质谱测序 第三代测序
第三代测序技术
第三代测序
◦ 另一类非Sanger 原理的DNA 测序技 术在 2008 年成为现实，这类基于单 个分子信号检测的 DNA 测序被称为 单分子测序 (single molecule sequencing, SMS) ，或第三代测序 (third generation sequencing, TGS) 。 据预测， SMS 将比 NGS 具有更快的 速度和更低的成本，从而使研究人 员能够实现目前无法进行的研究工 作。尽管从现在的进展来看， SMS 还未能完全实现预期目标，但已经 做出了许多重要的努力。这些新技 术包括 Helicos 的 tSMS ， PacBio 的 SMRT， Oxford 的 Nanopore 以及其 它一些尚处于实验室阶段的技术， 如电镜测序，蛋白质晶体管测序等 等。
dna测序时不需要经过pcr扩增实现了对每一条dna分子的单独测一一第三代测序技术的出现第三代测序技术的出现二二第三代测序技术原理第三代测序技术原理三三第三代测序技术特点第三代测序技术特点四四三代测序技术的比较三代测序技术的比较五五第三代测序技术的应用第三代测序技术的应用第四代测序技术第四代测序技术一一第三代测序技术的出现第三代测序技术的出现自从2006年第一台454gsflx测序平台上市以来基于非sanger测序原理的第二代高通量测序nextgenerationsequencingngs技术迅速成为了基因组学研究的重要工具其中包括illuminasolexaabisolidroche454以及lifetech的半导体测序仪iontorrentpgmproton
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固态纳米孔测序法
虽然α溶血素七聚体相当不错，但用于悬浮纳 米孔的磷脂双分子层并不稳定且难以操控。固 体或是人造纳米孔被认为是下一代纳米孔技术 一方面因为它们无需使用有机材料做支撑物， 而主要是它们更加稳定。固态纳米孔还能在单 个设备上平行地多重使用，这是生物纳米孔无 法达到的。人造纳米孔组装在固态物质上，如 氮化硅，硅或金属氧化物，及最近使用的石墨 烯。石墨烯是一种新的单原子厚度的材料，是 所知的最薄的膜。宾夕法尼亚大学的Marija Drndic小组发表了DNA通过石墨烯膜纳米孔的 检测实验，该膜的厚度为1 - 5纳米，纳米孔的 直径为5 - 10纳米。
质谱测序 第三代测序
第三代测序技术与质谱测序技术的介绍和比较质谱蛋白测序质谱分析是一种测量离子质荷比的分析方法。
一级质谱主要是给出目标物的分子量，GC-MS一级谱图可以定性分析，LC-MS能用于简单的分子量测定。
二级质谱可以看出目标物的部分碎片，可以对目标物的结构进行分析。
在蛋白测序方面，一级质谱结合肽质量指纹图谱(peptide mass fingerprint，PMF)可以初步推测蛋白质的种类、序列。
PMF基本原理是将蛋白质直接从双向电泳凝胶上切下或印迹到PVDF膜上并切下，经过原位酶解得到酶解肽段，然后用质谱得到这些肽段的PMF，即获得了肽质量指纹图谱。
由于每种蛋白质氨基酸序列都不同，当蛋白质被酶解后，产生的肽片段序列也不同，其肽混合物质量数即具一定特征性。
用实测的肽段质量去查找蛋白质和核酸序列库，结合适当的计算机算法，可鉴定蛋白质。
但这种方法不能用来直接测序，必须依靠大量的数据库信息进行比对，准确率也受到限制。
串联质谱可直接用于测定肽段的氨基酸序列，其过程是从一级质谱产生的肽段中选择母离子，进入二级质谱，经惰性气体碰撞后肽段沿肽链断裂，由所得到的各肽段质量数差值推定肽段序列。
得到的质谱数据既可以通过仪器提供的软件解析，也可以进行手工解析。
在第一级质谱得到肽的分子离子,选取目标肽的离子作为母离子，与惰性气体碰撞，使肽链中的肽键断裂。
主要有三种不同的肽键断裂方式，产生6中不同的碎裂离子：即N端的a, b, c型离子与C端的x, y, z型离子. 每种断裂类型分别生成互补的两种离子, 如a-x,b-y,c-z 。
最常见的是a 型离子、b 型离子和y型离子，其他类型离子较少出现。
将这些碎片离子系列综合分析，可得出肽段的氨基酸序列。
质谱法有不少优点，还能用于翻译后修饰的分析（糖基化、磷酰化），但目前只适用于20个氨基酸以下的肽段。
此外，还存在固有的局限性，比如Leu和Ile、Lys和Gln不能区分，有些肽的固有序列不能用质谱法测定。
一二三四代测序技术原理详解
一二三四代测序技术原理详解一、第一代测序技术原理第一代测序技术最早出现于1977年，是由Sanger等人发明的，并被称为“链终止法”。
其原理是通过DNA聚合酶将输入的DNA序列再生产出一条互补链，同时在每个位点上加入一种特殊的荧光标记的二进制核苷酸，然后将这些被标记的DNA片段分开进行电泳，根据电泳结果可以得到DNA的序列。
第一代测序技术的核心原理是首先将待测序列分成多个片段，然后利用DNA聚合酶在每个片段的3'末端加入一种荧光标记的二进制核苷酸。
这种核苷酸的特殊之处在于，它们只能和待测序列的碱基互补配对，并且在加入过程中会停止DNA链的生长。
随后，将加入了荧光标记的DNA片段进行分离和电泳。
由于不同长度的DNA片段在电场下移动的速度不同，所以通过观察不同片段的移动位置，可以推断出每个片段的碱基序列。
二、第二代测序技术原理第二代测序技术的原理是通过对待测DNA片段进行多轮的扩增和测序，最后将所有结果进行比对和组装，得到完整的DNA序列。
