毕赤酵母感受态制作及转化

毕赤酵母化学转化

毕赤酵母化学转化（化学转化）如果没有电转仪，LiCl转化是一种可供选择的方法，转化率是102到103cfu/ug。

主要过程为：取过夜活化培养的菌液按1：1000接种于15ml新鲜的YPD液体培养基，30℃培养至OD600达到0.8-1.0；4℃，4500rpm离心5分钟，用8ml冰预冷的无菌水洗涤菌体，倾除洗涤液，用1mL ，4℃，4500rpm离心5分钟，沉淀用50μl冰预冷的100mmol/L LiCl悬浮，最后定容至80-90ml。

LiCl转化取适量单链鲑精DNA（2mg/mL）煮沸5min，立即置于冰上备用，取上述制备好的感受态细胞12000rpm，离心15s，吸弃LiCl溶液，按顺序依次加入50%PEG 240ml1mmol/L LiCl 36 ml单链鲑精DNA 25ml线性化质粒DNA 10 ml (约10mg)用吸头反复吹打，使细胞沉淀与加入的溶液混匀，30℃静置温育30min，42℃热击20-25min，4500rpm离心10min，吸弃转化液，细胞沉淀加1mlYPD培养基于30℃200 rpm培养2-4hr，取转化混合液100ml 涂布含100μg/mL ZeocinTM的YPDS平板，30℃培养2-3天。

LiCl 转化方法作为电转化的替代方法，在线性化DNA条件下，转化效率介于102~103cfu/ug 之间溶液：1M LiCl 用无离子水溶解，过滤除菌。

（稀释使用无菌水。

）50% PEG 3350 无离子水溶解，过滤除菌，密封保存2mg/ml变性的鲑精DNA片段（10mM Tris-HCl，pH 8.0,10mM EDTA）-20℃保存。

准备感受态细胞：1.在50ml YPD中，培养至OD600 在0.8~1.0之间（大约108个/ml）。

2.收集细胞，用25ml无菌水洗涤，1500g室温离心10min。

3.重悬细胞于1ml 体积的100mMLiCl中，将悬液转移至1.5ml离心管中。

毕赤酵母实验操作手册

毕赤酵母表达实验手册大肠杆菌表达系统最突出的优点是工艺简单、产量高、生产成本低。

然而，许多蛋白质在翻译的修饰加工，如磷酸化、糖基化、酰胺化及蛋白酶水解等过程才能转化成活性形式。

大肠杆菌缺少适合用于表达结构复杂的蛋白质。

另外，蛋白质的活性还依赖于形成正确的二硫键并折叠成高级结表达的蛋白质往往不能进行正确的折叠，是以包含体状态存在。

包含体的形成虽然简化了产物的纯的活性，为了得到有活性的蛋白，就需要进行变性溶解及复性等操作，这一过程比较繁琐，同时增与大肠杆菌相比，酵母是低等真核生物，具有细胞生长快，易于培养，遗传操作简单等原核生物的生物时表达的蛋白质进行正确加工，修饰，合理的空间折叠等功能，非常有利于真核基因的表达，菌系统缺乏蛋白翻泽后加工、修饰的不足。

因此酵母表达系统受到越来越多的重视和利用。

大肠杆菌是用得最多、研究最成熟的基因工程表达系统，当前已商业化的基因工程产品大多是通过其主要优点是成本低、产量高、易于操作。

但大肠杆菌是原核生物，不具有真核生物的基因表达调加工修饰能力，其产物往住形成没有活性的包涵体，需要经过变性、复性等处理，才能应用。

近年程菌表达外源蛋白日益引起重视，主更是因为酵母是单细胞真核生物，不但具有大肠杆菌易操作、化生产的特点，还具有真核生物表达系统基因表达调控和蛋白修饰功能，避免了产物活性低，包涵间题［1］。

与大肠杆菌相比，酵母是单细胞真核生物，具有比较完备的基因表达调控机制和对表达产物的们对酿酒酵母（Saccharomyces.Cerevisiae）分子遗传学方面的认识最早，酿酒酵母也最先作为外宿主．1981年酿酒酵母表达了第一个外源基因一干扰素基因，随后又有一系列外源基因在该系统得素和胰岛素已大量生产并在人群中广泛应用，但很大部分表达由实验室扩展到工业规模时，培养基数的选择压力消失，质粒变得不稳定，拷贝数下降，而大多数外源基因的高效表达需要高拷贝数的量下降。

同时，实验室用培养基复杂而昂贵，采用工业规模能够接受的培养基时，往往导致产量的酵母的局限，人们发展了以甲基营养型酵母（methylotrophic yeast）为代表的第二代酵母表达系甲基营养型酵母包括：Pichia、Candida等．以Pichia.pastoris（毕赤巴斯德酵母）为宿主的外源来发展最为迅速，应用也最为广泛，已利用此系统表达了一系列有重要生物学活性的蛋自质。

酵母感受态的制备(化学法)

