微生物实验全

微生物学实验

兰州大学生命科学学院

微生物研究所

一.显微镜的使用细菌的单染色

二.革兰氏染色法

三.细菌的芽孢染色法

四.酵母菌形态观察及死活鉴定微生物显微镜

直接计数法

五.培养基的配制及干、湿热灭菌法

六.微生物的分离与纯化

七.微生物培养特征的观察

八.微生物平板菌落计数法

九.大分子物质的水解试验

十.糖发酵试验

十一. IMViC试验

十二.实验综合技能测试

目录

微生物学实验卡

注意事项：1.本实验课选用统编教材15个实验内容，学时共计36学时。

2.本卡为便于学生预习，搞好平时考核而设计，所以学生必须妥善保存，学期结束交回，以作实验平时的考核参考。

3.学生每次上课时必须随身携带本卡，试验每次结束后，老师签字后方能离开

微生物学实验课考核卡

级班20年月日

显微镜的使用

细菌的单染色

实验一

一、实验目的与要求:

1.学习并掌握油镜的使用方法

2.学习并掌握对细菌进行进行涂片

染色的技术

3.学习无菌操作技术

二、实验原理

1.显微镜的结构

普通光学显微镜的构造可分为两大部分：一为机械装置，一为光学系统，这两部分很好的配合，才能发挥显微镜的作用。

光学显微镜的构造

1. 物镜转换器

2. 接物镜

3.游标卡尺

4.载物台

5.聚光器

6. 彩虹光阑

7.光源

8. 镜座

9. 电源开关10. 光源滑动变阻器11. 粗调螺旋12. 微调螺旋13. 镜臂14.镜筒15.目镜16.标本移动螺旋

2.油镜的使用

油镜，即油浸接物镜。当光线由反光镜通过玻片与镜头之间的空气时，由于空气与玻片的密度不同，使光线受到曲折，发生散射，降低了视野的照明度。

加入中间的介质是一层香柏油（其折射率与玻片的相近），则几乎不发生折射，增加了视野的进光量，从而使物象更加清晰。

3.单染色法

是用一种染料使细菌着色以显示其形态，不能辨别细菌细胞的构造，通常采用碱性染料（如美蓝、结晶紫、碱性复红等）使其着色。

当在中性、弱碱性、弱酸性溶液中，细菌细胞通常带负电荷。而碱性染料在电离时，其分子的染色部分带正电荷，因此碱性染料的染色部分很容易与细菌结合使细菌着色。

三、材料仪器

1.仪器：显微镜、酒精灯等

2.实验材料：

菌种：枯草芽孢杆菌

四联球菌

染色剂：齐氏石碳酸复红染液

碱性美兰染液

四、内容及方法

（一）、显微镜的使用（主要是油镜）

1.用前检查：

零件是否齐全，镜头是否清洁。

2.调节光亮度

3.低倍镜观察：粗调、细调

4.依次再进行中倍、高倍观察

5.油镜观察：高倍镜下找到清晰的物象

后，提升聚光镜，在标本中央滴一滴

香柏油，使油镜镜头浸入香柏油中，

细调至看清物象为止。

6.换片：另换新片，必须从第三条开始

操作。

7.用后复原：观察完毕，上悬镜筒，

先用擦镜纸擦去镜头上的油，然后再

用擦镜纸沾取少量洗液（无水乙醇∶

无水乙醚＝７∶３）擦去残留的

油，最后用擦镜纸擦去残留的洗液，

后将镜体全部复原。

显微镜保养和使用中的注意事项：

1.不准擅自拆卸显微镜的任何部件,以免损坏。

2.镜面只能用擦镜纸擦，不能用手指或

粗布，以保证光洁度 3.观察标本时，必须依次用低、中、高

倍镜，最后用油镜。当目视接目镜

时，特别在使用油镜时，切不可使用

粗调节器，以免压碎玻片或损伤镜面。

4.观察时，两眼睁开，养成两眼能够

轮换观察的习惯，以免眼睛疲劳，

并且能够在左眼观察时，右眼注视

绘图。

5.拿显微镜时，一定要右手拿镜臂，左

手托镜座，不可单手拿，更不可倾

斜拿。

6.显微镜应存放在阴凉干燥处，以免镜

片滋生霉菌而腐蚀镜片。

（二）、单染色的方法：

染色的流程图：

涂片干燥固定染色

水洗晾干镜检

1.先将载玻片洗净，擦干。

2.涂片：取干净载玻片一块，在载玻片中央加一滴蒸馏水，按无菌操作法取大肠杆菌涂片，做成浓菌液，注意取菌不要太多。

3.晾干：让涂片自然晾干或者在酒精灯火焰上方文火烘干。

4.固定：手执玻片一端，让菌膜朝上，通过火焰2-3次固定（以不烫手为宜）。

5.染色：将固定过的涂片放在废液缸上的