第二代测序技术的核心原理是将待测DNA样本分成许多小片段，然后将每个片段进行扩增，所得到的扩增产物再次进行扩增，并且在扩增过程中引入一种荧光标记的二进制核苷酸。
在每个扩增步骤之后，需要将扩增产物进行分离，例如利用固相法将扩增产物固定在芯片上。
然后，对每个扩增产物进行毛细管电泳或基于光信号的测量，以确定每个扩增产物对应的碱基序列。
最后，通过将所有碱基序列进行比对和组装，可以得到待测DNA的完整序列。
第二代测序技术相较于第一代测序技术具有更高的通量和更低的成本，可以同时进行大规模的测序，因此被广泛应用于基因组学和生物医学研究。
三、第三代测序技术原理第三代测序技术是在第二代测序技术的基础上发展而来的，其主要原理是通过直接测量DNA或RNA单分子的序列来进行测序，无需进行扩增和分离过程。
第三代测序技术的核心原理是通过探测DNA或RNA单分子在固定的平面上的位置变化，来确定每个单分子的碱基序列。
三代测序原理
三代测序原理
三代测序原理是指第三代测序技术，又称为单分子测序技术。
与第一代（Sanger测序）和第二代（高通量测序）相比，第三代测序技术具有更高的速度、更低的成本和更长的测序读长等优点。
第三代测序技术的原理主要是基于测序模板的直接测序，而不需要PCR扩增。
这种直接测序的方法可以避免PCR扩增引入
的错误，并且能够在一个测序周期内得到完整的序列信息。
在第三代测序技术中，常用的方法是通过将DNA分子固定在
一个载体上，形成DNA聚集体。
然后，通过负电荷的方式将
这些DNA聚集体附着在固定的表面上，形成一个DNA分子
阵列。
接着，通过使用荧光染料将这些固定的DNA分子标记出来，
并且使用激光束在一个固定的区域内进行扫描。
这样，就可以得到每个DNA分子的位置和荧光信号强度信息。
在测序过程中，通常会使用一种特殊的酶来控制DNA链的合
成过程。
这种酶能够识别每个碱基的序列信息，并且在特定的条件下将其添加到适当的位置。
通过不断重复这个步骤，直到测序反应完成，就可以得到整个DNA分子的序列信息。
总结起来，第三代测序技术的原理是通过直接测序DNA模板，
不需要PCR扩增，通过固定DNA分子并使用荧光标记，通过酶的作用在特定条件下完成碱基的添加，最终得到完整的
DNA序列信息。
这种技术具有快速、低成本和长读长等优势，在各种生物学研究中得到了广泛的应用。
第三代测序技术(单分子实时DNA测序)与第二代测序技术(高通量测序技术)简介
第三代测序技术（单分子实时DNA测序）与第二代测序技术（高通量测序技术）简介第三代测序技术(单分子实时DNA测序)与第二代测序技术(高通量测序技术)简介第三代测序技术简介如果有人告诉你用显微镜实时观测单分子DNA聚合酶复制DNA，并用它来测序，你一定会认为他异想天开，没有一点生物的sense。
我最初就是这样认为的，然而它不仅可以实现，而且已经实现了～这个就是被称为第三代的测序技术，Pacific Biosciences公司推出的“Single Molecule Real Time(SMRT) DNA Sequencing”(单分子实时DNA测序)。
我有幸在NIH听到了这个技术发明人Stephen Turner博士的讲座，根据自己粗浅的理解记录整理一下。
要实现单分子实时测序，有三个关键的技术。
第一个是荧光标记的脱氧核苷酸。
显微镜现在再厉害，也不可能真的实时看到“单分子”。
但是它可以实时记录荧光的强度变化。
当荧光标记的脱氧核苷酸被掺入DNA链的时候，它的荧光就同时能在DNA链上探测到。
当它与DNA链形成化学键的时候，它的荧光基团就被DNA聚合酶切除，荧光消失。
这种荧光标记的脱氧核苷酸不会影响DNA聚合酶的活性，并且在荧光被切除之后，合成的DNA链和天然的DNA链完全一样。
第二个是纳米微孔。
因为在显微镜实时记录DNA链上的荧光的时候，DNA链周围的众多的荧光标记的脱氧核苷酸形成了非常强大的荧光背景。
这种强大的荧光背景使单分子的荧光探测成为不可能。
Pacific Biosciences公司发明了一种直径只有几十纳米的纳米孔[zero-mode waveguides (ZMWs)]，单分子的DNA聚合酶被固定在这个孔内。
在这么小的孔内，DNA链周围的荧光标记的脱氧核苷酸有限，而且由于A，T，C，G这四种荧光标记的脱氧核苷酸非常快速地从外面进入到孔内又出去，它们形成了非常稳定的背景荧光信号。
而当某一种荧光标记的脱氧核苷酸被掺入到DNA链时，这种特定颜色的荧光会持续一小段时间，直到新的化学键形成，荧光基团被DNA聚合酶切除为止(见图)。
第三代测序技术的原理和应用
第三代测序技术的原理和应用第一部分：引言随着基因组学研究的快速发展，测序技术也在不断进步。
第一代测序技术（Sanger测序）和第二代测序技术（高通量测序）已经取得了重大突破，但仍存在一些限制。
为了克服这些限制，第三代测序技术应运而生。
本文将介绍第三代测序技术的原理和应用。
第二部分：第三代测序技术的原理第三代测序技术是一种新型的高通量测序技术，其原理与传统的测序技术有所不同。
第三代测序技术的原理主要包括以下几个方面：1.基于单分子扩增：第三代测序技术采用单分子扩增的方法，不需要PCR过程和文库构建步骤，从而避免了样本损失和引入偏差。
2.实时测序：第三代测序技术实时监测DNA合成过程，可以直接检测每个碱基的加入，无需后续的显著化和检测步骤。
这大大提高了测序速度，并降低了成本。
3.长读长读长读：相比第二代测序技术生成的短读长度，第三代测序技术可以产生更长的读长，一次读取几千个碱基。
这种特点对于重复序列的分析、基因组结构建模和个体基因组描绘等研究非常有用。