1、毕氏酵母氯化锂转化法（1）试剂1M LiCl（用去离子蒸馏水配制，滤膜过滤除菌；必要时用消毒去离子水稀释）50% PEG3350（Sigma P3640 用去离子蒸馏水配制，滤膜过滤除菌，用较紧的盖子的瓶子分装）2mg/ml salmon sperm DNA / TE（10mM Tris-Cl, pH8.0, 1.0mM EDTA）-20℃保存注：醋酸锂对毕氏酵母无效，仅氯化锂有效；PEG3350可屏蔽高浓度LiCl的毒害作用；（2）感受态毕氏酵母的制备接种Pachia pastoris到50ml YPD培养基中，30℃摇菌过夜（约24～28h）培养到OD值为0.8～1.0（约108 Cells/ml）；收获细胞，用25ml无菌水洗涤一次，室温下1500g离心10min；重悬细胞于1ml 100mM LiCl溶液中，将悬液转入1.5ml离心管；离心机最大速度离心15秒沉淀菌体，重悬菌体于400ul 100mM LiCl溶液中；按50ul/管分装，立即进行转化；注：不要将感受态酵母菌冰浴；（3）毕氏酵母的转化煮沸1ml鲑鱼精DNA 5min，迅速冰浴以制备单链担体DNA；将感受态酵母菌离心，以Tips去除残余的LiCl溶液；对于每一个转化，按以下顺序加入：50% PEG3350 240ul1M LiCl 36ul2mg/ml 单链Salmon sperm DNA 25ul5～10ug/50ul H2O 质粒DNA 50ul剧烈旋涡混匀直至沉淀菌体完全分布均匀（约1min）；30℃水浴孵育30min；42℃水浴热休克20～25min;6000～8000rpm离心收集酵母菌体；重悬酵母于1ml YPD培养基，30℃摇床孵育；1～4h后，取25～100ul菌液铺选择性培养基平板，于30℃培养2～3天鉴定；2、毕氏酵母PEG1000转化法（1）试剂缓冲液A：1.0M Sorbitol，10mM Bicine，pH8.35（sigma）,3%（v/v）ethylene gl ycol缓冲液B：40%（w/v）PEG1000（sigma），0.2M Bicine，pH8.35缓冲液C：0.15M NaCl，10mM Bicine，pH8.35未污染的新鲜、试剂级DMSO，-70℃保存注：缓冲液A、B、C均用滤膜过滤，-20℃保存;将DNA直接加在冻结的酵母细胞上是本实验的关键之处（即使在冰上解冻的待转化细胞，其摄取外源DNA的能力也在解冻过程中迅速下降；如进行多样品的转化，建议按6样品/组进行）;（2）待转化毕氏酵母的制备接种环接种Pachia pastoris于YPD平板，30℃培养2d;挑取单克隆酵母菌株于10mlYPD培养基中，30℃振荡培养过夜；取步骤2中小量菌液接种到100mlYPD培养基中振荡培养，待其OD值从0.1升到0. 5～0.8；室温下3000g离心收集酵母菌体，50ml缓冲液A洗涤一次；重悬菌体于4ml缓冲液A中，按0.2ml/管分装于1.5ml的离心管中，每管加入11ulD MSO，混合后迅速于液氮中冷冻，-70℃保存（3）毕氏酵母的转化将约50ug线性化质粒DNA溶于20ul TE或水中，直接加于冻结的酵母细胞中；加入担体DNA（40ug变性超声线性化鲑鱼精DNA）以获得最大转化率；37℃水浴孵育5min，中间混合样品1～2次；取出离心管，加入1.5ml缓冲液B，彻底混匀；30℃水浴孵育1h；室温下2000g离心10min，去除上清液，菌体沉淀重悬于1.5ml缓冲液C中；离心样品，去除上清液，轻微操作将样品重悬于0.2ml缓冲液C中；将所有转化液铺于选择性平板，于30℃孵育3～4天后，鉴定；3、毕氏酵母电转化法（1）E.coli TOP10F’感受态细胞的制备取10ul TOP10F’菌液，接种于200ml LB液体培养基中活化培养，37℃，200 rpm，16～18小时。

毕赤酵母实验操作手册

精心整理毕赤酵母表达实验手册大肠杆菌表达系统最突出的优点是工艺简单、产量高、生产成本低。

然而，许多蛋白质在翻译后，需经过翻译后的修饰加工，如磷酸化、糖基化、酰胺化及蛋白酶水解等过程才能转化成活性形式。

大肠杆菌缺少上述加工机制，不适合用于表达结构复杂的蛋白质。

另外，蛋白质的活性还依赖于形成正确的二硫键并折叠成高级核生物表达系统基因表达调控和蛋白修饰功能，避免了产物活性低，包涵体变性、复性等等间题［1］。

与大肠杆菌相比，酵母是单细胞真核生物，具有比较完备的基因表达调控机制和对表达产物的加工修饰能力，人们对酿酒酵母（Saccharomyces.Cerevisiae）分子遗传学方面的认识最早，酿酒酵母也最先作为外源基因表达的酵母宿主．1981年酿酒酵母表达了第一个外源基因一干扰素基因，随后又有一系列外源基因在该系统得到表达。

虽然干扰素和胰岛素已大量生产并在人群中广泛应用，但很大部分表达由实验室扩展到工业规模时，培养基中维特质粒高拷贝数的选择压力消失，质粒变得不稳定，拷贝数下降，而大多数外源基因的高效表达需要高拷贝数的维特，因此引起产量下降。

同时，实验室用培养基复杂而昂贵，采用工业规模能够接受的培养母（一。

⑷毕赤酵母中存在过氧化物酶体，表达的蛋白贮存其中，可免受蛋白酶的降解，而且减少对细胞的毒害作用。

Pichia.pastoris基因表达系统经过近十年发展，已基本成为较完善的外源基因表达系统，具有易于高密度发酵，表达基因稳定整合在宿主基因组中，能使产物有效分泌并适当糖基化，培养方便经济等特点。

利用强效可调控启动子AOX1，已高效表达了HBsAg、TNF、EGF、破伤风毒素C片段、基因工程抗体等多种外源基因，证实该系统为高效、实用、简便，以提高表达量并保持产物生物学活性为突出特征的外源基因表达系统，而且非常适宜子扩大为工业规模［4］。

目前美国FDA已能评价来自该系统的基因工程产品，最近来自该系统的Cephelon制剂已获得FDA批准，所以该系统被认为是安全的．Pichia.pastoris表达系统在生物工程领域将发挥越有中，需带有信号肽序列。

毕赤酵母电转化方法及转化子的筛选

毕赤酵母电转化方法及转化子的筛选毕赤酵母电转化方法及转化子的筛选菌体的准备：1. 挑取酵母单菌落，接种至含有5ml YPD 培养基的50ml 三角瓶中，30℃、250-300r/min 培养过夜；2. 取100-500μl （≤1:100）的培养物接种至含有50ml 新鲜培养基的200mL三角摇瓶中，28~30℃、250-300r/min培养过夜(约20h)，至OD600 达到1.3~1.5；3. 将细胞培养物于4℃，1500g 离心5min，用50ml 的冰预冷的无菌水将菌体沉淀重悬；4. 按步骤3 离心，用25ml的冰预冷的无菌水将菌体沉淀重悬5. 按步骤3 离心，用2-5ml，1M的冰预冷山梨醇溶液将菌体沉淀重悬；6. 按步骤3 离心，用160μl的冰预冷的1mol的山梨醇溶液将菌体沉淀重悬，其终体积约为240 ul；备注：可将其分装为80 μl 一份的包装-70冷冻起来，2周之内使用，但会影响其转化效率。

