-CSF分 离纯化
Extraction and purification of inclusion body
含有从组蛋白质包 含体的宿主细胞
以包含体形式表达的rGM-CSF分离纯化
搜集菌体细胞，并 破碎细胞 离心，弃上清液
STEP 1 超声波破菌
①以缓冲液充分洗涤 ②加入强变性剂 STEP 2 包含体的洗涤 ③加入还原剂 溶解的重组蛋白质 不溶物质 ④离心
STEP 2 包含体的洗涤
液固分离
去除沉淀包含体中 的可溶性杂蛋白
去除细胞碎 片等杂质
为进一步纯 化提供有利 条件
以 10000r/ min于 4℃离心 30min
用pH 8.3的TE 缓冲液 反复洗 涤
用0.5% 的表面 活性剂 Triton X-100的 TE缓冲 液，悬 浮洗涤 30min
除去大 部分杂 质，目 的蛋白 的纯度 达到 85%
THANKS~
线性梯度洗脱：0~1 mol/L NaCl 、20mmol/LTris-HCL、pH 8.3 0.1 mol/L NaCl 洗脱杂蛋白 0.2 mol/L NaCl 洗脱目的蛋白 1.0 mol/L NaCl 再生柱子浓度
最终选定
收集的样品对pH7.0的PBS于4℃透析，15%SDS-PAGE纯度分析和活性测定。
源自文库
选择Sephacry-200HR作色 谱填料填装柱子
洗脱缓冲液：6mol/L 尿素 & 1mmol/L DTT的ET缓冲液 注意！ 上样前需要将包含体抽提物于37℃温育30min。
Why?
STEP 5 rGM-CSF的复性
收集的样品+5mmol/L DTT
42℃
15min
上样至脱盐柱
缓 冲 液
60mmol/L Tris-HCL
含有重组蛋白的沉 淀
STEP 3 包含体中rGM-CSF的抽提 STEP 4 凝胶过滤色谱分离
凝胶过滤
离子交换层析
STEP 5 rGM-CSF的复性
吸附层析 STEP 6 离子交换色谱纯化
重组蛋白质的复性
图 1 纯化大肠杆菌包含体中的重组蛋白质的一般步骤
STEP 1 超声波破菌
发酵完毕，以4000r/min于4℃离心10min收集菌体。使用超 声波仪破菌，选择一系列菌体浓度、超声强度和超声时间。镜 检评价其破碎效果。 破菌原则：使大肠杆菌菌体破碎率尽可能高，又要保持包含体 的完整性。
STEP 3 包含体中rGM-CSF的抽提
包含体由蛋白质分子之间相互作用形成共价或非共价缔合而成。 包含体溶解：加入变性剂破坏分子内或分子间的相互作用。 包含体中有各种错配的二硫键，需加入还原剂以解开二硫键。 还原剂：二硫苏糖醇（DTT） 变性剂：尿素、盐酸胍、SDS
价格低 适合各种色谱纯化
具体步骤：将抽提液与包含体混匀（100mL:1g），室温下搅 拌30min后，以15000r/min于4℃离心26min，上清液即为 rGM-CSF抽提液，于4℃存放。
STEP 4 凝胶过滤色谱分离
凝胶过滤是分离包含体抽提物种变性蛋白的有效方法。
目的蛋白：1.5×104
相对分子质量
杂质蛋白：3.0×104
6mol/L尿素
pH 8.3
稀释蛋白样品至100μg/mL（缓冲液：20mmol/L Tris-HCL ，pH8.3）
用谷胱甘肽氧化还原系统促进二硫键正确配对 还原型 1 mmol/L 氧化型 0.1mmol/L 4℃
静置复性12h
活性检测
STEP 6 离子交换色谱纯化
用 20mmol/L Tris-HCL ，pH8.3 平衡DEAE Sepharose Fast Flow 柱 上样流速:10mL/min
超声破碎具体条件可根据实验情况而定，要掌握好功率和每次超声时 间，降低蛋白被降解的可能。 功率大时，每次超声时间可缩短，不能让温度升高，应保持在4℃左右， 超声时保持冰浴。 菌体破碎后总蛋白浓度的测定可用Bradford法或者紫外吸收法。 可通过SDS-PAGE电泳观察菌体破碎程度及目标条带占总蛋白的含量。
