(优选)实验动物肝脏提取
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大鼠肝星状细胞分离与培养方法的实验
青链霉素
防止细菌污染。
EDTA
用于螯合金属离子，防止细胞 粘附。
02
实验操作流程
大鼠肝星状细胞分离
准备器材
麻醉大鼠
包括手术器械、注射器、离心管、细胞筛 等。
使用戊巴比妥钠麻醉大鼠，并将其固定在 操作台上。
解剖大鼠
细胞分离
切开大鼠腹腔，暴露肝脏，并小心分离出 肝组织。
将肝组织剪成小块，放入含有消化酶的离 心管中，震荡孵育，然后离心，弃去上清 液，获得肝星状细胞。
大鼠肝星状细胞分离与培养方法的 实验
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目 录
• 实验准备 • 实验操作流程 • 实验数据分析 • 实验结论与讨论 • 参考文献与致谢
01
实验准备
实验材料准备
大鼠
健康雄性SD大鼠，体重100-150g。
细胞培养瓶
T25或T75培养瓶，用于细胞培养。
解剖器械
手术刀、手术剪、镊子、血管钳等。
细胞周期分析
通过分析细胞的周期分布，可以了解细胞增殖和凋亡的平衡状态。可以使用 DNA含量测定、细胞计数等方法进行测定。
04
实验结论与讨论
结论概述
实验成功分离出大鼠解析
采用酶消化和贴壁培养方法，成功分离出高纯度的肝星状细胞。
细胞形态完整，活性良好，可用于后续实验。
参考文献2
作者2, 等. (2015). 改进的 大鼠肝星状细胞分离与培 养方法. 生物医学工程学 杂志, 32(1), 120-126.
参考文献3
作者3, 等. (2018). 大鼠肝 星状细胞的体外培养及药 物干预研究. 中国实验动 物学报, 26(5), 635-641.
致谢
感谢实验室的老师和同学们在 实验设计和操作过程中的指导 和帮助。
肝脏蛋白的提取和浓度测定.
考马斯亮兰能与蛋白质的疏水微区相结合，这种 结合具有高敏感性，考马斯亮兰G-250的最大光吸收峰 在465nm，当它与蛋白质结合形成复合物时，其最大 吸收峰改变为595nm。在595nm下，光密度与蛋白质 含量呈线性关系，故可以用于蛋白质含量的测定。
实验步骤
1. 取试管7支，编号，按下表加入试剂:
为准
2.蛋白的浓度测定
考马斯亮蓝法 BCA法 紫外吸收法 Lowry法(Folin-酚试剂法) 双缩脲法
2.蛋白的浓度测定-考马斯亮蓝法
1976 年 由 Bradford 建 立 的 考 马 斯 亮 兰 法 （Bradford法），具有超过其他几种方法的突出优点， 因而正在得到广泛的应用。
1.肝脏组织的提取
组织取材
操作 步骤
超声匀浆 冰上放置 4度离心
吸取上清
1.肝脏组织的提取
（1）组织取材：
取约100mg大鼠 肝脏组织，用灭菌 的剪刀将组织块尽 量剪碎，放入1.5ml 灭菌的EP管中
1.肝脏组织的提取
（2）超声匀浆：
加0.5mlRIPA裂解 液（含50ulPMSF）, 置于冰上，用超声匀 浆器进行匀浆,超声 每次10秒，重复3次管号 空白管标准管
试剂(ml)
0
1 234 5
1mg/mL牛血清
白蛋白溶液
蒸馏水 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0
待测样品 – –
–
–––
考马斯亮蓝 5
5 5 55
5
G250
测定管 6
0 0 1 5
2. 混匀, 室温放置2 min。在波长 595nm 处以0号管
调零，测定各管吸光度值。
14
实验步骤
1. 取试管7支，编号，按下表加入试剂:
为准
2.蛋白的浓度测定
