抗生素微生物检定法
抗生素微生物检定法讲解学习
试验准备
试验准备
管碟法的操作底层的制备： 每碟加底层培养基20ml，
待培养基凝固后，盖上 陶瓦盖，置35~37℃培 养箱中，待用。 ▪ 菌层的制备： 加入约含1%浓度菌悬液的 培养基5ml作为菌层
管碟法的操作步骤
▪ 加钢圈 ▪ 滴加抗生素溶液
培养
▪ 温度：一般为 36~37℃
▪ 对复方制剂产品的检验，微生物检定法选 择性差，效价测定受其他成分的影响。
▪ 如：妥布霉素滴眼液，配方中含苯扎溴胺 作为防腐剂，苯扎溴胺具有抑菌作用，使 样品的抑菌圈增大，导致标准品和样品的 剂量反应曲线偏离，无法测准妥布霉素的 含量。
抗生素微生物检定法分类
▪ 1.稀释法 ▪ 2.浊度法 ▪ 3.琼脂扩散法（管碟法和打孔法） ▪ 2010版药典采用管碟法和浊度法来测定抗
测定不同浓度的抗生 素溶液在固体培养基 表面产生的抑菌圈的 大小
目的 抗生素最低抑菌浓 抗生素抑菌效力的测定 度（MIC）的测定
应用 用于新药研制及临 抗生素效力的测定方法 床药敏试验等方面
抗生素微生物检定法 包括管碟法和浊度法
▪ 管碟法：利用抗生素在摊布特定试验菌的 固体培养基内成球面形扩散，形成含一定 浓度抗生素球形区，抑制了试验菌的繁殖 而呈现出透明的抑菌圈。根据抗生素在一 定浓度范围内，对数剂量与抑菌圈直径 （面积）呈直线关系而设计，通过检测抗 生素对微生物的抑制作用，比较标准品与 供试品产生抑菌圈的大小，计算出供试品 的效价。
会影响抗生素效价的测定
管碟法
▪ 利用抗生素在固体培 养基中的平面扩散作 用，依据量反应平行 原理并采用交叉实验 设计方法。在相同的 试验条件下通过比较 标准品（已知效价） 和供试品两者对所接 种试验菌产生的抑菌 圈（直径或面积）的 大小来测定供试品效 价的一种方法
第四章抗生素效价的微生物检定法
４、特定单位 以特定的抗生素样品的某一质 量定为一单位。
复习旧课:
1、抗生素是指主要由_____生成的———————— ________________________一类________化合物 称之。
2、作为医疗用抗生素应具有————、————、— ———、————特点。
第四章： 抗生素效价的微生物检定法
教学目标：
１.解释抗生素概念、叙述医疗用抗生素特点、 了解抗生素的主要作用机制
２.叙述抗生素的效价和单位及其表示方法 ３.熟知抗生素效价检定操作流程与基本要求 ４.述说测定原理。 教学重点： 抗生素概念、医疗用抗生素特点、抗生素的效价 和单位及其表示方法 抗生素效价检定操作方法与基本要求
浊度法：系利用抗生素在液体培养基中对试验菌生 长的抑制作用，通过测定培养后细菌浊度值的大小， 比较标准品与供试品对试验菌生长抑制的程度，以 测定供试品效价的种方法。
管碟法：是利用抗生素在含敏感试验菌的琼脂培养 基中的球面扩散渗透作用，从而形成一定的抑菌圈。 通过琼脂培养基，可观察并测量出抑菌圈的大小。 在一定的抗生素浓度范围内，对数剂量(浓度)与抑 菌圈的表面积或直径成正比。
② 高、低剂量所形成的抑菌圈之差最好大于 2 mm，有些抗生素的差数可较小；
③ 高、低剂量之比一般用2:1，当高、低剂量 所致的抑菌圈差别较小时，可用高低剂量之 比为4:1的比率。
操作步骤： 1. 称量 2. 稀释 3. 双碟的制备 4. 放置钢管 5. 滴加抗生素溶液 6. 抑菌圈测量
图4－6：钢管放置器 （北京先驱威锋技术开 发公司生产开发）
教学难点： 抗生素效价检定操作方法 二剂量法效价计算公式 抗生素的主要作用机制
120抗生素微生物检定法简介及在药品申报中应关注的一些问题
发布日期20060609栏目化药药物评价>>化药质量控制标题抗生素微生物检定法简介及在药品申报中应关注的一些问题作者张敏蒋煜部门正文内容审评三部张敏蒋煜摘要：本文结合中国药典要求，初步探讨了抗生素微生物检定法在抗生素含量测定中的应用、不同的测定方法及其特点，测定过程中的注意事项等内容。
旨在提请申请人注意在对该部分进行研究时，一方面需要根据不同目的选择合适的检测方法，另一方面需要注意影响各方法测定结果的因素，重视方法学验证。
关键词：抗生素微生物检定法，方法验证。
一、概述抗生素微生物检定法是利用抗生素在低微浓度下选择性地抑制或杀死微生物的特点，以抗生素的抗菌活性为指标，来衡量抗生素中的有效成份效力的方法。
是国际上通用的、经典的抗生素效价测定方法，在各国药典中被普遍采用。
多用于结构十分复杂和多组分的抗生素的含量测定。
抗生素微生物检定法根据试验方法的不同可分为：稀释法、比浊法、扩散法。
（1）稀释法将等量的试验菌菌液加入到含有不同浓度的抗生素的液体培养基中，观察液体培养基中有无细菌生长，所得的结果是一种范围而不是绝对值。
主要用于MIC测定及临床药敏试验。