以包含体形式表 达的rGM-CSF分 离纯化
Extraction and purification of inclusion body
含有从组蛋白质包 含体的宿主细胞
以包含体形式表达的rGM-CSF分离纯化
搜集菌体细胞，并 破碎细胞 离心，弃上清液
STEP 1 超声波破菌
①以缓冲液充分洗涤 ②加入强变性剂 STEP 2 包含体的洗涤 ③加入还原剂 溶解的重组蛋白质 不溶物质 ④离心
STEP 2 包含体的洗涤
液固分离
去除沉淀包含体中 的可溶性杂蛋白
去除细胞碎 片等杂质
为进一步纯 化提供有利 条件
以 10000r/ min于 4℃离心 30min
用pH 8.3的TE 缓冲液 反复洗 涤
用0.5% 的表面 活性剂 Triton X-100的 TE缓冲 液，悬 浮洗涤 30min
除去大 部分杂 质，目 的蛋白 的纯度 达到 85%
THANKS~
线性梯度洗脱：0~1 mol/L NaCl 、20mmol/LTris-HCL、pH 8.3 0.1 mol/L NaCl 洗脱杂蛋白 0.2 mol/L NaCl 洗脱目的蛋白 1.0 mol/L NaCl 再生柱子浓度
最终选定
收集的样品对pH7.0的PBS于4℃透析，15%SDS-PAGE纯度分析和活性测定。
源自文库
选择Sephacry-200HR作色 谱填料填装柱子
洗脱缓冲液：6mol/L 尿素 & 1mmol/L DTT的ET缓冲液 注意！ 上样前需要将包含体抽提物于37℃温育30min。
Why?
STEP 5 rGM-CSF的复性
收集的样品+5mmol/L DTT
42℃
15min
上样至脱盐柱
缓 冲 液
60mmol/L Tris-HCL
含有重组蛋白的沉 淀
STEP 3 包含体中rGM-CSF的抽提 STEP 4 凝胶过滤色谱分离
凝胶过滤
离子交换层析
STEP 5 rGM-CSF的复性
吸附层析 STEP 6 离子交换色谱纯化
重组蛋白质的复性
图 1 纯化大肠杆菌包含体中的重组蛋白质的一般步骤
STEP 1 超声波破菌
发酵完毕，以4000r/min于4℃离心10min收集菌体。使用超 声波仪破菌，选择一系列菌体浓度、超声强度和超声时间。镜 检评价其破碎效果。 破菌原则：使大肠杆菌菌体破碎率尽可能高，又要保持包含体 的完整性。
STEP 3 包含体中rGM-CSF的抽提
包含体由蛋白质分子之间相互作用形成共价或非共价缔合而成。 包含体溶解：加入变性剂破坏分子内或分子间的相互作用。 包含体中有各种错配的二硫键，需加入还原剂以解开二硫键。 还原剂：二硫苏糖醇（DTT） 变性剂：尿素、盐酸胍、SDS
价格低 适合各种色谱纯化
具体步骤：将抽提液与包含体混匀（100mL:1g），室温下搅 拌30min后，以15000r/min于4℃离心26min，上清液即为 rGM-CSF抽提液，于4℃存放。
STEP 4 凝胶过滤色谱分离
凝胶过滤是分离包含体抽提物种变性蛋白的有效方法。
目的蛋白：1.5×104
相对分子质量
杂质蛋白：3.0×104
6mol/L尿素
pH 8.3
稀释蛋白样品至100μg/mL（缓冲液：20mmol/L Tris-HCL ，pH8.3）
用谷胱甘肽氧化还原系统促进二硫键正确配对 还原型 1 mmol/L 氧化型 0.1mmol/L 4℃
静置复性12h
活性检测
STEP 6 离子交换色谱纯化
用 20mmol/L Tris-HCL ，pH8.3 平衡DEAE Sepharose Fast Flow 柱 上样流速:10mL/min