考马斯亮蓝法 BCA法 紫外吸收法 Lowry法(Folin-酚试剂法) 双缩脲法
2.蛋白的浓度测定-考马斯亮蓝法
1976 年 由 Bradford 建 立 的 考 马 斯 亮 兰 法 （Bradford法），具有超过其他几种方法的突出优点， 因而正在得到广泛的应用。
1.肝脏组织的提取
组织取材
操作 步骤
超声匀浆 冰上放置 4度离心
吸取上清
1.肝脏组织的提取
（1）组织取材：
取约100mg大鼠 肝脏组织，用灭菌 的剪刀将组织块尽 量剪碎，放入1.5ml 灭菌的EP管中
1.肝脏组织的提取
（2）超声匀浆：
加0.5mlRIPA裂解 液（含50ulPMSF）, 置于冰上，用超声匀 浆器进行匀浆,超声 每次10秒，重复3次管号 空白管标准管
试剂(ml)
0
1 234 5
1mg/mL牛血清
白蛋白溶液
蒸馏水 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0
待测样品 – –
–
–––
考马斯亮蓝 5
5 5 55
5
G250
测定管 6
0 0 1 5
2. 混匀, 室温放置2 min。在波长 595nm 处以0号管
调零，测定各管吸光度值。
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实验动物肝脏提取详解演示文稿
➢ 为了防止DNA酶的降解，提取时可加入 适量EDTA（乙二胺四乙酸）、柠檬酸， 以降低DNA酶的活性。
➢ 加入RNA酶降解剩余的RNA，获得纯的 DNA。
➢ 保 存 ： 将 DNA 于 滤 纸 上 干 燥 ， 溶 于 1mlTE中低温保存。
（二）琼脂糖凝胶电泳分离核酸的原理：
琼脂糖凝胶电泳是用琼脂糖凝胶作为支持介质的一种 电泳分离方法，是一种简便、快速分离鉴定核酸的方 法，已成为分子生物学及基因工程研究中常用实验方 法之一。 琼脂糖英文名agarose，是从琼脂中提取出来的，由 半乳糖和3.6-脱水-L- 半乳糖相互结合的链状多糖。琼 脂糖和琼脂都可在不同浓度的水溶液下可形成多孔的 凝胶，电泳中具有分子筛效应。但琼脂糖含硫酸根比 琼脂少，电渗作用降低，因而分离效果明显提高。
因此，琼脂糖凝胶电泳已成为分子生物学及基因工程研究 中常用实验方法之一， DNA样本的分离、纯化、鉴定以及相 对分子质量测定常用琼脂糖凝胶电泳。
荧光染料EB染色 后，在紫外灯 (λ305nm)下观察 到的电泳结果：
* 荧光染料EB染色的原理和优点是什么？
1、原理：
EB： 即 3 , 8 - 二 氨 基 -5 - 乙 基 - 6 - 苯 基 菲锭 溴 盐 (Ethidium Bromide)。 EB是一种扁平分子，它可以嵌 入核酸的碱基之间，在紫外线激发下，发出红橙色荧 光。
超声波处理法：借助超声波的振动力破碎细胞 壁和细胞器。使用时注意降温，防止过热。
冷热交替法：在90℃左右维持数分钟，立即放 入冰浴中使之冷却，如此反复多次，绝大部分 细胞可以被破碎。
有机溶剂处理法：利用氯仿、甲苯等脂溶性溶 剂或SDS（十二烷基硫酸钠）等表面活性剂处 理细胞，可将细胞膜溶解，从而使细胞破裂， 此法也可以与研磨法联合使用。
实验一 动物肝脏组织中基因组DNA提取和鉴定-精
本实验旨在学习并掌握用高盐法从动物肝脏组织中提取基因组DNA的方法及其原理。首先介绍了核酸的分类，主要存在于细胞核的染色体中的DNA和存在于细胞质中的RNA，以及它们的理化性质。随后详细阐述了基因组DNA的提取方法，包括浓盐法、离子去污剂法和苯酚抽提法，并列举了核酸提取的主要步骤，如破碎细胞、去除鸡肝、研磨、离心、加入SDS溶液震荡、氯仿:异戊醇溶液处理等步骤，最终通过加入95%乙醇溶液沉淀出DNA。此外，还介绍了DNA电泳检测的步骤，包括制备琼脂糖凝胶、拔出梳子、加样电泳等。通过本实验，可以成功提取并鉴定动物肝脏组织中的基因组DNA。