（2）比浊法是将一定量的抗生素加至接种有试验微生物的澄清的营养丰富的液体培养基中，混匀后，在一定的温度下，短期培养（约3～4小时），培养基变浑浊，其浑浊程度与细菌数的增加、细菌群体质量的增加和细菌群体细胞容积的增加之间存在直接关系，当一定光束照射培养基时，通过测定其透过率就可知道细菌生长的情况，其吸光度与抗生素浓度关系符合比尔定律，即在一定的抗生素浓度范围内，剂量反应为一直线。
因此，在剂量反应响应曲线的直线范围内，即可设计用比浊法测定抗生素含量。
（3）扩散法扩散法中又有纸片法、管碟法等，纸片法主要用于药敏试验，我国药典收载的抗生素效价测定方法主要是管碟法，也是国际通用的方法。
其基本原理是利用抗生素在摊布特定试验菌的琼脂培养基内的扩散作用，形成一定浓度的含抗生素的球型区，抑制了试验菌的繁殖而呈现出透明的抑菌圈，将已知效价的标准溶液和未知效价的供试品溶液在同样条件下进行培养，比较两者抑菌圈大小，在一定的抗生素浓度范围内，对数浓度与抑菌圈直径成正比。
抗生素微生物检定管碟法
抗生素微生物检定管碟法抗生素微生物检定法可分为：（1）稀释法；（2）比浊法；（3）琼脂扩散法（管碟法和打孔法）。
各国药典通常采用后两种方法测定抗生素的效价。
管碟法：利用抗生素在摊布特定试验菌的固体培养基内成球面形扩散，形成含一定浓度抗生素球形区，抑制了试验菌的繁殖而呈现出透明的抑菌圈。
此法系根据抗生素在一定浓度范围内，对数剂量与抑菌圈直径（面积）呈直线关系而设计，通过检测抗生素对微生物的抑制作用，比较标准品与供试品产生抑菌圈的大小，计算出供试品的效价。
原理：利用抗生素在固体培养基中的平面扩散作用，依据量反应平行线原理并采用交叉实验设计方法，在相同实验条件下通过比较标准品（已知效价）和供试品两者对所接种试验菌产生的抑菌圈（直径或面积）大小，来测定供试品效价的一种方法。
管碟法的操作步骤：1、预试验：确定最佳的试验条件：调整试验菌的浓度、使用量、抗生素终浓度、培养基等，使抑菌圈的大小符合规定：一剂量法中心点的抑菌圈直径应在16～17.5mm，二剂量法高剂量浓度标准品溶液所致的抑菌圈直径在18～22mm，三剂量法中间剂量浓度标准品溶液所致的抑菌圈直径在15～18mm。
2、试验准备：双碟、钢管、毛细滴管、吸管的清洗及灭菌；容量瓶、定量吸管的清洗；培养基、缓冲液的准备、半无菌间的紫外消毒等。
3、双碟的制备：每只双碟加底层培养基约20ml，待培养基凝固后，将双碟放入35～37℃培养箱中，待用。
4、供试品、标准品溶液的制备：估计供试品的效价，根据试验要求设计供试品、标准品溶液稀释步骤，平行制备供试品、标准品相关剂量的溶液。
5、菌层的制备：注意菌层培养基温度；根据预试验确定加入菌层培养基的菌液量，注意制备菌层的速度和平整度。
6、滴加抗生素溶液：注意标准品、供试品高、低剂量溶液滴加顺序，保证滴加速度和加量的均匀一致。
7、双碟的培养：根据培养温度的要求在培养箱中进行培养，培养箱中水平碟放的双碟数以不超过三层为宜。
8、抑菌圈的测量：抑菌圈测量仪的使用，每组试验双碟应在相同的测量参数下进行测量。
抗生素微生物检定法
抗生素微生物检定法本法系在适宜条件下，根据量反应平行线原理设计，通过检测抗生素对微生物的抑制作用，计算抗生素活性（效价）的方法。
抗生素微生物检定包括两种方法，即管碟法和浊度法。
测定结果经计算所得的效价，如低于估计效价的90%或高于估计效价的110%时，应调整其估计效价，重新试验（标准曲线法除外）。
除另有规定外，本法的可信限率不得大于5%。
管碟法本法系利用抗生素在琼脂培养基的扩散作用，比较标准品与供试品两者对接种的试验菌产生抑菌圈的大小，以测定供试品效价的一种方法。
（一）基本设备、用具、试验材料及标准品1. 基本设备（1）抗生素效价测定实验室：室应为半无菌，装有紫外线灯，有固定的效价测定台，台面要求水平、防震。
该室应与稀释抗生素溶液的工作室隔离，以防止空气、地面污染抗生素。
（2）超净工作台：超净工作台应放置在洁净工作室或半无菌室。
（3）抑菌圈面积测量分析仪：该仪器装有微处理机，可自动测量抑菌圈面积，并打印出统计分析的各种数据。
2. 用具（1）玻璃双碟：为硬质玻璃制品，碟底径约90mm，碟高16~17mm，碟底面应平，厚薄均匀无凹凸现象。
新购的双碟应按上述要求进行检查。
检查时可将双碟底平放在水平台上，每碟加入2ml染料液，仔细观察碟底反映的颜色深浅是否一致，挑选底部平的双碟，洗净晾干，置高温烘箱140~160 ℃干热灭菌2小时后备用。
（2）瓦圆盖：应平，无凹凸现象。
（3）不锈钢小管：外径7.8±0.1mm，径6.0±0.1mm，高10.0±0.1mm，重量差异不超过±25mg，钢管外壁要求光洁，管壁厚薄要一致，两端面要平坦光洁。
（4）小钢管放置器：四孔和六孔各一台。
（5）游标卡尺：精密度0.02mm。
（6）滴管：管口应细长平滑，不得有缺口。