第三部分：第三代测序技术的应用第三代测序技术广泛应用于不同领域的基因组学研究。
以下是第三代测序技术的几个重要应用方面：1.药物研发：第三代测序技术可以快速高效地获得个体基因组序列信息，帮助科学家识别药物靶点，推动个体化药物研发。
2.疾病研究：通过第三代测序技术，我们可以快速识别临床样本中的致病基因，深入研究疾病的遗传基础，并帮助制定个性化治疗方案。
3.农业研究：第三代测序技术可以高通量地鉴定和分析作物、家畜和其它农业生物的基因组信息，有助于优化农业生产和提高农作物品质。
4.环境研究：第三代测序技术可以帮助科学家研究环境中的微生物群落，揭示微生物对环境变化的响应，从而提供更好的环境保护策略。
5.进化研究：第三代测序技术可以提供大量的遗传信息，促进生物的进化研究，深入了解物种的起源、演化和适应性变化等问题。
第四部分：结论第三代测序技术以其独特的原理和广泛的应用前景吸引了基因组学研究领域的关注。
第三代测序技术介绍
第三代测序技术介绍目前，主要的第三代测序技术包括单分子测序技术和纳米孔测序技术。
单分子测序技术是指将DNA样本直接读取成单个分子的测序技术。
这种技术的一个典型代表是PacBio Single Molecule Real-Time（SMRT）测序技术。
这种技术基于真核生物DNA聚合酶的特点，通过监测单个DNA分子的合成过程来实现测序。
在PacBio SMRT测序技术中，DNA分子被固定在悬浮在荧光物质中的微小光子学平台上，随着DNA合成的进行，DNA聚合酶会释放出光子，从而可以实时监测到DNA的合成过程。
这种技术能够实现长读取长度和高保真度，具有快速、高效、高通量的特点，被广泛应用于基因组学、转录组学等研究领域。
纳米孔测序技术是指通过将DNA样本引导通过一个纳米孔，并通过监测DNA分子在纳米孔中电信号的变化来实现测序的技术。
这种技术的一个代表是Oxford Nanopore Technologies（ONT）的MinION测序技术。
在MinION测序技术中，DNA样本通过纳米孔时，会引起电信号的变化，这种变化可以被转化成测序信息进行读取。
这种技术具有实时、长读取长度、低成本的特点，可以在实验室和户外等多种场合进行测序，被广泛应用于移动基因组学、环境监测等领域。
第三代测序技术的出现极大地推动了基因组学、转录组学等研究领域的发展。
它们不仅提高了测序的速度和准确性，还降低了测序的成本，使得大规模基因组和转录组的测序成为可能。
在人类基因组计划中，第三代测序技术被广泛应用于完成全基因组的测序任务，为研究人类基因组提供了重要的数据资源。
同时，第三代测序技术也被广泛应用于微生物学、农业科学、生物多样性研究等领域，为相关研究提供了有力的支持。
然而，尽管第三代测序技术在测序速度和准确性上有了巨大的进步，但其仍然存在一些挑战和限制。
比如，第三代测序技术在读取长度和错误率等方面仍有改进的空间，同时对于复杂的基因结构和重复序列的测序仍然存在困难。
三代测序原理及步骤
三代测序原理及步骤
三代测序是一种新型的高通量测序技术，与传统的二代测序技术相比，具有更快的速度、更高的分辨率和更低的成本。
三代测序的原理主要分为三个步骤：预处理、测序和数据分析。
1. 预处理：样本DNA需要进行预处理，包括DNA提取、文
库构建和引物连接等。
其中文库构建过程中，DNA分子被打
断成较小的片段，并与适当的引物序列连接。
这个过程是为了克服DNA分子长度和连续读取长读长的难题。
2. 测序：三代测序主要依赖于单分子测序技术。
这种技术可以直接读取单个DNA分子的序列信息，避免了文库扩增和PCR
等步骤对序列的干扰。
常用的三代测序技术包括SMRT （Single Molecule Real-Time）测序、Nanopore测序等。
其中，SMRT测序技术利用圆盘形态的DNA多聚酶在放射线观测下
合成DNA，观察到DNA的添加情况，从而得到DNA的序列
信息；Nanopore测序技术则利用微小的纳米孔通过测量DNA
分子通过孔的电导变化来分析DNA序列。
3. 数据分析：三代测序产生的数据量大、复杂，需要进行数据预处理、序列比对、变异检测、基因组组装等一系列的数据分析步骤。
这些步骤主要包括数据清洗、基因组或转录组的组装、SNP分析、结构变异分析等。
总体来说，三代测序的步骤包括预处理、测序和数据分析。
通
过这些步骤，可以高效地获得高质量的基因组或转录组序列，并进一步分析相关的生物学功能和基因表达调控等信息。
简述一、二、三代测序技术
简述一、二、三代测序技术
一代测序
一代测序技术是首次开发的测序技术，也叫Sanger测序，它实际上是一种“拼接”技术，利用特定的DNA复制酶（DNA聚合酶）在双链DNA基础上进行延展反应，从而实现DNA测序的目的，其优势在于格式简单，容易操作，准确度高，但是比较耗时。
二代测序
二代测序技术，又叫“高通量测序”或“质谱测序”，最基本的原理是使用新的双链DNA片段作为模板，利用测序读码亚单位，不断改变测序片段的序列，从而快速完成测序工作，其优势在于测序效率高，但准确度要比一代测序低。
三代测序
三代测序技术，又称“短序列测序”，是一种测序技术，其最基本的原理是使用单个DNA片段作为模板，构建测序片段，并记录每一个片段的碱基序列，从而实现测序的目的，其优势在于测序速度快，准确度高，但也比较昂贵。
三代测序原理技术比较
三代测序原理技术比较三代测序是指第三代DNA测序技术，相对于第一代和第二代DNA测序技术，它具有更高的测序速度、更低的成本和更高的基因组分辨率。
三代测序技术在遗传学、生物学和医学研究等领域中起着重要的作用。
本文将对三代测序原理和技术进行详细比较。