比如常见的pPIC9K的载体转GS115一般先用MD平板初筛，然后长出的克隆子可以挑到不同浓度的含G418抗性的YPD平板上筛选高拷贝。

对正确筛选出的单菌落接YPD小瓶摇活后，转大瓶BMGY摇瓶发酵。

一般对于甲醇诱导菌株，摇瓶一天左右后开始补加甲醇，就类似BMMY的功能了。

KM71比GS115生长的要慢。

毕赤酵母都应该是白色菌落的对于LOX家族蛋白的表达，可尝试在酵母培养基中加入Cu2+ 离子，提高表达量和蛋白活性?菌种保存：挑单克隆到YPD中培养18-24h,然后取菌液以1:1加入30%灭菌甘油， -80o C ul/管冻存（一般用10ug以上质粒用SalI酶切，然后直接加乙醇沉淀，70％乙醇洗一遍，约20ul ddH2O 重溶。

转化效率一般大于100个克隆每ugDNA。

建议你不要用胶回收kit，回收的DNA可能还有盐，导致电击时放电时间很短。

乙醇沉淀主要步骤如下：1）酶切体系（80ul）中2倍体积的无水乙醇加1/10体积的PH5.2 NaAC，混匀2)-20℃20分钟沉淀3)13200rpm，20min，离心后弃上清4)75%乙醇300ul轻轻洗，同上离心5min，弃上清5)37 度烘箱至无乙醇气味（或是用摇床的出风口吹出的暖风吹）。

毕氏酵母(Pichia_pastoris)感受态细胞制备及转化

毕氏酵母（Pichia pastoris）感受态细胞制备及转化1、毕氏酵母氯化锂转化法（1）试剂1M LiCl（用去离子蒸馏水配制，滤膜过滤除菌；必要时用消毒去离子水稀释）50% PEG3350（Sigma P3640 用去离子蒸馏水配制，滤膜过滤除菌，用较紧的盖子的瓶子分装）2mg/ml salmon sperm DNA / TE（10mM Tris-Cl, pH8.0, 1.0mM EDTA）-20℃保存注：醋酸锂对毕氏酵母无效，仅氯化锂有效；PEG3350可屏蔽高浓度LiCl的毒害作用；（2）感受态毕氏酵母的制备接种Pachia pastoris到50ml YPD培养基中，30℃摇菌过夜（约24～28h）培养到OD 值为0.8～1.0（约108 Cells/ml）；收获细胞，用25ml无菌水洗涤一次，室温下1500g离心10min；重悬细胞于1ml 100mM LiCl溶液中，将悬液转入1.5ml离心管；离心机最大速度离心15秒沉淀菌体，重悬菌体于400ul 100mM LiCl溶液中；按50ul/管分装，立即进行转化；注：不要将感受态酵母菌冰浴；（3）毕氏酵母的转化煮沸1ml鲑鱼精DNA 5min，迅速冰浴以制备单链担体DNA；将感受态酵母菌离心，以Tips去除残余的LiCl溶液；对于每一个转化，按以下顺序加入：50% PEG3350 240ul1M LiCl 36ul2mg/ml 单链Salmon sperm DNA 25ul5～10ug/50ul H2O 质粒DNA 50ul剧烈旋涡混匀直至沉淀菌体完全分布均匀（约1min）；30℃水浴孵育30min；42℃水浴热休克20～25min;6000～8000rpm离心收集酵母菌体；重悬酵母于1ml YPD培养基，30℃摇床孵育；1～4h后，取25～100ul菌液铺选择性培养基平板，于30℃培养2～3天鉴定；2、毕氏酵母PEG1000转化法（1）试剂缓冲液A：1.0M Sorbitol，10mM Bicine，pH8.35（sigma）,3%（v/v）ethylene glycol 缓冲液B：40%（w/v）PEG1000（sigma），0.2M Bicine，pH8.35缓冲液C：0.15M NaCl，10mM Bicine，pH8.35未污染的新鲜、试剂级DMSO，-70℃保存注：缓冲液A、B、C均用滤膜过滤，-20℃保存;将DNA直接加在冻结的酵母细胞上是本实验的关键之处（即使在冰上解冻的待转化细胞，其摄取外源DNA的能力也在解冻过程中迅速下降；如进行多样品的转化，建议按6样品/组进行）;（2）待转化毕氏酵母的制备接种环接种Pachia pastoris于YPD平板，30℃培养2d;挑取单克隆酵母菌株于10mlYPD培养基中，30℃振荡培养过夜；取步骤2中小量菌液接种到100mlYPD培养基中振荡培养，待其OD值从0.1升到0.5～0.8；室温下3000g离心收集酵母菌体，50ml缓冲液A洗涤一次；重悬菌体于4ml缓冲液A中，按0.2ml/管分装于1.5ml的离心管中，每管加入11ulDMSO，混合后迅速于液氮中冷冻，-70℃保存（3）毕氏酵母的转化将约50ug线性化质粒DNA溶于20ul TE或水中，直接加于冻结的酵母细胞中；加入担体DNA（40ug变性超声线性化鲑鱼精DNA）以获得最大转化率；37℃水浴孵育5min，中间混合样品1～2次；取出离心管，加入1.5ml缓冲液B，彻底混匀；30℃水浴孵育1h；室温下2000g离心10min，去除上清液，菌体沉淀重悬于1.5ml缓冲液C中；离心样品，去除上清液，轻微操作将样品重悬于0.2ml缓冲液C中；将所有转化液铺于选择性平板，于30℃孵育3～4天后，鉴定；3、毕氏酵母电转化法（1）E.coli TOP10F’感受态细胞的制备取10ul TOP10F’菌液，接种于200ml LB液体培养基中活化培养，37℃，200 rpm，16～18小时。