3. 试验材料（1）培养基及其制备方法以下培养基、缓冲液制备时，均以115℃灭菌30分钟。
培养基Ⅰ胨 5g 磷酸氢二钾 3g 水 1000ml牛肉浸出粉 3g 琼脂 15~20g除琼脂外，混合上述成分，调节PH使比最终的PH值略高0.2~0.4，加入琼脂，加热溶化后滤过（用纸浆减压滤过或纱布棉花滤过），调节PH值使灭菌后为7.8~8.0或6.5~6.6，分装，灭菌。
抗生素微生物检定法讲解学习
结果计算及判断
结果计算及判断
▪ 抑菌圈的测量以及结 果的可靠性检验及效 价测定
多功能微生物自动测量分析仪
结果可靠性分析
▪ 试品间（F1）：供试品的估计效价是 否合适。P＞0.05
▪ 回归（F2）：剂量反应关系是否成立。 P＜0.01
▪ 偏离平行（F3）：量反应直线的斜率 是否有显著差异。P＞0.05
▪ 剂间（F6）：不同浓度间的差异是否 显著。P＜0.01
▪ 碟间（F7）：同一浓度间差异是否显 著。 P＞0.05
结果计算及判断
▪ 重试判定
▪ 抑菌圈大小的要求
▪ 可靠性检验：符合可靠性检验的各项规定
▪ 可信限率：供试品效价测定结果（PT）的 可信限率除特殊规定外，不得大于5%。
▪ 实测效价与估计效价：应在90~110%之间， 否则结果仅作为初试，应予以重试。
▪ 效价测定结果不符合规定时，需换人加倍 复试。
二剂量法计算
P=log1T T2 2 T S12ST21 S S1 1I100%
结果计算及判断
检定的影响因素
▪ 标准品与供试品的同质性 ▪ 抑菌圈质量的控制 ▪ 直线斜率的控制 ▪ 直线截距的控制
抑菌圈的形状
试验中抑菌圈常有破裂、不远、甚 至无圈的现象： ▪ 在滴加抗生素溶液时药液溅出、碰到 钢管壁引起漏液，导致不圆 ▪ 双碟、钢管等残留抗生素或清洁液 ▪ 试验菌菌龄过老、检定菌被烫死等 ▪ 缓冲盐的Ph值和盐浓度影响扩散
试验准备
试验准备
管碟法的操作步骤
▪ 培养基的制备
管碟法的操作步骤
▪ 底层的制备： 每碟加底层培养基20ml，
待培养基凝固后，盖上 陶瓦盖，置35~37℃培 养箱中，待用。 ▪ 菌层的制备： 加入约含1%浓度菌悬液的 培养基5ml作为菌层
抗生素微生物检定法的增修订内容及操作要点
该方程奠定了管碟法量－反应直线公式 的基础。
将上述公式简化、移行，并将自然对数 转换为常用对数得：
lg M 1 r 2 lg C'4DTH
9.21DT
上述公式表明，抗生素总量的对数(lgM) 与所形成的抑菌圈半径的平方(r2)呈直 线关系，即通过抑菌圈的大小来测定抗 生素抗菌活性物质的量。
抗生素微生物检定法的增修订 内容及操作要点
抗生素微生物检定法
1．抗生素微生物检定法的概况 2．微生物效价测定法国内外药典的比较 3．微生物效价测定法的操作要点 4．微生物效价检定法的建立和方法学验 证
1．抗生素微生物检定法的概 况
1．1．定义 抗生素圈边缘清晰度是影响测定结果的重要因素之一， 导致抑菌圈边缘不清晰的原因如下：
➢ 在抑菌圈形成过程中抗生素的扩散系数紊乱、不均 一，不符合动力学公式中各项之间的关系或各扩散 系统交叉所致。
（4）化学稳定性较差的抗生素，由于降解导致供 试品与标准品不同质。
（5）操作上可能引入的误差。
3.1.2.2．抑菌圈质量的控制
（1） 抑菌圈的形状：
实验中抑菌圈常有圈破裂、不圆、甚至无圈的现 象，其原因是多方面的:
➢ 在滴加抗生素溶液时药液溅出、毛细滴管碰到钢 管壁使抗生素溶液漏出，出现不圆等；
➢ 操作中若各钢管中加液时间不同，可影响抑菌 圈的大小，所以一组双碟加样时，应尽量缩短 加样间隔时间，并保持加样速度的均匀性，以 减少误差。
➢ 抑菌圈的大小还受抗生素扩散系数的影响，若 在缓冲液中加入0.3%的氯化钠或在培养基中加 一定量的盐或吐温，可增加抗生素的扩散能力， 使抑菌圈增大。
（3） 抑菌圈边缘清晰度的控制
抗生素微生物检定法(实习总结)
抗生素微生物检定学习报告及总结抗生素微生物检定法系在适宜条件下，根据量反应平行线原理设计，通过检测抗生素对微生物的抑制作用，计算抗生素活性（效价）的方法。
抗生素微生物检定包括两种方法，即管碟法和浊度法。
测定结果经计算所得的效价，如低于估计效价的90%或高于估计效价的110%时，应调整其估计效价，重新试验。
除另有规定外，本法的可信限率不得大于5%。
管碟法（二剂量）测定抗生素的效价管碟法（cylinder plate method）是根据抗生素在琼脂平板培养基中的扩散渗透作用，比较标准品和检品两者对试验菌的抑菌圈大小来测定供试品的效价。
管碟法的基本原理是在含有高度敏感性试验菌的琼脂平板上放置小钢管,管内放入标准品和检品的溶液，经16～18小时恒温培养，抗生素扩散的有效范围内则产生透明的无菌生长的区域，常呈圆形，称为抑菌圈。
抑菌圈直径大小与抗生素浓度相关，比较抗生素标准品与检品的抑菌圈大小，可计算出抗生素的效价。