第一代测序技术，又称为经典测序技术，是20世纪70年代末到80年代初出现的。
代表性的方法包括Sanger测序和Maxam-Gilbert测序。
这些方法都是基于DNA链延伸原理进行测序，通常需要大量的模板DNA和特定的剪切酶。
优点是准确性高，读长长，可达到1000到2000个碱基。
缺点是测序速度慢，成本高，并且需要大量的模板DNA。
第二代测序技术，也称为高通量测序技术，是在21世纪初出现的。
代表性的方法包括454测序、Illumina测序和SOLiD测序。
这些方法都是基于DNA扩增和测序的原理进行测序，通常需要少量的模板DNA。
优点是测序速度快，成本低，并且可以实现高通量测序。
缺点是读长短，通常只能达到几百个碱基，而且对于GC含量高的区域有较大的偏倚。
第三代测序技术，又称为单分子测序技术，是在2005年之后出现的。
代表性的方法包括Pacific Biosciences (PacBio)测序、Oxford Nanopore Technologies (ONT)测序和Helicos测序。
这些方法都是基于单分子测序的原理进行测序，通常只需要少量的模板DNA。
优点是读长极长，可以达到数万个甚至数十万个碱基，对于复杂基因组和长读长测序有很大的优势。
此外，这些方法不需要扩增和特定的剪切酶，因此可以避免偏倚。
缺点是准确性相对较低，错误率较高。
在三代测序技术中，PacBio测序和ONT测序是目前较为成熟和广泛应用的两种方法。
PacBio测序原理是利用DNA聚合酶在测序过程中释放出的荧光信号进行测序。
当DNA聚合酶在DNA模板上合成新的DNA链时，会引起荧光信号的变化，从而实现碱基的识别和测序。
rna测序和质谱技术
rna测序和质谱技术
RNA测序（RNA sequencing）是一种高通量的技术，用于确
定细胞或组织中RNA分子的序列和相对表达水平。
通过RNA 测序，可以了解到细胞中哪些基因是活跃的，并在不同条件下对基因表达进行比较分析。
常见的RNA测序技术包括Sanger
测序、二代测序（如Illumina测序）和第三代测序（如PacBio 和Oxford Nanopore测序）。
质谱技术是一种分析化学方法，用于确定化合物的质量和结构。
RNA质谱技术（RNA mass spectrometry）是指利用质谱技术
对RNA分子进行分析和鉴定。
通过质谱技术，可以获得RNA 分子的质量、碱基组成、序列和修饰等信息。
常见的RNA质
谱技术包括质谱法碱基测序（mass-based base sequencing）、
质谱法测序（mass sequencing）和质谱法修饰检测（mass-based modification detection）等。
综上所述，RNA测序是一种分析RNA分子序列和相对表达水平的技术，而RNA质谱技术则是一种用质谱技术对RNA分
子进行分析和鉴定的方法。
两者在RNA分子的研究中各具优势，并可相互辅助应用。
简述第一二三代测序技术原理
简述第一二三代测序技术原理
第一代测序技术原理：
第一代测序技术又称为Sanger测序技术，是由Frederick Sanger在1977年首次提出并开发的。
这种方法依靠DNA链
延伸的DNA聚合酶做模板并进行荧光标记，使用一种称为链终止的化学方法，会使DNA链延伸终止在特定核苷酸，生成所有长度的DNA片段，然后使用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离各个片段。
随后，通过电泳图谱能够分辨出不同长度的DNA片段，从而得到DNA序列。
第二代测序技术原理：
第二代测序技术是基于测序-by-synthesis原理，是通过将DNA 组装到表面上，并添加能够照亮每个核苷酸的化学试剂进行测序。
这些试剂可以逐个核苷酸累加，并用相应的光信号发送给计算机进行分析。
第二代测序技术包括Illumina, 454, Ion Torrent，和SOLiD。
Illumina使用激光照亮DNA序列中的核苷酸，并记录生成的荧光信号。
此技术具有高通量、低成本和快速的优点。
第三代测序技术原理：
第三代测序技术是一种实时单分子测序技术，采用单个自然DNA分子，并通过流速调节使DNA通过膜孔，然后测定膜孔中的电学性质来识别核苷酸（如Ion Torrent，Oxford Nanopore）。
这些技术还包括基于纳米技术和单分子DNA氧
化的PacBio技术。
这些技术具有不同的优点，包括高精确度、高通量和更真实的序列。
第三代测序技术原理及应用
洗涤
合成 检测
全内反射显微镜(TIRM)单色成像
Helico BioScience SMS技术
• 测序仪：HeliScope（2008年上市，$1,350,000）
• 优势：样本通量非常高，2 个流动槽可同时运行，每个流动槽有 25 个独立通道，每个通道又可以运行最多 96 个标记分子条形码的样本， 这样每次运行的样本数可高达 4 800 个。把 DNA 聚合酶用逆转录酶 代替还可以进行 RNA 直接测序。
Oxford Nanopore Technologies 纳米孔单分子测序技术
MinION 测序仪(2014年试用)
Lu H, Giordano F, Ning Z. Oxford Nanopore MinION Sequencing and Genome Assembly. Genomics, Proteomics & Bioinformatics. 2016;14(5):265-279. doi:10.1016/j.gpb.2016.05.004.