搁架上，加复红染色1-2min。

6.水洗：用水洗去涂片上的染色液。

7.干燥：将洗过的涂片放在空气中晾干或用吸水纸吸干。

8.镜检：先低倍观察，再高倍观察，并找出适当的视野后，将高倍镜转出，在涂片上加香柏油一滴，将油镜头浸入油滴中仔细调焦观察细菌的形态。

1.涂片不可太厚

2.固定时不能在火上烤的时间太长，否则菌体收缩变形

3.染色后必须晾干后才能用油镜镜检

染色中注意事项：

五、示教：

1.油镜的使用

2.无菌操作

3.涂片染色

六、实验结果：

绘制所观察到的细菌形态

七、思考题：

1.用油镜观察时应注意哪些问题？在载玻片和镜头之间滴加什么油？起什么作用？

2.试列表比较低背景、高倍镜及油镜各方面的差异。为什么在使用高倍镜及油镜时应特别注意避免粗调节器的误操作？

3.为什么要求制片完全干燥后才能用油镜观察？

革兰氏染色法

一、实验目的与要求:

1、了解革兰氏染色法的原理及其

在细菌分类鉴定中的重要性

2、学习并掌握革兰氏染色法

二、实验原理：

革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家C.Gram所创立的。革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G—）两大类，是细菌学上最常用的鉴别染色法。该染色法所以能将细菌分为G+菌和G—菌，是由这两类菌的细胞壁结构和成分的不同所决定的。

G-菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂质，而且肽聚糖层较薄、交联度低，故用乙醇脱色时溶解了类脂质，增加了细胞壁的通透性，使初染的结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经复红复染后就成红色。

G+菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小，通透性降低，因此细菌仍保留初染时的颜色。

三、实验仪器及材料

1.仪器：显微镜、酒精灯等

2.实验材料：

菌种：枯草杆菌、大肠杆菌

染色剂：草酸铵结晶紫染液、碘液、

番红、95%乙醇

四、内容与方法

1.涂片

2.晾干

3.固定

4.结晶紫染色：将玻片置于废液缸玻片搁架上，加适量（以盖满细菌涂面）的结晶紫染色液染色1分钟；水洗：倾去染色液，用水小心地冲洗。

5.媒染：碘液，媒染1min；水洗：用水洗

去碘液。

6.脱色：将玻片倾斜，连续滴加95%乙醇脱

色10s至流出液无色，立即水洗。

7.复染：滴加番红复染1min；

8.水洗：用水洗去涂片上的番红染色液。

9.晾干：将染好的涂片用吸水纸吸干。

10.镜检：镜检时先用低倍，再用高倍，最

后用油镜观察，并判断菌体的革兰氏染

色反应性。

革兰氏染色流程图

涂片结晶紫染色

碘液媒染水洗酒精脱色

水洗番红染色水洗晾干

镜检

1分钟

1分钟

10秒

1分钟

水洗

注意事项：

1.革兰氏染色成败的关键是酒精脱色。如脱色过度，革兰氏阳性菌也可被脱色而染成阴性菌；如脱色时间过短，革兰氏阴性菌也会被染成革兰氏阳性菌。

2.菌龄也有影响。若菌龄太老，由于菌体死亡

或自溶常使革兰氏阳性菌转呈阴性反应。

3.不要涂片太厚，会造成假阴性或假阳性。

五、实验结果：

紫色菌：革兰氏阳性菌

红色菌：革兰氏阴性菌

六、思考题

1.你认为哪些环节会影响革兰氏染色结果的正确性？其中最关键的环节是什么？

2.现有一株细菌宽度明显大于大肠杆菌的粗壮杆菌，请你鉴定其革兰氏染色反应，你怎么运用大肠杆菌和金黄色葡萄球菌为对照菌株进行涂片染色，以证明你的染色结果正确。

实验三

细菌芽孢染色法

一、实验目的与要求:

1.学习并掌握芽孢染色法

2.了解芽孢杆菌的形态特征，注意观察芽孢的形态、大小、着生位置

二、实验原理：

用着色力强的染色剂孔雀绿或石炭酸复红，在加热条件下染色，使染料不仅进入菌体也可进入芽孢内，进入菌体的染料经水洗后被脱色，当用对比度大的复染色剂染色后，芽孢仍保留初染剂的颜色，是芽孢和菌体更易区分。