1 实验材料1.1 实验试剂抗生素检定培养基Ⅱ号、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、0.9%灭菌生理盐水1.2 实验菌株及样品菌株为藤黄微球菌菌悬液，样品为车间生产的酒石酸泰乐菌素干粉。
1.3 实验仪器及设备玻璃烧杯、容量瓶、直径90mm的玻璃培养皿、刻度吸管、移液管、胶头吸管、不锈钢管（内径6.0±0.lmm，外径8.0±0.lmm，高10±0.lmm）、镊子、菌株培养茄瓶、三角烧瓶、温度计、多功能微生物自动测量分析仪、微波炉、恒温培养箱、电热鼓风干燥箱、高压蒸汽灭菌锅、2 实验方法2.1 实验用菌株制备提前将藤黄微球菌接种于茄瓶斜面培养基，置30℃左右温箱培养2～3天后取出放4℃储存。
用时取出茄瓶于无菌环境下无菌操作，向茄瓶内加入5ml 0.9%灭菌生理盐水，轻轻摇动茄瓶，将斜面细菌洗下制备成一定浓度的菌悬液（浓度大小以最终产生的抑菌圈大小在16～18mm之间而定）。
2.2 抗生素检定培养基的配制准确称取抗生素检定培养基Ⅱ号26.5g倒入三角烧瓶中，加入1000ml纯化水，混匀后塞上塞子，以牛皮纸包扎后于115℃高压蒸汽灭菌30分钟备用。
抗生素微生物检定法
放置牛津杯时，注意管与管之间不能太靠近，否那么会引起相邻的两个抑菌圈 之间的抗生素扩散区中的浓度增大，相互影响形成卵圆形或椭圆形抑菌圈。管 与双碟边缘同样也不能太靠近，因为液面浸润作用，边缘的琼脂培养基菌层为 非平面，会影响抑菌圈的形状。可在试验前在双碟的底上用尺测量，作好标记， 试验中可以按照双碟底面标记放置牛津杯，防止放置位置不恰当产生的问题。
7.2 用游标卡尺测量抑菌圈直径，可以在双碟底部垫一张黑纸，在灯光下 测量。不宜取去牛津杯再测量，因为牛津杯中剩余的抗生素溶液会流出扩 散，使抑菌圈变得模糊。不能把双碟翻转过来测量抑菌圈直径，因为底面
玻璃折射会影响抑菌圈测量的准确度。记录测量结果后进行效价计算。 8.讨论
试验中，往往会出现异常情况，使得试验结果与预期出现很大差异。因此 抗生素试验的每一步都需要仔细谨慎，严格按照操作标准，才可以得到准 确的检测结果。准确测定抗生素效价，对评价抗生素的治疗效果，指导临
式中：P为供试品效价〔相当于标示量或估计效价的百分数〕 S2为标准品高浓度溶液所致抑菌圈直径〔或面积〕的总和； T2为供试品高浓度溶液所致抑菌圈直径〔或面积〕的总和； S1为标准品低浓度溶液所致抑菌圈直径〔或面积〕的总和； T2为供试品低浓度溶液所致抑菌圈直径〔或面积〕的总和； I为高、低浓度之比的对数值，2：1时，I=0.301；4：1时，I=0.602
管碟法是国内外常用的抗生素微生物检定法[1]，利用管碟法测定抗生素效价，具 有准确、直观、重复性好等优点，因而被广泛采用。但是整个试验过程中影响结 果的因素很多，任何一个环节操作不当或者忽略就会造成很大误差，导致整组试 验失败。根据实际操作中的积累经验，对管碟法中影响试验结果的因素进行如下 分析及提出解决的方法。
1. 实验器材的准备 1.1 实验器材的选择 试验应该选择底面平整的玻璃双碟，防止底面的凹凸影响琼脂层的厚度。可将双 碟放置在水平台上，下垫一层白纸，参加3mL水，再滴加蓝墨水，根据蓝色是否 深浅一致来判断双碟底面平整程度。牛津杯那么应该选择加工精细的同一批产品， 这样才能保证管壁厚薄与重量均匀一致，使得牛津杯在培养基中下陷相同的深度， 抗生素溶液扩散均匀有可比性。如果牛津杯两端不够平，就应予剔除，否那么会 使抗生素溶液漏出，破坏均匀扩散现象。
抗生素微生物检定法
抗生素微生物检定法是国际上通用的、经典的抗生素测定方法。
自20世纪40年代建立至今，在各国药典中被普遍采用。
虽然伴随着HPLC等化学分析技术的发展，一些抗生素品种的效价已被化学分析法所取代，但由于①微生物检定法可直观、特异地反映出抗生素品种的抗菌活性；②多组分抗生素由于结构与不同活性组分生物活性的差异，化学测定结果难以准确表征组分组成、含量和生物活性间的关系；③许多抗生素品种由于各种原因如无特征紫外吸收等，目前没有适当的化学分析方法表征其活性，故抗生素微生物检定法目前在各国药典中仍占有重要的地位，且短期内化学分析法不可能完全取代微生物检定法。
中国药典2005年版仍采用抗生素微生物检定法中的管碟法测定其效价，目前申报已有国家标准的该类制剂较多，在质量研究中存在诸多问题，现就常见的问题加以分析，希望对注册申请人有所帮助。
一、方法的建立1、供试品与标准品的同质性抗生素微生物检定法的原理以供试品与标准品同质为前提，方法建立前，首先应确定供试品与标准品是否同质，包括化学结构、所含组分及组分比例的一致性，对于制剂还要考虑辅料的影响是否造成供试品与标准品不同质。
2、培养基、试验菌、缓冲液和培养条件的选择可参照中国药典建立，在此不再赘述。