[原创]动物类中药提取方法
![[原创]动物类中药提取方法](https://img.taocdn.com/s3/m/778445a668dc5022aaea998fcc22bcd126ff42c5.png)
动物类中药提取方法我国应用动物药历史悠久。
远在4000年前甲骨文中就记载了蛇、麝、犀牛等40余种药用动物，最早的本草专著《神农本草经》中收载了僵蚕、地龙等动物药67种，对其应用及疗效亦有明确记载。
《本草纲目》中动物药增至440种。
近代《中国药用动物志》更是收载动物药多达1581种，临床各科广为使用。
动物药是中药的重要组成部分,近十年来,动物药的临床和药理研究日益受重视,而且在活性成分的研究方面也获得迅速发展。
但由于动物药化学成分复杂，大多为大分子化合物，分离分析难度较植物药大，与植物药活性成分的研究相比已远远落后。
然而，由于其生物活性强、临床疗效高、含量丰富等特点又激励人们不懈地去探索动物药的药效物质基础和开发利用前景。
经研究表明，动物药中的化学成分包括蛋白质、多肽及氨基酸类、生物碱类、多糖类、甾体类、萜类、酚、酮、酸类等多种化学成分。
因此对于动物药的提取，可根据不同成分的性质，采用不同的提取方法。
1 蛋白质、多肽及氨基酸类提取氨基酸、多肽、蛋白质广泛存在于动物类中药,是动物药中普遍存在的化合物,这些成分以往常被认为无药理作用,属于无效成分或有毒成分。
近年来的研究得知,许多蛋白质和多肽是动物药中的有效成分,动物药中的蛋白质和多肽成分研究也渐被人们重视。
大部分蛋白质可溶于水、稀盐、稀酸或稀碱溶液中，少数与脂类结合的蛋白质溶于乙醇、丙酮及丁醇等有机溶剂中。
另外，每个氨基酸都有其固有化学特性，导致不同的多肽因其组成不同而具有不同的溶解性。
因此对于不同的蛋白质、多肽及氨基酸的可采用不同溶剂提取、分离及纯化。
蛋白质的提取一般常采用各种水溶液，为防止原料中可能存在的酸或碱的影响，常用pH缓冲液提取。
蛋白质氨基酸的提取一般是将蛋白质经酸、碱或酶水解后，分离得到各种氨基酸；天然游离的氨基酸的常采用水或稀醇等极性溶剂进行提取。
为了尽可能的提取完全，常需要对一些动物药进行细胞破碎，使其蛋白质、多肽及氨基酸释放出来进入提取溶剂中，以达到的提取的目的。
优选医学形态学实验课
优选医学形态学实验课
5.鼠笼及垫料需要每周更换１－２次，用过的鼠笼必
须及时清洗干净。
6.如有死亡动物，应及时报告并按规定处理实验室打扫干净，关好门窗和水电后 方可离开实验室。
形态学实验（一）
实验主要内容
➢小白鼠的捉拿与固定、注射方法 ➢动物麻醉及正确使用手术器械方法 ➢肝硬化模型制备方法 ➢解剖小白鼠并观察腹腔脏器及解剖位置 （重点观察胆总管）
• 给药时间：腹腔注射２次/周，共4周，最后 一次给药24h之后处死并取材。
• 药物剂量：20% CCl4 0.1ml/20g • 特点：成功率高、方法成熟，但动物个体
差异较大。
CCl4 : 橄榄油＝１:４ 即20％的CCl4注射
CCl4注射后肝脏变化
正常小白鼠肝脏
注射CCl4一个月后
正常组
CCL4 组
正确持镊法
正确持镊是用拇指对 食指与中指。
(1)正确持镊
(2)错误持镊
缝针
➢ 缝针是用于各种组织缝合 的器械，它由三个基本部 分组成，即针尖，针体和 针眼。
➢ 圆针：弧度大者多用于深 部组织及软组织。
➢ 三角针：前半部为三棱形， 较锋利，用于缝合皮肤、 软骨、韧带等坚韧组织， 损伤性较大。
➢ 铲头针：临床较少用。
CCL4 组
结扎胆总管肝硬化模型
固定
备皮
消毒