Oxford Nanopore Technologies 纳米孔单分子测序技术
• 优势：仪器构造简单使用成本低廉，因为它不需要对核苷酸进行标记， 也不需要复杂的光学探测系统 。能直接对 RNA 分子进行测序。同时 由于它是直接检测每一个碱基的特征性电流， 因而能对修饰过的碱基 进行测序， 这一点对于表观遗传学研究具有极高的价值。
总结
• 第三代测序有高通量、 低成本、 长读取长度、 测序时间短等优点， 并且避免了二代测序中 PCR 扩增的环节，因此减少了测序的错误率， 真正的实现了单分子测序。
• 但每种测序技术仍然有许多要加以攻克的挑战，需要用酶的测序技术， 如何保持酶的活性与稳定性就是一个重要的问题，如聚合酶与核酸外 切酶；需要荧光标记的测序技术，怎样提高单分子信号灵敏度同时又 不能把信号变成噪音增加荧光背景也是一个需要解决的事情；还有在 DNA 的固定方面如何保持 DNA 的延展性而不出现二聚体结构等问 题。
三代测序原理技术比较
三代测序原理技术比较三代测序是指第三代高通量测序技术，相对于第一代和第二代测序技术，它具有更高的速度、更低的成本以及更高的准确性。
目前，主要的三代测序技术包括单分子测序、单分子实时测序和纳米孔测序。
下面将分别介绍这三种技术的原理和特点。
单分子测序是三代测序技术的一种，它的原理是将DNA分子直接放在一个测序装置中，通过对DNA的碱基进行逐个测序以获得DNA序列。
单分子测序技术的一大特点是能够直接对DNA进行测序，不需要进行PCR扩增和片段化等传统测序方法中的预处理步骤，因此可以减少实验时间和所需样本量。
目前，常见的单分子测序技术有SMRT（Single-Molecule Real-Time）和Nanopore（纳米孔）测序。
SMRT技术是一种可以实现单分子实时测序的技术，它利用专门设计的测序装置以及特殊的引物和酶来进行测序。
测序装置中有一个高密度排列的微小孔，每个孔中有一个DNA聚合酶复合物和一个荧光基团，当DNA碱基与引物配对时，聚合酶会添加一个荧光基团，同时释放出荧光信号，这个过程可以被装置中的摄像机捕捉到。
通过观察荧光信号的强度和持续时间，就可以推断一些位置的DNA碱基是什么。
SMRT技术的优点是测序速度快、准确性高，但缺点是数据处理复杂，读长相对较短。
纳米孔测序是一种利用纳米孔测序装置对DNA分子进行测序的技术。
纳米孔是一种非常细微的孔道，通常直径在1-2纳米之间，只能通过单个DNA分子的一条链。
当DNA分子通过纳米孔时，其碱基会对应产生电信号，通过测量电信号的特性，可以推断DNA序列。
与其他测序技术相比，纳米孔测序的优势主要在于测序速度快、设备小巧、易于存储和传输，并且具有较长的读长和较低的测序成本。
然而，纳米孔测序技术也存在一定的误读和错配率等问题需要改进。
综上所述，三代测序技术相对于传统的测序技术具有更高的速度、更低的成本和更高的准确性。
单分子测序、单分子实时测序和纳米孔测序是目前主要的三代测序技术，它们各具特点，适用于不同的测序需求。
第三代测序技术原理
第三代测序技术原理
第三代测序技术是指最新一代的高通量测序技术，它与第一代和第二代测序技
术相比，具有更高的测序速度、更低的成本和更高的准确性。
第三代测序技术的原理主要包括单分子测序、纳米孔测序和合成孔测序等多种技术。
本文将重点介绍第三代测序技术的原理及其应用。
首先，单分子测序是第三代测序技术的核心原理之一。
它通过直接测序单个DNA分子，避免了PCR扩增和文库构建等步骤，大大简化了测序流程。
单分子测
序技术主要包括荧光基团标记、逐个核苷酸加入和荧光检测等步骤。
这种原理使得第三代测序技术在测序速度和准确性上有了质的飞跃。
其次，纳米孔测序是第三代测序技术的另一重要原理。
它利用纳米孔将DNA
分子拉伸成单链，然后通过电压驱动DNA分子逐个通过纳米孔，通过测量电流信
号来识别不同的核苷酸。
这种原理使得第三代测序技术可以实现长读长，大大提高了测序的准确性和覆盖度。
最后，合成孔测序是第三代测序技术的又一重要原理。
它利用合成纳米结构来
实现单分子测序，通过控制合成孔的尺寸和形状，可以实现对不同长度的DNA分
子进行测序。
这种原理使得第三代测序技术可以实现更高的测序速度和更低的成本，为基因组学研究提供了强大的工具。
总的来说，第三代测序技术的原理主要包括单分子测序、纳米孔测序和合成孔
测序等多种技术，它们共同推动了测序技术的发展，为基因组学研究提供了强大的工具。
随着第三代测序技术的不断进步，相信它将在生命科学研究和临床诊断中发挥越来越重要的作用。
第三代测序技术及其应用
第三代测序技术及其应用一、本文概述随着科技的飞速发展，测序技术已成为生物学、医学等领域的重要工具。
自第一代和第二代测序技术问世以来，它们在基因组学、转录组学、表观组学等领域发挥了巨大作用。
然而，随着研究的深入和技术的需求，第三代测序技术应运而生，以其独特的优势在多个领域展现出广阔的应用前景。
本文旨在全面介绍第三代测序技术的基本概念、原理、特点及其在各领域的应用。
我们将从技术的起源和发展入手，详细阐述第三代测序技术的核心原理和技术优势，包括长读长、高准确性、低成本等特点。
我们还将深入探讨第三代测序技术在基因组测序、转录组分析、疾病研究、农业生物技术等方面的实际应用案例，展望其未来的发展方向和潜力。