3、检定方法的确定可采用一剂量法（标准曲线法）、二剂量法及三剂量法等。
一般确定线性与范围采用一剂量法（标准曲线法），常规含量测定采用二剂量法，标准品标定采用三剂量法。
4、抗生素溶液的稳定性选定的品种可参照中国药典现行版附录抗生素微生物检定法的品种，若溶剂和缓冲液与其不同，应考察抗生素储备溶液和测定溶液在室温、40℃和不同pH值缓冲液中，以及放置不同时间的稳定性，以确定抗生素储备溶液和测定溶液的存放时间和条件。
二、方法的验证验证的目的是证明采用的方法适合于检测的要求。
验证内容有：准确度、精密度（包括重复性、中间精密度）、专属性、适用性和线性。
在申报资料中常见的错误有：线性测定不符合抗生素微生物检定法一剂量中心浓度等比测定的原理；精密度的测定方法不正确；无专属性试验。
抗生素微生物检定法
抗生素微生物检定法来源：中国药典2000年版二部附录2006-12-10 00:30标题抗生素微生物检定法附录序号附录Ⅺ内容全文A. 抗生素微生物检定法本法系利用抗生素在琼脂培养基内的扩散作用，采用量反应平行线原理的设计，比较标准品与供试品两者对接种的试验菌产生抑菌圈的大小，以测定供试品效价的一种方法。
标准品的品种、分子式及理论计算值见表2。
培养基及其制备方法培养基Ｉ胨5g琼脂15～20g牛肉浸出粉3g水1000ml磷酸氢二钾3g除琼脂外，混合上述成分，调节pH使比最终的pH值略高0.2～0.4，加入琼脂，加热溶化后滤过，调节pH值使灭菌后为7.8～8.0或6.5～6.6，在115℃灭菌30分钟。
培养基Ⅱ胨6g葡萄糖1g牛肉浸出粉 1.5g琼脂15～20g酵母浸出粉6g水1000ml除琼脂和葡萄糖外，混合上述成分，调节pH使比最终的pH值略高0.2～0.4，加入琼脂，加热溶化后滤过,加葡萄糖溶解后,摇匀,调节pH值使灭菌后为7.8～8.0或6.5～6.6,在115℃灭菌30分钟。
培养基Ⅲ胨5g磷酸氢二钾 3.68g牛肉浸出粉 1.5g磷酸二氢钾 1.32g酵母浸出粉3g葡萄糖1g氯化钠 3.5g水1000ml除葡萄糖外，混合上述成分，加热溶化后滤过，加葡萄糖溶解后，摇匀，调节pH值使灭菌后为7.0～7.2，在115℃灭菌30分钟。
培养基Ⅳ胨10g葡萄糖10g氯化钠10g琼脂20～30g枸橼酸钠10g水1000ml除琼脂和葡萄糖外，混合上述成分，调节pH使比最终的pH值略高0.2～0.4，加入琼脂，在109℃加热15分钟，于70℃以上保温静置1小时后滤过，加葡萄糖溶解后，摇匀，调节pH值使灭菌后为6.0～6.2，在115℃灭菌30分钟。
培养基Ⅴ胨10g琼脂15～20g麦芽糖40g水1000ml除琼脂和麦芽糖外，混合上述成分，调节pH使比最终的pH值略高0.2～0.4，加入琼脂，加热溶化后滤过，加麦芽糖溶解后，摇匀，调节pH值使灭菌后为7.2～7.4，按需要分装，在115℃灭菌30分钟，趁热斜放使凝固成斜面。
抗生素效价测定技术—抗生素效价微生物检定法
知识点3：浊度法
四、检定操作方法
（一）线性试验
除另有规定外，取适宜的大小厚度均匀的已灭菌试管，在各试验
管内精密加入含试验菌的液体培养基9. 0ml，再分别精密加入各浓
度的标准品溶液1.0ml，立即混匀，按随机区组分配将各管在规定
条件下培养至适宜测量的浊度值（通常约为4小时）。
知识点3：浊度法
（三）空白试验
线关系，可采用t检验。
4．测定结果的计算及可信限率估计。
5．实验计算所得效价低于估计效价的90%或高于估计效价的1 10%，则检验
结果仅作为初试，应调整供试品估计效价，予以重试。
知识点3：浊度法
6．原料药效价测定一般需双份样品，平行实验以便核对。对不符
合规定的样品应至少有2次符合规定的结果，才能发出报告。
供试品低剂量溶液
（即SH→TH→SL→TL）
6.测量抑菌圈 双碟透明度好，无破损和不透明现象；抑菌圈应圆满，无破
圈或圈不完整现象，否则应弃去该双碟。
技能点1：二剂量法操作规程
技能点1：二剂量法操作规程
技能点1：二剂量法操作规程
在恒温培养箱中培养至规定时间
技能点1：二剂量法操作规程
• 测量抑制圈
的污染，放双碟的台面应用水平仪调水平。
玻璃/塑料
平皿(d=90mm
h=16-17mm)
菌层
5ml
含菌培养基
底层
20ml
灭菌培养基
技能点1：二剂量法操作规程
制备底层
制备菌层
技能点1：二剂量法操作规程
4.放置钢管
5.滴碟、培养
毛细滴管（或滴管）滴碟
滴加顺序：按标准品高剂量溶液→供试品高剂量溶液→标准品低剂量溶液→
抗生素微生物检定法
2020版药典抗生素微生物检定法本法系在适宜条件下，根据量反应平行线原理设计，通过检测抗生素对微生物的抑制作用，计算抗生素活性（效价）的方法。
抗生素微生物检定包括两种方法，即管碟法和浊度法。
测定结果经计算所得的效价，如低于估计效价的90%或高于估计效价的110%时，应调整其估计效价，重新试验。
