药品无菌检查方法的验证试验讲义(ppt 27页)

大豆－胰酪胨培养基
培养基灵敏度检查
与方法验证用菌株 金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌；生孢梭菌；白色念珠菌、
黑曲霉
检验方法
只要供试品性状允许，
性状允许的样品均可采用薄膜过滤，
应采用薄膜过滤法
利于抗菌影响去除
稀释剂与
薄膜过滤冲洗液 0.1％蛋白胨水溶液； A、D、K
0.1％蛋白胨水溶液（ 0.1％
• 根据上述验证试验结果可知，氯化 钠注射液的无菌检查，不需冲洗，以金 黄色葡萄球菌为阳性对照菌。本方法适 合于氯化钠注射液的无菌检查，即氯化 钠注射液的无菌检查法通过验证。
六、注意事项
1. 预试验 2. 稀释液与冲洗液: 作用、种类、冲洗量 3. 菌液: 保存、加入方式、加入量 4. 具有抗菌活性的供试品 5.滤膜： 选择、种类 6.对照菌: 根据供试品的特性来选择(抗生素根
的。单倍量重试)
二．方法验证试验建立及要求
验证实际是伴随着整个试验过程， 试验过程中的每一个环节都应该有合理 的证明，以确保在实际检验条件下，该 供试品的无菌检查法的可靠性。
主要内容 怎么做: 一选方法二看性质三除
抑菌性四计菌数五定取样量
• 注意什么: 七注意
怎么做
一 选定试验方法: 可靠、稳定、简便
2005年版无菌检查法主要方面与USP、BP的比较
比较项目
ChP2005
USP29
BP2002
检验条件规定
总体10000级、局部100级
无具体规定
无具体规定
人员要求
无具体规定
正确培训和认可
细菌检查培养基 硫乙醇酸盐流体培养基
硫乙醇酸盐流体培养基
硫乙醇酸盐流体培
养基
真菌检查培养基 改良马丁培养基 大豆－胰酪胨培养基
• 供试品形状允许,应采用薄膜过滤法.
二 看有无抑菌性:
•
间接方法: 说明书、文献、技术资料
• 直接方法: 体外抑菌试验
三 消除抑菌性的方法
• 1. 中和法——利用化学（生物）专属性 灭活 如:对氨基苯甲酸
• 2. 稀释法——降低供试品的相对浓度
• 3. 薄膜法——利用体积差异分离
各方法组合运用，效果更佳！
法进行方法学验证。 • 1、 材料和仪器 • 1.1 供试品 • 1.2 培养基 • 1.3 验证试验用菌种 • 1.4 仪器和滤器
2、方法与结果
2.1 菌液的制备 2.2 菌液的计数 2.3 供试液的制备
取供试品3瓶（3瓶×500ml/瓶 =1500ml），供一株试验菌用。 2.4 薄膜过滤法
3、结论
3、结论
根据上述验证试验结果可知：注射 用阿奇霉素的无菌检查至少需要0.1％的 蛋白胨水溶液1500ml（500ml/滤筒×3 个滤筒）冲洗，以金黄色葡萄球菌为阳 性对照菌。本方法适合于注射用阿奇霉 素的无菌检查，即注射用阿奇霉素的无 菌检查法通过验证。
(二) 液体制剂
以氯化钠注射液为例，对其无菌检查
• 四 计细菌数：
•
菌液的制备和菌液的计数。
• 五 确定取样量：见表2-1和表2-2
三．方法验证试验的操作
供试品对每一个试验菌应逐一进行 验证。菌种及菌液制备同培养基灵敏度 的检查。
1.薄膜过滤法
(1) 验证试验的方法
(2) 验证结果的判断
无抑菌作用
有抑菌作用:应采用增加冲洗量、增加冲 洗次数、增加培养基的用量、改变冲洗液的种 类、更换滤膜品种等方法，以消除供试品的抑 菌作用，并再用相应的方法重复验证试验，最 后确认所采用的无菌检查方法的可行性。
供试品装量V(ml)
单株菌的最少取样量(ml)
≤1
V ×10
1＜V＜5
V/2×10
5≤V＜20
20
20≤ V ＜50
50
50≤V＜100
100
50≤V＜100（静脉给药） V/2×10
100≤V ＜ 500
V/2×6
≥500
3000
表2-2 固体制剂验证试验的最少样品量
供试品装量M M＜50mg 50mg≤M＜300mg 300≤M＜5g M≥5g
无菌检查法方法的验证试验
湖北省药品检验所
程樱
概述
同其他分析方法一样，无菌检查也 必须通过证明所采用的检验方法和检验 条件是可靠的，来保证该检查方法的完 整性和试验结果的准确性。
一．2005年版药典的修订与完善
2005年版药典强调应充分验证供试 品本身对微生物生长的影响。2005年版 药典无菌检查法中将抑细菌和抑真菌试 验改变为方法验证试验。
单株菌的最少取样量 M×10 M/2×10 1.5g 5g
五．方法验证试验的实例 （示教内容）
以注射用阿奇霉素为例，对其无菌
检查法进行方法学验证。 1、 材料和仪器 1.1 供试品 1.2 培养基及冲洗液 1.3 验证试验用菌种 1.4 仪器和滤器
2、方法与结果
按照中国药典2005年版二部无菌检查 法（附录Ⅺ H）方法验证进行试验。 2.1 菌液的制备 2.2 菌液的计数
pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液
（聚乙氧基乙醇、0.1％吐
温-80）；十四烷酸异丙酯
培养条件与时间 14天（+2；3天） 不少于14天（+不少于4天） 14天（＋7天）
结果判断与复试规定
一次结果为准 (设备及环境不符合要求、实验过程有可能引起污染的
因素、阴性对照有菌生长、分离微生物可明确归因于无菌实验过程中所用的材料或技术错误造成
2．直接接种法
(1) 验证试验的方法 (2）验证结果的判断
无抑菌作用 有抑菌作用:可采用适当增加培养基 的体积，或使用中和剂、灭活剂,改变验 证试验的方法，采用薄膜过滤法来消除 其抑菌性，同样需要确认所采用的无菌 检查方法的可行性。
四．方法验证试验最少取样量
表2-1 液体制剂验证试验的最少取样量
主要解决措施：
1.喹诺酮类：以金属2价离子如0.1mol/LMnSO4溶 液为中和剂(形成螯合物）；
2.β-内酰胺类：以β-内酰胺酶为中和剂； 3.其他抗生素：改善冲洗条件，或更换滤膜的品
种。
4.每片膜冲洗500ml以内基本都能解决问题。 5.应尽量去除药物对微生物生长的影响。USP29
每膜最多冲洗500ml；BP2002和JP14每膜冲洗 不大于1000ml；中国药典2005年版以所有阳性 对照菌生长为目标。
菌液的制备和菌液的计数均为验证
试验的预试验，以初步确定小于100cfu 的试验菌的稀释倍数，为验证试验的加 菌量提供参考。
Hale Waihona Puke 2.3 供试液的制备 取供试品3支（3支×0.5g/支
=1.5g），分别加入0.1%蛋白胨水溶液 约10ml使溶解，摇匀，供一株试验菌用。
2.4 薄膜过滤法 • 重复菌液的计数的步骤 • 阳性菌的选择