切开 皮肤
切开 腹膜
正常人体胆总管解剖
小白鼠胆总管位置
剑突
肝脏
胆总管
十二指肠 上动脉
十二指肠
结扎胆总管
进腹后提出十二指肠，近十二指肠处游离胆总管，两端丝线结扎
切断胆总管、缝合
结扎胆总管手术过程
Curr Protoc Toxicol. 2012 May;Chapter 23:Unit 23.1
5.鼠笼及垫料需要每周更换１－２次，用过的鼠笼必
须及时清洗干净。
6.如有死亡动物，应及时报告并按规定处理实验室打扫干净，关好门窗和水电后 方可离开实验室。
形态学实验（一）
实验主要内容
➢小白鼠的捉拿与固定、注射方法 ➢动物麻醉及正确使用手术器械方法 ➢肝硬化模型制备方法 ➢解剖小白鼠并观察腹腔脏器及解剖位置 （重点观察胆总管）
• 给药时间：腹腔注射２次/周，共4周，最后 一次给药24h之后处死并取材。
• 药物剂量：20% CCl4 0.1ml/20g • 特点：成功率高、方法成熟，但动物个体
差异较大。
CCl4 : 橄榄油＝１:４ 即20％的CCl4注射
CCl4注射后肝脏变化
正常小白鼠肝脏
注射CCl4一个月后
正常组
CCL4 组
正确持镊法
正确持镊是用拇指对 食指与中指。
(1)正确持镊
(2)错误持镊
缝针
➢ 缝针是用于各种组织缝合 的器械，它由三个基本部 分组成，即针尖，针体和 针眼。
➢ 圆针：弧度大者多用于深 部组织及软组织。
➢ 三角针：前半部为三棱形， 较锋利，用于缝合皮肤、 软骨、韧带等坚韧组织， 损伤性较大。
➢ 铲头针：临床较少用。
CCL4 组
结扎胆总管肝硬化模型
固定
备皮
消毒
切开 皮肤
切开 腹膜
正常人体胆总管解剖
小白鼠胆总管位置
剑突
肝脏
胆总管
十二指肠 上动脉
十二指肠
结扎胆总管
进腹后提出十二指肠，近十二指肠处游离胆总管，两端丝线结扎
切断胆总管、缝合
结扎胆总管手术过程
Curr Protoc Toxicol. 2012 May;Chapter 23:Unit 23.1
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（优选）实验动物肝脏提取
（一）动物肝脏DNA制备原理
要获得纯的DNA样品，必须考虑以下几点： ➢ 如何选材，如何破碎组织细胞？ ➢ 如何除去蛋白质？(在真核细胞内，DNA与蛋白质结合成核
蛋白的形式存在。因此，分离DNA时必须使其与蛋白质解离，并除 去蛋白质。)
➢ 设法除去RNA的污染； ➢ 防止DNA酶的降解作用；
超声波处理法：借助超声波的振动力破碎细胞 壁和细胞器。使用时注意降温，防止过热。
冷热交替法：在90℃左右维持数分钟，立即放 入冰浴中使之冷却，如此反复多次，绝大部分 细胞可以被破碎。
有机溶剂处理法：利用氯仿、甲苯等脂溶性溶 剂或SDS（十二烷基硫酸钠）等表面活性剂处 理细胞，可将细胞膜溶解，从而使细胞破裂， 此法也可以与研磨法联合使用。
激发的荧光的能量来源于两个方面：一是核酸吸 收260nm的紫外线后将能量传递给EB，二是EB本身吸收 302nm和360nm的紫外线的能量。这两方面的能量最终 激发EB发射波长为590nm的可见光（红橙区）。
因此，琼脂糖凝胶电泳已成为分子生物学及基因工程研究 中常用实验方法之一， DNA样本的分离、纯化、鉴定以及相 对分子质量测定常用琼脂糖凝胶电泳。
荧光染料EB染色 后，在紫外灯 (λ305nm)下观察 到的电泳结果：
* 荧光染料EB染色的原理和优点是什么？
1、原理：
EB： 即 3 , 8 - 二 氨 基 -5 - 乙 基 - 6 - 苯 基 菲锭 溴 盐 (Ethidium Bromide)。 EB是一种扁平分子，它可以嵌 入核酸的碱基之间，在紫外线激发下，发出红橙色荧 光。