通过阅读本文，读者将对第三代测序技术有一个全面的了解，能够掌握其基本原理和应用领域，为相关领域的研究和实践提供有益的参考和借鉴。
二、第三代测序技术概述随着生物科技的飞速发展，测序技术作为生命科学领域的一项革命性技术，已经经历了两代重要的变革。
第一代测序技术，即Sanger 测序，以其高精度和准确性在基因组测序中发挥了重要作用，但其通量低、成本高的缺点限制了其在大规模基因组测序中的应用。
第二代测序技术，即高通量测序（Next-Generation Sequencing，NGS），以其高通量、低成本的优势，极大地推动了基因组学、转录组学等领域的研究。
然而，第二代测序技术仍然存在读长较短、数据解读复杂等问题。
在此背景下，第三代测序技术应运而生，以其超长读长、高准确性和实时测序的特点，为基因组学研究带来了新的突破。
第三代测序技术，也被称为单分子测序技术，主要包括单分子实时测序（Single-Molecule Real-Time Sequencing，SMRT）和纳米孔测序（Nanopore Sequencing）两种主要类型。
SMRT技术利用荧光标记的单分子DNA为模板，通过实时检测荧光信号的变化来读取DNA序列，具有读长可达数万碱基的特点，使得研究者能够直接获取到完整的基因序列信息。
一代、二代、三代测序技术原理与比较
一代、二代、三代测序技术原理与比较【写在前面的话】：首先，这一篇博文中的内容并非原创，而是对多篇文献中内容的直接摘录，有些图片和资料还来自身边的同事（在此深表谢意！），再夹杂自己的零星想法，写在这里分享与大家，同时也是为了方便自己日后若有需要能够方便获得，文章比较长。
摘要：从1977年第一代DNA测序技术（Sanger法）1，发展至今三十多年时间，测序技术已取得了相当大的发展，从第一代到第三代乃至第四代，测序读长从长到短，再从短到长。
虽然就当前形势看来第二代短读长测序技术在全球测序市场上仍然占有着绝对的优势位置，但第三和第四代测序技术也已在这一两年的时间中快速发展着。
测序技术的每一次变革，也都对基因组研究，疾病医疗研究，药物研发，育种等领域产生巨大的推动作用。
在这里我主要对当前的测序技术以及它们的测序原理做一个简单的小结。
图1：测序技术的发展历程生命体遗传信息的快速获得对于生命科学的研究有着十分重要的意义。
以上（图1）所描述的是自沃森和克里克在1953年建立DNA 双螺旋结构以来，整个测序技术的发展历程。
第一代测序技术第一代DNA测序技术用的是1975年由桑格（Sanger）和考尔森（Coulson）开创的链终止法或者是1976-1977年由马克西姆（Maxam）和吉尔伯特（Gilbert）发明的化学法（链降解）. 并在1977年，桑格测定了第一个基因组序列，是噬菌体X174的，全长5375个碱基1。
自此，人类获得了窥探生命遗传差异本质的能力，并以此为开端步入基因组学时代。
研究人员在Sanger法的多年实践之中不断对其进行改进。
在2001年，完成的首个人类基因组图谱就是以改进了的Sanger法为其测序基础，Sanger法核心原理是：由于ddNTP 的2’和3’都不含羟基，其在DNA的合成过程中不能形成磷酸二酯键，因此可以用来中断DNA合成反应，在4个DNA合成反应体系中分别加入一定比例带有放射性同位素标记的ddNTP（分为：ddATP,ddCTP,ddGTP和ddTTP），通过凝胶电泳和放射自显影后可以根据电泳带的位置确定待测分子的DNA序列（图2）。
DNA第一代,第二代,第三代测序的介绍
原理是：核酸模板在DNA聚合酶、引物、4 种单脱氧核苷三磷酸 ( d NTP，其中的一种用放射性P32标记 )存在条件下复制时，在四管反应系统中分别按比例引入4种双脱氧核苷三磷酸 ( dd NTP )，因为双脱氧核苷没有3’-O H，所以只要双脱氧核苷掺入链的末端，该链就停止延长，若链端掺入单脱氧核苷，链就可以继续延长。
如此每管反应体系中便合成以各自的双脱氧碱基为3’端的一系列长度不等的核酸片段。
反应终止后，分4个泳道进行凝胶电泳，分离长短不一的核酸片段，长度相邻的片段相差一个碱基。
经过放射自显影后，根据片段3’端的双脱氧核苷，便可依次阅读合成片段的碱基排列顺序。
Sanger法因操作简便，得到广泛的应用。
后来在此基础上发展出多种DNA 测序技术，其中最重要的是荧光自动测序技术。
荧光自动测序技术荧光自动测序技术基于Sanger 原理，用荧光标记代替同位素标记，并用成像系统自动检测，从而大大提高了D NA测序的速度和准确性。
20世纪80 年代初Jorgenson 和 Lukacs提出了毛细管电泳技术( c a p il l ar y el ect r ophor es i s )。
1992 年美国的Mathies实验室首先提出阵列毛细管电泳 ( c a p il l ar y ar r a y el ectr ophor es i s ) 新方法，并采用激光聚焦荧光扫描检测装置，25只毛细管并列电泳，每只毛细管在内可读出350 bp，DNA 序列,分析效率可达6 000 bp/h。
1995年Woolley研究组用该技术进行测序研究，使用四色荧光标记法，每个毛细管长，在9min内可读取150个碱基，准确率约 97 % 。
目前, 应用最广泛的应用生物系统公司 ( ABI ) 37 30 系列自动测序仪即是基于毛细管电泳和荧光标记技术的D NA测序仪。