除另有规定外，本法的可信限率不得大于5%。
第一法管碟法本法系利用抗生素在琼脂培养基内的扩散作用，比较标准品与供试品两者对接种的试验菌产生抑菌圈的大小，以测定供试品效价的一种方法。
菌悬液的制备枯草芽泡杆菌（Bacillus subtilis）悬液取枯草芽抱杆菌〔CMCC（B）63 501〕的营养琼脂斜面培养物，接种于盛有营养琼脂培养基的培养瓶中，在35～37℃培养7日，用革兰染色法涂片镜检，应有芽孢85%以上。
用灭菌水将芽孢洗下，在65℃加热30分钟，备用。
短小芽抱杆菌（Bacillus pumilus）悬液取短小芽砲杆菌〔CMCC（B）63 202〕的营养琼脂斜面培养物，照上述方法制备。
金黄色葡萄球菌（Szaphylococcus aureus）悬液取金黄色葡萄球菌〔CMCC（B）26 003〕或〔ATCC29 213〕的营养琼脂斜面培养物，接种于营养琼脂斜面上，在35～37℃培养20～22小时。
临用时，用灭菌水或0.9%灭菌氯化钠溶液将菌苔洗下，备用。
藤黄微球菌（Micrococcus luteus）悬液取藤黄微球菌〔CMCC（B）28 001〕的营养琼脂斜面培养物，接种于盛有营养琼脂培养基的培养瓶中，在26～27℃培养24小时，或采用适当方法制备的菌斜面，用培养基Ⅲ或0.9%灭菌氯化钠溶液将菌苔洗下，备用。
大肠埃希菌（Escherichia coli）悬液取大肠埃希菌〔CMCC（B）44 103〕的营养琼脂斜面培养物，接种于营养琼脂斜面上，在35～37℃培养20～22小时。
临用时，用灭菌水将菌苔洗下，备用。
抗生素微生物检定法
抗生素微生物检定法一、目的：阐述抗生素微生物的检定法。
二、适用范围：适用于抗生素微生物检定法。
三、责任者：品控部。
四、正文：1 简述抗生素微生物检定法，依试验设计原理不同，可分为稀释法、比浊法和琼脂扩散法。
后二者被列为抗生素微生物检定的国际通用方法。
中国兽药典采用管碟琼脂扩散法。
抗生素管碟检定法是利用抗生素在摊布特定试验菌的固体培养基内球面形扩散，形成含一定浓度抗生素球形区，抑制了试验菌的繁殖而呈现出透明的抑菌圈。
此法系根据抗生素在一定浓度范围内，对数剂量与抑菌圈直径（面积）呈线性关系，通过比较标准品与供试品产生抑菌圈的大小，计算出供试品的效价。
抗生素效价以“单位（u）”或“微克（ug）”表示。
2 仪器与用具2.1 操作室光线明亮，操作室应分为两部分，彼此分开；一部分为一般操作间，一部分为半无菌操作间。
半无菌操作间，设有紫外线灯达到空气消毒。
应装有空调设备，控制室温在20-25℃。
操作台可用稳固的水泥台，台面用玻璃板垫平，用水平仪校准，保持水平。
室内注意抗生素的污染。
2.2 双碟为硬质玻璃或塑料培养平皿，内径约90mm,高16-17mm,碟底厚薄均匀水平,无气泡.碟底平度检查,可将双碟放在水平台上,下垫一张白纸,碟内加2-3ml,再滴加蓝墨水,观察蓝色深汪是否一致.用过的双碟经高压灭菌倒出培养基后,置玻璃仪器专用洗液或其他清洗液中浸泡过夜,冲洗,沥干,置150-160℃干热灭菌2小时或高压121℃蒸气灭菌30分钟，备用。
2.3 陶瓦盖内径约为103mm，外径108 mm，平坦，吸水性强，应定期干燥、清洗。
2.4 钢管内径（6.0±0.1）mm,高(10.0±0.1) mm，外径（8.0±0.1）或（7.8±0.1）mm，每套钢管重量差异不超过±0.05g，内外壁及两端面光洁平坦，管壁厚薄一致。
每次使用后应置1：1000新洁尔灭溶液内，浸泡2小时以上，进行灭菌后再行洗涤，先用水洗涤，超声波超声30分钟或用沾有去污粉的纱布条擦内外壁，用水冲洗，淋干，再用蒸馏水冲洗3次后，置带盖的溶器内，在150-160℃干热灭菌2小时备用。
抗生素微生物检定法.ppt
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抗生素微生物检定法--------2017 1 简述抗生素微生物检定法系在适宜条件下，通过检测抗生素对微生物的抑制作用，计算抗生素活性（效价）的方法。
依试验设计原理不同，可分为稀释法、比浊法和琼脂扩散法。
后二者被列为抗生素微生物检定的国际通用方法。
《中国药典》也采用这两种方法。
抗生素微生物检定管碟测定法系琼脂扩散法，是利用抗生素在摊布特定试验菌的固体培养基内成球面形扩散，形成含一定浓度抗生素球形区，抑制了试验菌的繁殖而呈现出透明的抑菌圈。
此法系根据抗生素在一定浓度范围内，对数剂量与抑菌圈直径（面积）呈直线关系而设计，通过检测抗生素对微生物的抑制作用，比较标准品与供试品产生抑菌圈的大小，计算出供试品的效价。
抗生素微生物比浊法是将一定量的抗生素加至接种有试验菌的液体培养基内，混匀后，经培养，测量培养基的浊度。