DNA分子在pH高于其等电点的溶液中带负电荷，在电 场中向正极移动（电荷效应） 。 DNA分子泳动速率的大小除与DNA分子的带电量有关 外，还与DNA分子的大小和空间构象有关（琼脂糖凝胶 的分子筛效应）。 电泳时，用溴酚蓝做前沿指示剂，用溴化乙啶 （ethidium bromide，EB） 指示DNA样品在凝胶中的 确切位置。 溴化乙啶是一种荧光染料，可插入DNA双螺旋结构的 两个碱基对之间，与DNA分子形成络合物，在紫外光的 激发下发出橙黄色的荧光。
压榨法：在1000×105Pa—2000×105Pa 的高压下使 几十毫升的细胞悬液通过一个小孔突然释放至常压，细 胞将彻底破碎。温和的、彻底破碎细胞的方法，但仪器 费用较高。
细胞破碎方法—机械物理法
反复冻融法：将待破碎的细胞冷至－15℃到－ 20℃，然后放于室温(或40℃)迅速融化，由于 细胞内形成冰粒使剩余胞液的盐浓度增高而引 起细胞溶胀破碎。
利用这一性质可将脱氧核糖核蛋白与绝大部分核糖核蛋 白分离开来。
➢ 用氯仿一异戊醇混合液振荡核蛋白溶液，使蛋白质变性， 然后离心除去变性蛋白质，此时蛋白质凝胶停留在水相 及氯仿相中间，而DNA溶于上层水相。用两倍体积 95 ％乙醇溶液可将DNA钠盐沉淀出来。
➢ 用十二烷基硫酸钠（SDS）等去污剂使蛋白质变性，可 以直接从生物材料中提取DNA。
➢ 为了防止DNA酶的降解，提取时可加入 适量EDTA（乙二胺四乙酸）、柠檬酸， 以降低DNA酶的活性。
➢ 加入RNA酶降解剩余的RNA，获得纯的 DNA。
➢ 保 存 ： 将 DNA 于 滤 纸 上 干 燥 ， 溶 于 1mlTE中低温保存。
（二）琼脂糖凝胶电泳分离核酸的原理：
琼脂糖凝胶电泳是用琼脂糖凝胶作为支持介质的一种 电泳分离方法，是一种简便、快速分离鉴定核酸的方 法，已成为分子生物学及基因工程研究中常用实验方 法之一。 琼脂糖英文名agarose，是从琼脂中提取出来的，由 半乳糖和3.6-脱水-L- 半乳糖相互结合的链状多糖。琼 脂糖和琼脂都可在不同浓度的水溶液下可形成多孔的 凝胶，电泳中具有分子筛效应。但琼脂糖含硫酸根比 琼脂少，电渗作用降低，因而分离效果明显提高。
（3）不同大小的DNA需要用不同浓度的琼脂糖凝胶进行电泳
分离。
琼脂糖浓度
/%
0.3
0.6
0.7
0.9
1.2 1.5
2.0
线状DNA大小/kb 60-5 20-1 10-0.8 7-0.5 6-0.4 3-
0.2 2-0.1
琼脂糖凝胶电泳具有以下优点：
（1）操作简单、制备容易快速、凝胶机械性能好、电泳速度 快、分离DNA片段范围广、样品不需事先处理就可以进行电 泳。 （2）凝胶结构均匀，对样品吸附小，电泳图谱清晰，分辨率 高，重复性好。 （3）琼脂糖透明无紫外吸收，电泳过程和结果可直接用紫外 光检测及定量测定。 （4）电泳后区带易染色，样品极易洗脱，便于定量测定。制 成干膜可长期保存。
要提取动物组织DNA，一般选择 细胞膜较脆弱，容易破碎的动物脏 器，如胸腺、肝脏、脾脏、胰脏等。
细胞破碎方法—机械物理法：
研磨：将剪碎的动物组织置于研钵或匀浆器中，加入少 量石英砂研磨或匀浆，破碎细胞。这种方法温和，适合 实验室使用。
组织捣碎器：较剧烈的破碎细胞的方法，为了防止发热 和升温过高，通常是转10秒—20秒，停10秒—20秒， 可反复多次。
荧光来自两方面，一是核酸吸收260nm的紫外光， 并将能量传给EB；二是EB本身吸收波长为302nm 和360nm的紫外光。这两方面的能量最终激发EB发 出波长为590nm的红橙色荧光。
溴化乙啶可加入凝胶中，也可以在电泳后，将凝胶 放在含EB的溶液中浸泡.