如ABI3730XL 测序仪拥有 96 道毛细管, 4 种双脱氧核苷酸的碱基分别用不同的荧光标记, 在通过毛细管时不同长度的 DNA 片段上的 4 种荧光基团被激光激发, 发出不同颜色的荧光, 被 CCD 检测系统识别, 并直接翻译成 DNA 序列。
一、二、三代测序技术
一代、二代、三代测序技术第一代测序技术-Sanger链终止法一代测序技术是20世纪70年代中期由Fred Sanger及其同事首先发明。
其基本原理是，聚丙烯酰胺凝胶电泳能够把长度只差一个核苷酸的单链DNA分子区分开来。
一代测序实验的起始材料是均一的单链DNA分子。
第一步是短寡聚核苷酸在每个分子的相同位置上退火，然后该寡聚核苷酸就充当引物来合成与模板互补的新的DNA链。
用双脱氧核苷酸作为链终止试剂（双脱氧核苷酸在脱氧核糖上没有聚合酶延伸链所需要的3－OH基团，所以可被用作链终止试剂）通过聚合酶的引物延伸产生一系列大小不同的分子后再进行分离的方法。
测序引物与单链DNA模板分子结合后，DNA聚合酶用dNTP延伸引物。
延伸反应分四组进行，每一组分别用四种ddNTP（双脱氧核苷酸）中的一种来进行终止，再用PAGE分析四组样品。
从得到的PAGE胶上可以读出我们需要的序列。
第二代测序技术-大规模平行测序大规模平行测序平台（massively parallel DNA sequencing platform）的出现不仅令DNA测序费用降到了以前的百分之一，还让基因组测序这项以前专属于大型测序中心的“特权”能够被众多研究人员分享。
新一代DNA测序技术有助于人们以更低廉的价格，更全面、更深入地分析基因组、转录组及蛋白质之间交互作用组的各项数据。
市面上出现了很多新一代测序仪产品，例如美国Roche Applied Science公司的454基因组测序仪、美国Illumina公司和英国Solexatechnology公司合作开发的Illumina测序仪、美国Applied Biosystems公司的SOLiD测序仪。
Illumina/Solexa Genome Analyzer测序的基本原理是边合成边测序。
在Sanger等测序方法的基础上，通过技术创新，用不同颜色的荧光标记四种不同的dNTP，当DNA聚合酶合成互补链时，每添加一种dNTP就会释放出不同的荧光，根据捕捉的荧光信号并经过特定的计算机软件处理，从而获得待测DNA的序列信息。
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第三代测序技术与质谱测序技术的
介绍和比较
质谱蛋白测序
质谱分析是一种测量离子质荷比的分析方法。
一级质谱主要是给出目标物的分子量，GC-MS一级谱图可以定性分析，LC-MS能用于简单的分子量测定。
二级质谱可以看出目标物的部分碎片，可以对目标物的结构进行分析。
在蛋白测序方面，一级质谱结合肽质量指纹图谱(peptide mass fingerprint，PMF)可以初步推测蛋白质的种类、序列。
PMF基本原理是将蛋白质直接从双向电泳凝胶上切下或印迹到PVDF膜上并切下，经过原位酶解得到酶解肽段，然后用质谱得到这些肽段的PMF，即获得了肽质量指纹图谱。
由于每种蛋白质氨基酸序列都不同，当蛋白质被酶解后，产生的肽片段序列也不同，其肽混合物质量数即具一定特征性。
用实测的肽段质量去查找蛋白质和核酸序列库，结合适当的计算机算法，可鉴定蛋白质。
但这种方法不能用来直接测序，必须依靠大量的数据库信息进行比对，准确率也受到限制。
串联质谱可直接用于测定肽段的氨基酸序列，其过程是从一级质谱产生的肽段中选择母离子，进入二级质谱，经惰性气体碰撞后肽段沿肽链断裂，由所得到的各肽段质量数差值推定肽段序列。
得到的质谱数据既可以通过仪器提供的软件解析，也可以进行手工解析。
在第一级质谱得到肽的分子离子,选取目标肽的离子作为母离子，与惰性气体碰撞，使肽链中的肽键断裂。
主要有三种不同的肽键断裂方式，产生6中不同的碎裂离子：即N端的a, b, c型离子与C端的x, y, z型离子. 每种断裂类型分别生成互补的两种离子, 如a-x,b-y,c-z 。
最常见的是a 型离子、b 型离子和y型离子，其他类型离子较少出现。
将这些碎片离子系列综合分析，可得出肽段的氨基酸序列。
质谱法有不少优点，还能用于翻译后修饰的分析（糖基化、磷酰化），但目前只适用于20个氨基酸以下的肽段。
此外，还存在固有的局限性，比如Leu和Ile、Lys和Gln不能区分，有些肽的固有序列不能用质谱法测定。
第三代测序
测序技术在近几年中又有新的里程碑。
以PacBio公司的SMRT和Oxford Nanopore Technologies纳米孔单分子测序技术，被称之为第三代测序技术。
与前两代相比，他们最大的特点就是单分子测序，测序过程无需进行PCR扩增。
SMRT（single molecule Real-Time）测序技术
该技术其实应用了二代测序边合成边测序的思想，并以SMRT芯片为测序载体。
基本原理是：DNA聚合酶和模板结合，4色荧光标记的4种碱基（即是dNTP），在碱基配对阶段，不同碱基的加入，会发出不同光，根据光的波长与峰值可判断进入的碱基类型。
具体的反应在零级波导孔(zero-mode waveguides, ZMW)的纳米结构中完成。