此法系根据抗生素在一定的浓度范围内，其浓度或浓度的数学转换值与试验菌生长产生的浊度(浊度与细菌数量、细菌群体质量及细菌细胞容积的增加之间存在直接关系)之间存在线性关系而设计，通过测定培养后细菌浊度值的大小，比较标准品与供试品对试验菌生长抑制的程度，计算出供试品的效价。
抗生素效价以“单位(u)”或“微克(µg)”表示。
抗生素管碟测定法2 仪器与用具2.1 操作室光线明亮，操作室应分为两部分，彼此分开，其中一部分为一般操作室，一部分为半无菌操作室。
半无菌操作室应设有紫外线灭菌灯，并附设空气净化（空气净化级别为100级~10000级）及空调设备，控制室温在20~25℃之间，达到无菌或半无菌状态。
操作台应稳固，台面用玻璃板，并用水平仪调节至水平。
注意操作，避免室内抗生素污染。
2.2 双碟内径约90mm , 高16~17mm硬质玻璃或塑料培养平皿，碟底厚薄均匀，水平透明，无色斑气泡。
碟底平度检查，可将双碟放在水平台上，下垫一张白纸，碟内加水2~3m1，再滴加蓝墨水，观察蓝色深浅是否一致。
用过的双碟经高压灭菌倒出培养基后，置清洗液中浸泡过夜，冲洗，沥干，置150℃~160℃干热灭菌2h或高压121℃蒸气灭菌30min，备用。
2.3 陶瓦盖内径约103mm，外径108mm，平坦，吸水性强，应定期清洗、干燥或干热灭菌。
2.4 钢管内径（6.0±0.1）mm，高（10.0±0.1）mm；外径（8.0±0.1）mm 或（7.8±0.1）mm，每套钢管重量差异不超过±0.05g，内外壁及两端面光洁平坦，管壁厚薄一致。
每次使用后应置1:1000新洁尔灭溶液内，浸泡2h以上，灭菌后再洗涤，先用水洗涤，超声波超声30min或用沾有去污粉的纱布条串擦内外壁，水冲洗，沥干，再用蒸馏水冲洗3次后，置带盖的容器内，在150℃~160℃干热灭菌2h，备用。
2.5 钢管放置器有6孔和4孔两种。
放置于无菌或半无菌室的操作平台上，钢管下落时应垂直平稳、位置正确。
双碟升降平稳。
应保持清洁，防止抗生素污染。
可定期用75%乙醇棉擦拭落管筒及储管杯。
置钢管的玻璃管应定期干烤灭菌。
2.6 恒温培养箱以隔水式为宜，温度平稳，波动小。
设置漂移温度为35~37℃或24~26℃，依各品种要求而定，箱内网状隔板上放置带孔的玻璃板并调整水平。
2.7 灭菌刻度吸管用于吸取菌液及培养基。
使用后应立即置5%石炭酸或1:1000新洁尔灭溶液中消毒后，再按玻璃容器的常规洗涤法洗涤。
洗涤沥干后在吸口处塞入脱脂棉（松动，透气），置适宜容器中，在120℃以上干热灭菌2h或121℃蒸气灭菌30min，烘干备用。
2.8 玻璃容器包括定量移液管、刻度吸管、容量瓶等，均应符合“常用玻璃量器国家计量检定规程”的规定。
每次使用前用清洁液浸泡，水冲洗，并用蒸馏水或去离子水冲洗3次，沥干。
2.9 称量瓶重量在10g以下。
用毕先用水冲洗、沥干，置清洁液浸泡2h以上，然后分别用水、蒸馏水或去离子水冲洗3次，置洁净平皿中，在120℃干热灭菌作业指导书指导书编号TYFDC-SOP-FF-065抗生素微生物检定法第3页共14页第二版批准李忠华初审吴雅凝起草郭欣3h，待冷至60~70℃时，取出置于干燥器中备用。
2.10 滴管用玻璃管拉制，管口光滑。
使用前在清洁液浸泡，分别用水、蒸馏水或去离子水冲洗3次，置适宜容器中，在120℃干燥3h后备用。
2.11 天平分析天平，精密度0.1mg，经计量检定。
2.12 抑菌圈直径（面积）测量仪应符合“抑菌圈测量仪检定规程”的规定。
2.13 游标卡尺精度0.05mm，长度125mm 。
2.14 超净工作台有效工作面局部洁净度100级。
用于试验菌的接种传代或菌悬液制备。
超净工作台须置洁净工作室或半无菌室内。
3 试液3.1 灭菌缓冲液制备缓冲液的试剂应为分析纯，配制后的缓冲液应澄明，分装于玻璃容器内，经121℃蒸气灭菌30min备用。
3.2 磷酸盐缓冲液（pH5.6）取磷酸二氢钾9.07g，加水使成1000ml，用1mol/L 氢氧化钠溶液调节pH值至5.6，滤过，在115℃灭菌30min。
3.3 磷酸盐缓冲液（pH6.0）取磷酸氢二钾2g与磷酸二氢钾8g，加水使成1000ml，滤过。
3.4 磷酸盐缓冲液（pH7.0) 取磷酸氢二钠（Na2.HPO4·l2H2O）9.39g与磷酸二氢钾3.59g ，加水使成1000m1，滤过。
3.5 磷酸盐缓冲液（pH7.8）取磷酸氢二钾5.59g与磷酸二氢钾0.41g，加水使成1000ml ，滤过。
3.6 磷酸盐缓冲液（pH10.5）取磷酸氢二钾35g，加氢氧化钾液（10moI/L）2mI，加水使成1000ml ，滤过。
4 培养基配制培养基的各成分原料质量对抑菌圈边缘清晰度及试验结果影响较大，因此应对原材料进行预试验，挑选适当的品牌使用。
制成的培养基不应有沉淀，如产生沉淀，可在配制培养基后，于115℃加热20min溶化，趁热用纸浆减压或适宜方法过滤，调整pH值，分装灭菌备用。