毕赤酵母转化方案

毕赤酵母转化方案引言毕赤酵母（Baker’s Yeast）是一种常见的酵母菌，广泛用于食品加工和发酵过程中。

毕赤酵母可以将碳源转化为二氧化碳和乙醇，从而实现食品发酵和面团膨胀。

本文将介绍毕赤酵母的转化方案，包括酵母培养、酵母转化条件以及转化效果的评价。

酵母培养在进行毕赤酵母的转化实验之前，首先需要进行酵母的培养。

以下是酵母培养的步骤：1.将酵母菌存活液取出适量转移到含有酵母培养基的培养皿中。

2.用无菌棉签在培养皿上划线，以便观察酵母生长情况。

3.将培养皿封闭并置于恒温摇床中，在适当的温度下培养酵母。

酵母转化条件酵母的转化条件对于转化效果具有重要影响。

以下是常见的酵母转化条件：温度酵母转化的温度是一个重要的参数，常用的温度范围为25-40摄氏度。

不同温度下酵母的代谢和生长速率不同，因此选择合适的转化温度可以提高转化效率。

pH值pH值是影响酵母生长和代谢的另一个重要参数。

酵母转化的pH范围通常为4-7，在这个范围内酵母的生长和代谢能力较强。

溶氧量溶氧量是影响酵母转化效果的另一个因素。

较高的溶氧量可以促进酵母的生长和代谢，提高转化效率。

因此，在实验过程中应保证适当的氧气供应，通过搅拌或通气的方式提高溶氧量。

传质条件传质条件（如搅拌速度、传质面积等）也会对酵母转化效果产生影响。

适当的搅拌可以保证培养液中养分的均匀分布，提高转化效率。

同时，增加传质面积（如使用气泡或转子发酵罐）可以增加酵母与培养基之间的接触面积，促进转化反应进行。

转化效果评价转化效果通常通过酵母的生长情况、代谢产物的生成以及发酵过程的监测来进行评价。

1.酵母的生长情况可以通过观察培养液中的酵母颗粒的数量和大小以及液体的浑浊度来判断。

较好的转化效果应该能够促使酵母迅速生长和繁殖。

2.代谢产物的生成是评价转化效果的重要指标之一。

对于毕赤酵母来说，主要的代谢产物是二氧化碳和乙醇。

可以通过气体检测仪或化学分析方法来测定其生成量，以评估转化的效果。

毕赤酵母LiCl 转化方法

实验概要本文介绍了毕赤酵母LiCl 转化方法。

该程序是电转化的替代方法。

转化效率为102-103cfu/ug线性化DNA。

实验原理主要试剂溶液准备：不能用醋酸锂，一定要用氯化锂1. 用无菌去离子蒸馏水配制1M LiCl，过滤除菌，用无菌水稀释2. 用无菌去离子蒸馏水配制50%PEG(3350)，过滤除菌，存于盖紧的瓶中3. 用TE(10mM Tris-HCl pH8.0，1.0mM EDTA)溶解2mg/ml 变性断裂鲑鱼精DNA，存于-20度主要设备实验材料实验步骤1. 细胞准备：1) 在50mlYPD 中培养毕赤酵母至OD600＝0.8-1.0(约108个/ml)。

2) 收集细胞，用25ml灭菌水洗涤，室温1500g离心10min。

3) 去除水，用1ml 100mM LiCl 重悬细胞。

4) 将细胞悬液转至1.5ml 离心管中。

5) 最大转速沉淀细胞15s，用吸头吸去LiCl。

6) 在400ul 100mM LiCl中悬浮细胞。

7) 将50ul细胞悬浮液移到1.5ml离心管中，每次用一管，现做现用，不要置于冰上或-20度保存。

2. 转化：1) 煮沸单链DNA 5min，快速放于冰水中使变冷，后置于冰上。

注意：载体DNA不需要在每次用之前都煮，在-20 度保存等份少量样品，每次解冻一管，用3-4 次后再煮。

2) 取上面第7步中细胞，离心去除LiCl。

3) 每个转化样品，按顺序加入下列试剂，PEG 可保护细胞免受高浓度LiCl的有害作用240ul 50%PEG，36ul 1M LiCl，25ul 2mg/ml 单链DNA，溶解于50ul灭菌水中的质粒DNA(5-10ug)。

4) 剧烈涡旋细胞沉淀至完全混匀(1min)。

5) 在30 度孵育30min(不要摇动)。

6) 在42 度水浴热击20-25min。

7) 6000-8000rpm离心，将转化溶液转移走。

8) 用1ml 灭菌水重悬细胞沉淀。

毕赤酵母的电转化方法

Transformation of Pichia pastoris GS115毕赤酵母电转化方法电穿孔法简便、快速、高效，是理想的转化方法。

线性化质粒DNA对Pichia pastoris GS115的转化一、菌体的准备：（1）挑取酵母单菌落，接种至含有5ml YPD培养基的50ml三角瓶中，30℃、250~300r/min培养过夜；YPD培养基配方：注意高温灭菌的温度1 L培养基：900 mL水中加入10 g Yeast extract, 20 g peptone，20 g葡萄糖；定容至1L，在115o C条件下灭菌25 min；（2）取100~500μl的培养物接种至含有100ml新鲜培养基的250 mL三角摇瓶中，28~30℃、180 rpm培养过夜，至OD600达到1.3~1.5；（3）将细胞培养物于4℃，1500g离心5min，用20 mL的冰预冷的无菌水将菌体沉淀重悬；（4）按步骤3离心，用20 ml的冰预冷的无菌水将菌体沉淀重悬；（5）按步骤3离心，用20 ml的冰预冷的1 M的山梨醇溶液将菌体沉淀重悬；（6）按步骤3离心，用1ml的冰预冷的1M的山梨醇溶液将菌体沉淀重悬，其终体积约为1.5ml；（7）备注：可将其分装为80μl一份的包装冷冻起来，但会影响其转化效率（2周之内）。