溴化乙啶检测DNA的灵敏度很高，可检出10ng甚至 更少的DNA。
溶胀法：细胞膜为天然的半透膜，在低渗溶液 和低浓度的稀盐溶液中，由于存在渗透压差， 溶剂分子大量进入细胞，将细胞膜胀破释放出 细胞内含物。
ห้องสมุดไป่ตู้
脱氧核糖核蛋白在浓NaCl（1-2mol／L）溶液中
溶解度很大，但在0.14mol／L NaCl溶液中溶解度很
低，而核糖核蛋白则溶于0.14mol／L NaCl溶液中，
琼脂糖凝胶电泳分离核酸的影响因素
（1）核酸大小与琼脂糖凝胶电泳分离的关系
凝胶中，DNA片段迁移率与DNA分子大小(碱基对的对数)成反比(≤ 20kb) ，因此通过已知大小的标准物移动的距离与未知片段的移动距离 时行比较，便可测出未知片段的大小。
（2）核酸构型与琼脂糖凝胶电泳分离的关系
不同构型DNA的移动速度次序为：闭环DNA>直线DNA>开环的双链环 状DNA.
（一）动物肝脏DNA制备原理
要获得纯的DNA样品，必须考虑以下几点： ➢ 如何选材，如何破碎组织细胞？ ➢ 如何除去蛋白质？(在真核细胞内，DNA与蛋白质结合成核
蛋白的形式存在。因此，分离DNA时必须使其与蛋白质解离，并除 去蛋白质。)
➢ 设法除去RNA的污染； ➢ 防止DNA酶的降解作用；
超声波处理法：借助超声波的振动力破碎细胞 壁和细胞器。使用时注意降温，防止过热。
冷热交替法：在90℃左右维持数分钟，立即放 入冰浴中使之冷却，如此反复多次，绝大部分 细胞可以被破碎。
有机溶剂处理法：利用氯仿、甲苯等脂溶性溶 剂或SDS（十二烷基硫酸钠）等表面活性剂处 理细胞，可将细胞膜溶解，从而使细胞破裂， 此法也可以与研磨法联合使用。
激发的荧光的能量来源于两个方面：一是核酸吸 收260nm的紫外线后将能量传递给EB，二是EB本身吸收 302nm和360nm的紫外线的能量。这两方面的能量最终 激发EB发射波长为590nm的可见光（红橙区）。
因此，琼脂糖凝胶电泳已成为分子生物学及基因工程研究 中常用实验方法之一， DNA样本的分离、纯化、鉴定以及相 对分子质量测定常用琼脂糖凝胶电泳。
荧光染料EB染色 后，在紫外灯 (λ305nm)下观察 到的电泳结果：
* 荧光染料EB染色的原理和优点是什么？
1、原理：
EB： 即 3 , 8 - 二 氨 基 -5 - 乙 基 - 6 - 苯 基 菲锭 溴 盐 (Ethidium Bromide)。 EB是一种扁平分子，它可以嵌 入核酸的碱基之间，在紫外线激发下，发出红橙色荧 光。
DNA分子在pH高于其等电点的溶液中带负电荷，在电 场中向正极移动（电荷效应） 。 DNA分子泳动速率的大小除与DNA分子的带电量有关 外，还与DNA分子的大小和空间构象有关（琼脂糖凝胶 的分子筛效应）。 电泳时，用溴酚蓝做前沿指示剂，用溴化乙啶 （ethidium bromide，EB） 指示DNA样品在凝胶中的 确切位置。 溴化乙啶是一种荧光染料，可插入DNA双螺旋结构的 两个碱基对之间，与DNA分子形成络合物，在紫外光的 激发下发出橙黄色的荧光。
压榨法：在1000×105Pa—2000×105Pa 的高压下使 几十毫升的细胞悬液通过一个小孔突然释放至常压，细 胞将彻底破碎。温和的、彻底破碎细胞的方法，但仪器 费用较高。
细胞破碎方法—机械物理法
反复冻融法：将待破碎的细胞冷至－15℃到－ 20℃，然后放于室温(或40℃)迅速融化，由于 细胞内形成冰粒使剩余胞液的盐浓度增高而引 起细胞溶胀破碎。
利用这一性质可将脱氧核糖核蛋白与绝大部分核糖核蛋 白分离开来。