《中国药典》2015年版四部通则1201的抗生素微生物检定法中收载了13种不同处方的培养基及制备方法。
目前，已有市售干燥培养基，使用方便。
临用时按照使用说明进行配制，但应注意核对培养基的pH，必要时需调节pH，使其符合规定。
另外，市售干燥培养基的质量也存在差异，注意选择合适的产品。
5 试验菌5.1 菌种的复苏检定用标准菌种为冷冻干燥品，由中国药品生物制品检定所提供。
5.1.1 取冻干菌种管、灭菌1m1毛细滴管、双碟、镊子、营养肉汤培养基、营养琼脂斜面，移入接种室操作台或超净工作台。
5.1.2 将冻干菌种管外壁用碘酒（碘伏）擦拭消毒，稍干，用75%乙醇棉球擦净，放在灭菌双碟内，待干。
点燃酒精灯，将菌种管的封口一端在火焰上烧灼红热，用灭菌毛细滴管吸取营养肉汤培养基，滴在上述灼热的菌种管封口端，使其骤冷炸裂。
5.1.3 取灭菌镊子，在酒精灯火焰上方，将炸裂的管口打开，放人灭菌双碟内，另取1支灭菌毛细滴管，在火焰旁吸取营养肉汤少许，加至菌种管底部，将冻干菌块搅动使其溶解，随即吸出管内菌液，分别接种至营养琼脂斜面及普通肉汤内，并将毛细滴管及菌种管投人消毒液内，将已接种的营养肉汤及营养琼脂斜面置35~37℃培养22~24h。
5.1.4 取出培养物，仔细观察菌苔形态、有无杂菌，涂片并进行革兰氏染色镜检，如呈典型菌落，则转种3代即可使用。
菌落不典型时，可进行平板分离单菌落。
5.2 菌种的接种与保存5.2.1 准备需用的培养基，培养基应新鲜制备，如斜面已无冷凝水者，不宜再使用。
在标签上注明菌名及接种日期。
从冷藏箱中取出菌种斜面后，应在室温放置约30分钟，待温度平衡后再移入接种室或超净工作台。
5.2.2 点燃酒精灯或煤气灯等，左手握住菌种斜面，将管口靠近火焰上方，右手拿接种棒后端，将接种环烧红约30s，随后将接种棒金属部分在火焰上烧灼，往返通过3次。
右手用无名指、小指及掌部夹住管塞，左手将管口在火焰上旋转烧灼，右手再轻轻拔开管塞，将接种环伸入管内先在近壁的琼脂斜面上靠一下，稍冷却再移至菌苔上，刮取少量菌苔，随即取出接种棒，并将菌种管口移至火焰上方。
塞上管塞，左手将菌种管放下，取营养琼脂斜面1支，照上述操作打开管塞，将接种环伸入管内至琼脂斜面的底部，由底向上，将接种环轻贴斜面的表面曲折蛇形移动，使细菌接种在斜面的表面上。
5.2.3 取出接种环，在火焰上方将培养基管盖上塞子，然后将接种过细菌的接种环在火焰上烧灼灭菌。
5.2.4 将已接种的细菌管置35~37℃培养22~24h，霉菌管一般置24~25℃霉菌培养箱内培养7天。
培养后放人4℃冷藏箱内保存，一般1~3个月转种一次。
5.3 菌悬液的制备5.3.1 枯草芽孢杆菌[Bacillus subtilis CMCC(B)63 501]悬液取枯草芽孢杆菌工作用菌种营养琼脂斜面培养物，加灭菌水1~2m1将菌苔洗下，制成悬液，用吸管将此悬液接种至盛有营养琼脂培养基的扁培养瓶内，均匀摊布，在35~37℃培养7天。
取菌苔少许涂片，革兰氏染色镜检，应有芽孢85%以上，用灭菌水10m1将芽孢洗下，制成芽孢悬液，合并至灭菌大试管内，在65℃水浴中加热30min 将菌体杀死，待冷后置4℃冷藏箱贮藏。
此菌液为浓菌液。
日常试验用菌液取上述浓菌液，用灭菌水1:3稀释至灭菌试管中，冷藏箱保存备用。
5.3.2 短小芽孢杆菌[Bacillus pumilus CMCC(B)63 202]悬液取短小芽孢杆菌工作用菌种营养琼脂斜面培养物，照上述方法制备芽孢悬液。
5.3.3 金黄色葡萄球菌[Staphylococcus aureus CMCC(B)26 003]悬液取金黄色葡萄球菌工作用菌种营养琼脂斜面培养物，用接种环取菌苔少许接种至营养琼脂斜面上，在35~37℃培养20~22h，临用时，用灭菌水将菌苔洗下，制成悬液。
置4℃冷藏箱保存，可使用3天。
5.3.4 藤黄微球菌[Micrococcus luteus CMCC(B)28 001]悬液取藤黄微球菌工作用菌种营养琼脂斜面培养物，用lml培养基Ⅲ将菌苔洗下，用吸管移至盛有营养琼脂培养基的扁培养瓶中，均匀摊布，将培养瓶倒置于培养箱中26~27℃培养24h取出，用吸管吸取培养基Ⅲ或0.9%灭菌氯化钠溶液5m1至培养瓶中，将菌苔洗下，合并菌液至灭菌大试管中备用。
置4℃冰箱中保存，可使用1~2个月。
5.3.5 大肠杆菌[Eschehchia coli CMCC(B)44 103]悬液取大肠杆菌工作用菌种营养琼脂斜面培养物，照金黄色葡萄球菌菌悬液项下的方法制备菌悬液，供当日使用。
5.3.6 肺炎克雷伯氏菌[Klebosiella pneumoniae CMCC(B)46 117]悬液取肺炎克雷伯氏菌工作用菌种营养琼脂斜面培养物，照金黄色葡萄球菌菌悬液项下的方法制备菌悬液，供当日使用。