二、电击转化：（8）将5~20μg的线性化DNA溶解在5~10 μl TE溶液(或灭菌ddH2O)中，加入5μl ssDNA (ssDNA需要在沸水中煮5 min变性，然后迅速转移到冰上，放置5 min 使之成为单链状态)，与80 μl的上述步骤6所得的感受态菌体混匀(轻弹混匀)，尽数吸出转移到0.2cm型的电穿孔转化杯中；（9）将电转化杯冰浴5min；（10）电击：电压1.5kV；电容25μF；电阻200－400Ω。

电击时间为10 msec。

（11）电击完毕后，加入1ml 4℃预冷的1M山梨醇溶液将菌体用枪头轻轻混匀，转至1.5ml的EP管中；（12）将菌体悬液涂布于MD平板上，如果菌液浓度高，可涂布两个平板；（13）将平板置于30℃培养，直至单个菌落出现，大约3－4天。

毕赤酵母实验操作手册

精心整理毕赤酵母表达实验手册大肠杆菌表达系统最突出的优点是工艺简单、产量高、生产成本低。

然而，许多蛋白质在翻译后，需经过翻译后的修饰加工，如磷酸化、糖基化、酰胺化及蛋白酶水解等过程才能转化成活性形式。

大肠杆菌缺少上述加工机制，不适合用于表达结构复杂的蛋白质。

另外，蛋白质的活性还依赖于形成正确的二硫键并折叠成高级核生物表达系统基因表达调控和蛋白修饰功能，避免了产物活性低，包涵体变性、复性等等间题［1］。

与大肠杆菌相比，酵母是单细胞真核生物，具有比较完备的基因表达调控机制和对表达产物的加工修饰能力，人们对酿酒酵母（Saccharomyces.Cerevisiae）分子遗传学方面的认识最早，酿酒酵母也最先作为外源基因表达的酵母宿主．1981年酿酒酵母表达了第一个外源基因一干扰素基因，随后又有一系列外源基因在该系统得到表达。

虽然干扰素和胰岛素已大量生产并在人群中广泛应用，但很大部分表达由实验室扩展到工业规模时，培养基中维特质粒高拷贝数的选择压力消失，质粒变得不稳定，拷贝数下降，而大多数外源基因的高效表达需要高拷贝数的维特，因此引起产量下降。

同时，实验室用培养基复杂而昂贵，采用工业规模能够接受的培养母（一。

⑷毕赤酵母中存在过氧化物酶体，表达的蛋白贮存其中，可免受蛋白酶的降解，而且减少对细胞的毒害作用。

Pichia.pastoris基因表达系统经过近十年发展，已基本成为较完善的外源基因表达系统，具有易于高密度发酵，表达基因稳定整合在宿主基因组中，能使产物有效分泌并适当糖基化，培养方便经济等特点。

利用强效可调控启动子AOX1，已高效表达了HBsAg、TNF、EGF、破伤风毒素C片段、基因工程抗体等多种外源基因，证实该系统为高效、实用、简便，以提高表达量并保持产物生物学活性为突出特征的外源基因表达系统，而且非常适宜子扩大为工业规模［4］。

目前美国FDA已能评价来自该系统的基因工程产品，最近来自该系统的Cephelon制剂已获得FDA批准，所以该系统被认为是安全的．Pichia.pastoris表达系统在生物工程领域将发挥越有中，需带有信号肽序列。

LiCl法转化毕赤酵母

LiCl法转化毕赤酵母感受态毕赤酵母的制备1. 接种Pichia pastoris到50 mL YPD培养基中，30 ℃摇菌过夜（约24～28h）培养到OD值为0.8～1.0（约108 Cells/ml）；培养基里有流沙样的菌体在流动2. 收获细胞，用25 mL无菌水洗涤一次，室温下5000 rpm离心10 min；3. 重悬细胞于1 mL 100 mM LiCl溶液中，将悬液转入1.5 mL离心管；4. 12000 rpm离心15 s沉淀菌体，重悬菌体于400 μL 100 mM LiCl溶液中；5. 按50 μL /管分装，立即进行转化；注：不要将感受态酵母菌冰浴；毕氏酵母的转化1.煮沸1ml鲑鱼精DNA 5min，迅速冰浴以制备单链担体DNA；鲑鱼精DNA主要是防止目的基因的降解，协助目的基因的转化2. 将感受态酵母菌离心，以Tips去除残余的LiCl溶液；3. 对于每一个转化，按以下顺序加入：50% PEG3350 240 μL1M LiCl 36 μL2mg/ml 单链Salmon sperm DNA 25 μL5～10 μg/50 μL H2O 质粒DNA 50 μL4. 剧烈旋涡混匀直至沉淀菌体完全分布均匀（约1min）；5. 30 ℃水浴孵育30 min；6. 42 ℃水浴热休克20～25 min;7. 8000rpm离心10 min，收集酵母菌体；8. 重悬酵母于500 μL YPD培养基，30℃摇床孵育；9. 1～4 h后，取25～100 μL菌液涂布于选择性培养基平板（YPD+Zeocin），于30 ℃培养2-5天鉴定；试剂1M LiCl <用去离子蒸馏水配制，0.22um滤膜过滤除菌；必要时用消毒去离子水稀释>50% PEG3350 < 用去离子蒸馏水配制，0.45um滤膜过滤除菌，用较紧的盖子的瓶子分装>(氯化锂转化法只能PEG3350,不能用PEG8000)2 mg/ml salmon sperm DNA / TE（10mM Tris-Cl, pH8.0, 1.0mM EDTA）-20℃保存注：醋酸锂对毕氏酵母无效,对酿酒酵母有效，仅氯化锂有效；PEG3350可屏蔽高浓度LiCl的毒害作用。