➢ 用氯仿一异戊醇混合液振荡核蛋白溶液，使蛋白质变性， 然后离心除去变性蛋白质，此时蛋白质凝胶停留在水相 及氯仿相中间，而DNA溶于上层水相。用两倍体积 95 ％乙醇溶液可将DNA钠盐沉淀出来。
➢ 用十二烷基硫酸钠（SDS）等去污剂使蛋白质变性，可 以直接从生物材料中提取DNA。
➢ 为了防止DNA酶的降解，提取时可加入 适量EDTA（乙二胺四乙酸）、柠檬酸， 以降低DNA酶的活性。
➢ 加入RNA酶降解剩余的RNA，获得纯的 DNA。
➢ 保 存 ： 将 DNA 于 滤 纸 上 干 燥 ， 溶 于 1mlTE中低温保存。
（二）琼脂糖凝胶电泳分离核酸的原理：
琼脂糖凝胶电泳是用琼脂糖凝胶作为支持介质的一种 电泳分离方法，是一种简便、快速分离鉴定核酸的方 法，已成为分子生物学及基因工程研究中常用实验方 法之一。 琼脂糖英文名agarose，是从琼脂中提取出来的，由 半乳糖和3.6-脱水-L- 半乳糖相互结合的链状多糖。琼 脂糖和琼脂都可在不同浓度的水溶液下可形成多孔的 凝胶，电泳中具有分子筛效应。但琼脂糖含硫酸根比 琼脂少，电渗作用降低，因而分离效果明显提高。
（3）不同大小的DNA需要用不同浓度的琼脂糖凝胶进行电泳
分离。
琼脂糖浓度
/%
0.3
0.6
0.7
0.9
1.2 1.5
2.0
线状DNA大小/kb 60-5 20-1 10-0.8 7-0.5 6-0.4 3-
0.2 2-0.1
琼脂糖凝胶电泳具有以下优点：
（1）操作简单、制备容易快速、凝胶机械性能好、电泳速度 快、分离DNA片段范围广、样品不需事先处理就可以进行电 泳。 （2）凝胶结构均匀，对样品吸附小，电泳图谱清晰，分辨率 高，重复性好。 （3）琼脂糖透明无紫外吸收，电泳过程和结果可直接用紫外 光检测及定量测定。 （4）电泳后区带易染色，样品极易洗脱，便于定量测定。制 成干膜可长期保存。
要提取动物组织DNA，一般选择 细胞膜较脆弱，容易破碎的动物脏 器，如胸腺、肝脏、脾脏、胰脏等。
细胞破碎方法—机械物理法：
研磨：将剪碎的动物组织置于研钵或匀浆器中，加入少 量石英砂研磨或匀浆，破碎细胞。这种方法温和，适合 实验室使用。
组织捣碎器：较剧烈的破碎细胞的方法，为了防止发热 和升温过高，通常是转10秒—20秒，停10秒—20秒， 可反复多次。
荧光来自两方面，一是核酸吸收260nm的紫外光， 并将能量传给EB；二是EB本身吸收波长为302nm 和360nm的紫外光。这两方面的能量最终激发EB发 出波长为590nm的红橙色荧光。
溴化乙啶可加入凝胶中，也可以在电泳后，将凝胶 放在含EB的溶液中浸泡.
溴化乙啶检测DNA的灵敏度很高，可检出10ng甚至 更少的DNA。
溶胀法：细胞膜为天然的半透膜，在低渗溶液 和低浓度的稀盐溶液中，由于存在渗透压差， 溶剂分子大量进入细胞，将细胞膜胀破释放出 细胞内含物。
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脱氧核糖核蛋白在浓NaCl（1-2mol／L）溶液中
溶解度很大，但在0.14mol／L NaCl溶液中溶解度很
低，而核糖核蛋白则溶于0.14mol／L NaCl溶液中，
琼脂糖凝胶电泳分离核酸的影响因素
（1）核酸大小与琼脂糖凝胶电泳分离的关系
凝胶中，DNA片段迁移率与DNA分子大小(碱基对的对数)成反比(≤ 20kb) ，因此通过已知大小的标准物移动的距离与未知片段的移动距离 时行比较，便可测出未知片段的大小。
（2）核酸构型与琼脂糖凝胶电泳分离的关系
不同构型DNA的移动速度次序为：闭环DNA>直线DNA>开环的双链环 状DNA.