这种ZMW是直径50-100纳米，深度100nm的孔状纳米光电结构，通过微加工在二氧化硅基质的金属铝薄层上形成微阵列，光线进入ZMW后会呈指数级衰减，从而使得孔内仅有靠近基质的部分被照亮。
Φ29 DNA聚合酶被固定在ZMW的底部，模板和引物结合之后被加到酶上，再加入四色荧光标记的dNTP (A555-dATP, A568-dTTP, A647-dGTP, A660-dCTP)。
当DNA合成进行时，连接上的dNTP由于在ZMW底部停留的时间较长(约200ms)，其荧光信号能够与本底噪音区分开来，从而被识别。
荧光基团被连接在dNTP的磷酸基团上，因此在延伸下一个碱基时，上一个dNTP的荧光基团被切除，从而保证了检测的连续性，提高了检测速度。
SMRT的测序原理如图所示。
图A显示的是ZMW的结构，激光进入ZMW后呈指数级衰减，仅能照亮靠近底部的约30nm区域，因此大部分游离的荧光标记dNTP不会被激发，只有结合到DNA聚合酶上的dNTP其荧光基团被激光照亮，激发荧光。
图B显示的是DNA合成过程中检测到的荧光信号及持续时间。
结合到酶上的dNTP停留时间较长，信号呈脉冲式激发，因而能够与噪音区分。
另外，可以通过检测相邻两个碱基之间的测序时间，来检测一些碱基修饰情况，既如果碱基存在修饰，则通过聚合酶时的速度会减慢，相邻两峰之间的距离增大，可以通过这个来之间检测甲基化等信息。
SMRT技术的测序速度很快，每秒约10个dNTP。
但是，同时其测序错误率比较高，达到15%。
但好在它的出错是随机的，并不会像第二代测序技术那样存在测序错误的偏向，因而可以通过多次测序来进行有效的纠错。
纳米单分子测序技术
与以往的测序技术皆不同，它是基于电信号而不是光信号的测序技术。
该技术的关键之一是，他们设计了一种特殊的纳米孔，孔内共价结合有分子接头。
借助电泳驱动单个分子逐一通过纳米孔，当DNA碱基通过纳米孔时，它们使电荷发生变化，从而短暂地影响流过纳米孔的电流强度，而ATCG单个碱基的带电性质不一样，通过电信号的差异就能检测出通过的碱基类别，从而实现测序。
纳米孔测序的主要特点是：读长很长，大约在几十kb，甚至100 kb;错误率目前介于1%至4%，且是随机错误，通量很高，起始DNA在测序过程中不被破坏，以及样品制备简单又便宜，理论上可以直接测序RNA。
纳米孔单分子测序计算还有另一大特点，它能够直接读取出甲基化的胞嘧啶，而不必像传统方法那样对基因组进行bisulfite处理。
这对于在基因组水平直接研究表观遗传相关现象有极大的帮助。
但也面临DNA易位速率过快，电流变化幅度较小，制备纳米孔材料的稳定性等问题。
测序技术比较
1、目的。
两种方法都是为了进行测序。
2、对象。
都是生物细胞产物。
三代测序对象是单细胞的DNA片段，不需要PCR扩增，分析单一的核苷酸种类；质谱测序对象是蛋白质的多肽片段，分析单一的氨基酸种类。
3、结果。
获得目的片段的序列。
三代测序得到DNA或RNA序列，质谱测序得到多肽序列。
两者序列可以相互换算验证。
4、原理。
三代测序基于碱基互补配对原则，边合成边测序；质谱测序根据不同离子碎片荷质比的差异进行区分。
5、检测方法。
三代测序利用荧光信号或电信号等检测，不同核苷酸对应不同信号，信号时间的不同可以区分碱基的修饰类型；质谱测序通过荷质比数据计算分析，计算中有一些特定的规律、公式，也有一些不可克服的误差因素。
6、读长。
三代测序读长很高，可以达到3000bp，测序速度约10bp/s；质谱测序只能针对小片段的多肽，在20个氨基酸左右。
7、修饰。
都可以检测发生的修饰。
三代测序通过核苷酸合成的时间检测碱基修饰；质谱测序通过荷质比分析氨基酸发生的修饰。
8、精度。
三代测序单次准确度约85%，重复测序可是准确率达到99.9999%；质谱测序准确率较高，但有部分氨基酸不能通过荷质比进行区分。
蛋白分析新技术
超高分辨率显微技术
自从1873年Ernst Abbe第一次发现光学成像具有衍射限制现象以来，物理学界就公认，显微镜的分辨率具有极限，该极限与光源的波长有关。
直到一个多世纪之后，罗马尼亚物理学家Stefan Hell推翻了这一观点。
他是首位不仅从理论上论证了，而且用实验证明了使用光学显微镜能达到纳米级分辨率的科学家。
自从2006年STORM技术和PALM技术问世以来，科技工作者就一直在不断努力，对它们进行改进、完善和提升。
新技术比以往所有光学3D成像技术的分辨率都要高出10倍，使以前很多看起来不可能的事情现在都变得可能了，对于蛋白质的分析研究有非常重要的意
义。
蛋白质芯片技术
蛋白质芯片原理是对固相载体进行特殊的化学处理，再将已知的蛋白分子产物固定其上（如酶、抗原、抗体、受体、配体、细胞因子等），根据这些生物分子的特性，捕获能与之特异性结合的待测蛋白（存在于血清、血浆、淋巴、间质液、尿液、渗出液、细胞溶解液、分泌液等），经洗涤、纯化，再进行确认和生化分析；它为获得重要生命信息（如未知蛋白组分、序列。
体内表达水平生物学功能、与其他分子的相互调控关系、药物筛选、药物靶位的选择等）提供有力的技术支持。
蛋白分离鉴定技术
基于色谱技术的二维色谱(2D-LC)、二维毛细管电泳(2D-CE)、液相色谱－毛细管电泳(LC-CE) 等新型分离技术，基于质谱技术的质谱鸟枪法(Shot-gun)、毛细管电泳-质谱联用(CE-MS)等新技术都可以在蛋白分离鉴定上发挥重要作用。
华东师范大学
张佳舜
51151300095。