毕赤酵母感受态细胞制备

毕赤酵母感受态细胞制备
1.毕赤氏酵母GS115感受态细胞制备
(1)从YPD平板上挑取单菌落2~3个于含25mL YPD的250mL 三角瓶中，220r/min，30o C过夜（下午5点接，到第二天9点转接）;
(2)取1mL 过夜培养物，接种含50mL 新鲜培养基（YPD）的250mL 摇瓶（接种两瓶，共100mL培养液），生长至OD600~1.3-1.5(4h左右）；
(3)将100mL培养液分装于3个50mL离心管中，4o C，5000g 离心5min，用少许预冷的灭菌水悬浮细胞后并于1管中，加预冷的灭菌水至20mL；
(4)如上离心，用10mL 预冷的灭菌水悬浮细胞；
(5)如上离心，用10mL 预冷的1 mol/L山梨醇溶液悬浮细胞；
(6)如上离心，用0.5mL 预冷的1 mol/L山梨醇溶液悬浮细胞。

2.转化（电击转化）
(1)取80μL上述细胞与10μL 线性化DNA混合，转入预冷的0.2cm电转杯中；
(2)在冰上放置5min；
(3)根据所使用电转仪制造商推荐的酿酒酵母参数进行电击细胞（1.5KV，6ms）；
(4)立即加入0.9 mL 预冷的1 mol/L山梨醇溶液至杯中，将内容物转移至灭菌离心管中；
(5) 5000g离心5min，剩余200μL菌液吹吸重悬细胞，涂布1块MD平板；
(6)在30o C孵育平板至菌落明显形成（大约3~4天）。

毕赤酵母转化方法

毕赤酵母转化方法
毕赤酵母是一种微生物，也称为红曲霉，常用于酿造传统的中国米酒和黄酒，具有丰富的酶活性和营养价值。

主要包括培养、提取、纯化、保存等多个步骤。

首先是培养毕赤酵母。

毕赤酵母可在红曲粉、糖、脂肪等培养基上培养。

通常可以将毕赤酵母接种在含有适量营养成分的培养基上，设定适当的培养条件，如温度、pH值、
通气量等，培养一定时间后，毕赤酵母就会扩增繁殖。

提取毕赤酵母的方法有多种，一般是通过离心、过滤、溶剂提取等手段，从培养基中提取出毕赤酵母。

然后可以通过纯化的方法将提取的毕赤酵母进一步纯化，去除杂质，得到较为纯净的毕赤酵母。

为了保存毕赤酵母，可以通过冻干法、冻存法、罐装法等方式进行。

其中，冻干法是将提取的毕赤酵母在低温下冻干，去除水分后进行密封保存；冻存法是将毕赤酵母培养液直接以冷冻的方式保存；罐装法则是将毕赤酵母罐装封存，加入防腐保鲜剂，延长保存期限。

除了以上提到的基本方法外，还可以采用分子生物学技术、生物工程技术等现代方法对毕赤酵母进行改良和优化，提高其发酵性能和产酶能力。

如通过基因工程技术改良毕赤酵母菌株，使其更适合特定的酿造需求，提高其发酵产酶的效率和产量。

总的来说，毕赤酵母转化方法是一个综合的过程，需要在培养、提取、纯化、保存等环节中进行科学的操作和控制，以确保毕赤酵母的质量和产出效果。

随着科技的不断发展和进步，毕赤酵母的转化方法也将不断完善和提升，为酒类行业的发展做出更大的贡献。

毕赤酵母的电转化方法

Transformation of Pichia pastoris GS115毕赤酵母电转化方法电穿孔法简便、快速、高效，是理想的转化方法。

线性化质粒DNA对Pichia pastoris GS115的转化一、菌体的准备：（1）挑取酵母单菌落，接种至含有5ml YPD培养基的50ml三角瓶中，30℃、250~300r/min培养过夜；YPD培养基配方：注意高温灭菌的温度1 L培养基：900 mL水中加入10 g Yeast extract, 20 g peptone，20 g葡萄糖；定容至1L，在115o C条件下灭菌25 min；（2）取100~500μl的培养物接种至含有100ml新鲜培养基的250 mL三角摇瓶中，28~30℃、180 rpm培养过夜，至OD600达到1.3~1.5；（3）将细胞培养物于4℃，1500g离心5min，用20 mL的冰预冷的无菌水将菌体沉淀重悬；（4）按步骤3离心，用20 ml的冰预冷的无菌水将菌体沉淀重悬；（5）按步骤3离心，用20 ml的冰预冷的1 M的山梨醇溶液将菌体沉淀重悬；（6）按步骤3离心，用1ml的冰预冷的1M的山梨醇溶液将菌体沉淀重悬，其终体积约为1.5ml；（7）备注：可将其分装为80μl一份的包装冷冻起来，但会影响其转化效率（2周之内）。

二、电击转化：（8）将5~20μg的线性化DNA溶解在5~10 μl TE溶液(或灭菌ddH2O)中，加入5μl ssDNA (ssDNA需要在沸水中煮5 min变性，然后迅速转移到冰上，放置5 min 使之成为单链状态)，与80 μl的上述步骤6所得的感受态菌体混匀(轻弹混匀)，尽数吸出转移到0.2cm型的电穿孔转化杯中；（9）将电转化杯冰浴5min；（10）电击：电压1.5kV；电容25μF；电阻200－400Ω。

电击时间为10 msec。

（11）电击完毕后，加入1ml 4℃预冷的1M山梨醇溶液将菌体用枪头轻轻混匀，转至1.5ml的EP管中；（12）将菌体悬液涂布于MD平板上，如果菌液浓度高，可涂布两个平板；（13）将平板置于30℃培养，直至单个菌落出现，大约3－4天。

毕氏酵母(Pichia_pastoris)感受态细胞制备及转化 (1)

毕氏酵母（Pichia pastoris）感受态细胞制备及转化1、毕氏酵母氯化锂转化法（1）试剂1M LiCl（用去离子蒸馏水配制，滤膜过滤除菌；必要时用消毒去离子水稀释）50% PEG3350（Sigma P3640 用去离子蒸馏水配制，滤膜过滤除菌，用较紧的盖子的瓶子分装）2mg/ml salmon sperm DNA / TE（10mM Tris-Cl, pH8.0, 1.0mM EDTA）-20℃保存注：醋酸锂对毕氏酵母无效，仅氯化锂有效；PEG3350可屏蔽高浓度LiCl的毒害作用；（2）感受态毕氏酵母的制备接种Pachia pastoris到50ml YPD培养基中，30℃摇菌过夜（约24～28h）培养到OD 值为0.8～1.0（约108 Cells/ml）；收获细胞，用25ml无菌水洗涤一次，室温下1500g离心10min；重悬细胞于1ml 100mM LiCl溶液中，将悬液转入1.5ml离心管；离心机最大速度离心15秒沉淀菌体，重悬菌体于400ul 100mM LiCl溶液中；按50ul/管分装，立即进行转化；注：不要将感受态酵母菌冰浴；（3）毕氏酵母的转化煮沸1ml鲑鱼精DNA 5min，迅速冰浴以制备单链担体DNA；将感受态酵母菌离心，以Tips去除残余的LiCl溶液；对于每一个转化，按以下顺序加入：50% PEG3350 240ul1M LiCl 36ul2mg/ml 单链Salmon sperm DNA 25ul5～10ug/50ul H2O 质粒DNA 50ul剧烈旋涡混匀直至沉淀菌体完全分布均匀（约1min）；30℃水浴孵育30min；42℃水浴热休克20～25min;6000～8000rpm离心收集酵母菌体；重悬酵母于1ml YPD培养基，30℃摇床孵育；1～4h后，取25～100ul菌液铺选择性培养基平板，于30℃培养2～3天鉴定；2、毕氏酵母PEG1000转化法（1）试剂缓冲液A：1.0M Sorbitol，10mM Bicine，pH8.35（sigma）,3%（v/v）ethylene glycol 缓冲液B：40%（w/v）PEG1000（sigma），0.2M Bicine，pH8.35缓冲液C：0.15M NaCl，10mM Bicine，pH8.35未污染的新鲜、试剂级DMSO，-70℃保存注：缓冲液A、B、C均用滤膜过滤，-20℃保存;将DNA直接加在冻结的酵母细胞上是本实验的关键之处（即使在冰上解冻的待转化细胞，其摄取外源DNA的能力也在解冻过程中迅速下降；如进行多样品的转化，建议按6样品/组进行）;（2）待转化毕氏酵母的制备接种环接种Pachia pastoris于YPD平板，30℃培养2d;挑取单克隆酵母菌株于10mlYPD培养基中，30℃振荡培养过夜；取步骤2中小量菌液接种到100mlYPD培养基中振荡培养，待其OD值从0.1升到0.5～0.8；室温下3000g离心收集酵母菌体，50ml缓冲液A洗涤一次；重悬菌体于4ml缓冲液A中，按0.2ml/管分装于1.5ml的离心管中，每管加入11ulDMSO，混合后迅速于液氮中冷冻，-70℃保存（3）毕氏酵母的转化将约50ug线性化质粒DNA溶于20ul TE或水中，直接加于冻结的酵母细胞中；加入担体DNA（40ug变性超声线性化鲑鱼精DNA）以获得最大转化率；37℃水浴孵育5min，中间混合样品1～2次；取出离心管，加入1.5ml缓冲液B，彻底混匀；30℃水浴孵育1h；室温下2000g离心10min，去除上清液，菌体沉淀重悬于1.5ml缓冲液C中；离心样品，去除上清液，轻微操作将样品重悬于0.2ml缓冲液C中；将所有转化液铺于选择性平板，于30℃孵育3～4天后，鉴定；3、毕氏酵母电转化法（1）E.coli TOP10F’感受态细胞的制备取10ul TOP10F’菌液，接种于200ml LB液体培养基中活化培养，37℃，200 rpm，16～18小时。

毕赤酵母转化相关整理

1.电转化相关事项①在电转完毕涂MD平板时，我是不加抗生素的，因为MD平板本身就有组氨酸营养缺陷的筛选标记，据说再加抗生素很容易压力过大，不长菌。

20度培养48-55h后，酵母长出来，挑单菌落，到YPD液体培养基（刚筛选时我一般只加0.5mg/ml的G418），菌长好后，提基因组，验证插入基因和拷贝数，拷贝数这时也可以通过添加不同浓度G418的平板来验证。

如果基因插入没问题，再培养诱导，测活。

②YPD可以直接灭菌，刚开始我葡萄糖单灭，后来发现酵母粉蛋白胨葡萄糖一起加也没问题。

③.温度方面，毕赤酵母最常用的是30度，只要不长时间超过32度就没有问题，诱导温度与表达的蛋白是否被降解有关，但通常30度。

④.生物素方面，只要用到酵母粉的培养基都可以不用。

⑤. MD是的氮源是无机氮，没有组氨酸，空的毕赤酵母不在它上面不会长，长的有99％都是重组菌⑥可以用G418 YPD平板筛选高考贝菌，一般情况下拷贝数高的表达量就高（但有些蛋白酶不一定表达量高就好），一般情况下MD平板上长出的菌可以直接用牙签挑到1.5mg/ml或2mg/ml G418的平板上，这个时候一般培养三天时间，长的大的菌落可能就没有几个了，这几个大的获得高表达的可能性是最大的。

⑦灭菌温度方面，只要有葡萄糖的都115度20分钟，没有的都可以121度20分钟。

⑧甲醇诱导方面，一天加一次终浓度1％的甲醇即可，前提条件是第一次一定要换掉培养基。

⑨蛋白降解方面，在发酵上一般通过调整pH,收获时间来解决，通过诱导温度是不理想的；从宿主上可以选用SMD1168，SMD1165,SMD1163,SMD1168用的最多，从分子上，可以突变掉目标蛋白的酶切位点。

可以通过不同的载体不同的线性化位点对已有的高表达酵母进行再转化，以获得更高表达的菌株；些方法也可以进行两种不同蛋白的共表达。

⑩电击之后，加入1ml的山梨醇，吸入1.5ml的ep管中，置于30度摇床低速培养1h，再涂板。

毕赤酵母电转化方案

毕赤酵母电转化方案一、培养基1.BMMY培养基：酵母粉l0g，蛋白胨20g，溶于700mL去离子水，湿热灭菌30min，冷却后加入100mL 1M pH6.0磷酸钾缓冲液，100mL 10×YNB，2mL 500×B，100mL 10×M，4℃保存。

2.BMGY培养基：酵母粉l0g，蛋白胨20g，溶于700mL去离子水，湿热灭菌20min，冷却后加入100mL 1M，pH6.0，磷酸钾缓冲液，100mL 10×YNB，2mL 500×B，100mL 10×GY，4℃保存。

3.YPD培养基：酵母粉l0g，蛋白胨20g，溶于900mL去离子水，湿热灭菌30min，冷却后加入100mL 10×D，4℃保存。

4.MD培养基：800mL灭菌水中加入100mL l0×YNB，2mL 500×B，100mL 10×D，4℃保存。

5.1M，pH6.0的磷酸钾缓冲液：132mL 1M K2HPO4，868mL 1M KH2PO4，pH6.0，湿热灭菌，4℃保存。

6.10×YNB：YNB 134g(含硫酸铵)溶于1000mL去离子水，过滤除菌，4℃保存7.500×B：20mg Biotin溶于100mL去离子水，过滤除菌，4℃保存。

8.10×M：5mL甲醇与95mL去离子水混合，过滤除菌，4℃保存。

9.10×GY：100mL甘油与900mL去离子水混合，湿热灭菌，4℃保存。

10.10×D：100g葡萄糖溶于1000mL去离子水，过滤除菌，4℃保存。

11.1M 山梨醇：18.2g D-山梨醇溶于100mL去离子水，过滤除菌，4℃保存。

二、转化步骤1．接种毕赤酵母的单菌落到含有5mLYPD液体培养基的三角瓶中，30℃过夜培养。

2．转接含有50mL YPD液体培养基的大三角瓶，接种量1%，30℃培养过夜，直到OD600=1.3～1.5；3．1500g，4℃条件下离心培养液5min，再用50mL冰浴的双蒸水重悬细胞；4．重复第三步的离心操作，然后用25mL冰浴的双蒸水重悬细胞；5．重复第三步的离心操作，然后用2mL冰浴的1M的山梨醇溶液重悬细胞；6．重复第三步的离心操作，然后用100μL冰浴的1M的山梨醇溶液重悬细胞，使菌悬液体积大约为150μL；7．将80μL处理好的感受态细胞和5～20μg经过线性化了的DNA（溶解在双蒸水中，体积为5～10μL）加入一个1.5mL预冷离心管中，混匀。

毕赤酵母电击转化注意事项

毕赤酵母电击转化注意事项一、制备感受态的菌液收集时间：1、准确测定OD值：OD在1.2～1.5之间。

1）为了准确测定OD值，建议将菌液稀释不同浓度测定（1、2、4、8、16倍稀释，看其OD值是否呈线性关系）。

每个倍数做3－5个重复，应该可以大致推断OD值是否准确！菌液看上去浑浊，但OD值不高，很可能OD稀释倍数不够！2）OD值是否测准也可以这样估算：OD600为40左右时，菌体湿重（6000rpm离心5min）约0.95g/10ml。

高密度发酵时菌体湿重将相应下降。

2、75ml的菌，经18h左右的培养，最后sorbital洗涤完毕后，50ml离心管里所剩菌体特别浓，需要1ml sorbitol才可溶解为糊状。

正常培养的OD在1.2～1.5之间的500ml菌液，收集的感受态也用1ml稀释的，没那么粘稠。

可以看看降低培养温度（27摄氏度）或缩短培养时间（12h）。

3、甚至不用转接,直接挑单克隆在50－100mlYPD中摇过夜，效果也很好二、制备感受态的菌液量如果只转一个样品，50ml就够了，一般50ml的培养液如果OD值正常的话够做10管感受态的，其他的按比例缩小。

用大试管摇5ml菌液，然后取1ml毫升在1.5mlEP管中制感受态，每一步的离心时间30秒就行。

整个流程时间短，制备好的感受态用来做转化的效率很高。

山梨醇离心，洗涤的过程之后的重悬的时候注意浓度，不要过于粘稠和稀释。

三、感受态的保存感受态细胞做好后由于电转化杯还没有处理好等原因，在冰上放几个小时再做可能有一定的影响，尽量马上制备马上转化。

如果感受态细胞要保存，不需要加甘油，一般80ul EP管分装，-70 或-80 摄氏度保存。

另附：酵母GS115点种分离纯化接种GS115于5ml YPD液体培养基，30℃，200rpm振荡过夜，涂布YPD平板，30℃培养48 小时，用YNB基本培养基和含His的补充培养基作点种分离纯化，挑选在补充培养基生上生长而在基本培养基上不生长的单菌落划YPD平板，4℃保存。

毕赤酵母活化方法

毕赤酵母活化方法
毕赤酵母是一种常用的酵母菌，用于发酵制作面包、饮料、酒类等食品和饮料。

毕赤酵母的活化方法非常重要，如果不正确地活化毕赤酵母，将会影响酵母的发酵能力和质量。

以下是毕赤酵母活化的方法：
1. 准备好所需的材料，包括毕赤酵母、温水、白糖和面粉。

2. 将适量的面粉和白糖混合在一起，再加入温水，搅拌均匀。

3. 将混合好的面糊放到一个温暖、潮湿的地方，让其发酵。

4. 当面糊发酵至两倍大时，加入适量的毕赤酵母，并再次搅拌均匀。

5. 将混合好的毕赤酵母液体放到一个温暖、潮湿的地方，让其继续发酵。

6. 当毕赤酵母液体发酵至两倍大时，即可开始使用。

需要注意的是，活化毕赤酵母的过程中，温度和湿度对酵母的发酵能力有着很大的影响。

一般来说，温度应控制在25-30℃之间，湿度应在70%左右。

同时，毕赤酵母液体的发酵时间也应根据具体情况进行调整，以确保酵母的发酵质量和效果。

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