三、材料仪器：

1.仪器：

显微镜、试管、电炉等

2.实验材料：

菌种：枯草芽孢杆菌、膨大芽孢杆菌、

巨大芽孢杆菌

四、内容及方法：

1.制备菌悬液：加1-2滴无菌水于小试管内，用接种环挑取2-3环菌苔于试管内，搅拌均匀，制成浓的菌悬液。

2.染色：加苯酚品红染液10滴于小试管内，并使其与菌液混合均匀，然后将试管置于沸水浴的烧杯中，加热染色5-8分钟。

3.涂片固定：用接种环挑取试管底部菌液数环于洁净载玻片上，涂成薄膜，然后将涂片通过火焰3次温热固定。

4.脱色：95%乙醇脱色，直至流出的水无红色为止。

5.水洗

6.复染：用黑色素染色1-2分钟

7.镜检：干燥后用油镜观察。

五、实验结果

芽孢结果绘图

芽孢菌形态

六、思考题

在芽孢染色中，若因一时疏忽玻片上的染液被烘干，此时能否立刻补加染液？为什么？

实验四

酵母菌的形态观察

微生物显微镜直接计数法

一、目的要求

1.学习自制水浸片法观察酵母菌

2.观察酵母菌形态和出芽生殖方式

3.学习并掌握区分酵母菌死活细胞的染色方法

4.了解血球计数板的构造、计数原理和计数方法，掌握显微镜下直接计数的技能

二、实验原理

1.酵母菌可以用单纯的水制成水浸

片观察，也可以用染色液制成水

浸片观察。

2.测定微生物细胞数量的方法很

多，通常采用的有显微直接计数

法和平板计数法。

血球计数板是一块特制的厚型载玻片，载玻片上有4条槽构成3个平台.中间的平台较宽，其中间又被一短横槽分隔成两半，每个半边上面各有一个计数区。

血球计数板

计数区的刻度有两种：

一种是25×16：计数区分为16个大方格（大方格用三线隔开），而每个大方格又分成25个小方格；

另一种是16×25：一个计数区分成25个大方格（大方格之间用双线分开），而每个大方格又分成16个小方格。

每毫升菌液中的菌数

= ——×25（16）×10×1000×B

A：5个中方格中的酵母菌数

B：稀释倍数

A

5

三、实验材料

1.菌种：啤酒酵母

2.染色液：0.1%吕氏碱性美蓝

3.器材：载玻片，显微镜、血球计数板、盖玻片、吸水纸、计数器、滴管、擦镜纸。（一）.酵母菌个体形态观察

用美兰浸片法观察啤酒酵母个体形态及死活细胞区别

四、内容及方法

1、在载玻片上各滴加一滴染色液和酵母菌培养液，盖上盖玻片，（勿使产生气泡，且不要再移动盖玻片）

2、将制好的水浸片放置3分钟后镜检。先用低倍镜观察，然后换用高倍镜观察酿酒酵母的形态和出芽情况，同时可以根据是否染上颜色来区别死、活细胞。

3、染色半小时后，再观察一下死细胞数是否增加。

4、染色一小时后，再观察一下死细胞数是否增加。

（二）、显微镜直接计数法

1.镜检计数室，熟悉计数器的使用方法

2.对稀释5倍的啤酒酵母悬液进行计数

3.注意：

（1）血球计数板必须洗干净，勿刷

（2）注意勿损坏计数器

计数原则：

1、稀释浓度要合适，每个小方格5-10个

酵母菌

2、压线的酵母菌，一般计上和右

3、对于出芽的菌体，如果芽体超过母体的

一半，算2个菌

五、实验结果

1.酵母个体形态，芽体（绘图）

2.计算死活细胞的比率，说明吕氏碱性美蓝染液浓度和作用时间对死活细胞数的影响

3.计数结果

酵母个体形态

将计数结果填入下表中：

六、思考题

1.在显微镜下，酵母菌有哪些突出的特征区别于一般的细菌？

2.某单位要求知道一种干酵母粉中的活菌存活率，请设计1-2种可行的检测方法。

实验五

培养基配制

及干、湿热灭菌

一.实验目的及要求

1.了解配制培养基的基本原理，掌握配

制方法

2.了解并掌握干、湿热灭菌的原理及方法

二.实验原理

(一)培养基

培养基是人工配制的适合微生物生长繁殖或积累代谢产物的营养物质，用以培养、分离、鉴定、保存各种微生物或积累代谢产物。不同微生物选用不同培养基，但是，不同种类的培养基中，一般应含有水分、碳源、氮源、无机盐、生长因素等。

按照配制培养基的营养物质来源可分为：

⑴天然培养基：利用天然的有机物配制而成的培养基。如：牛肉膏蛋白胨培养基。

⑵半合成培养基：既有天然物质又含化学试剂的培养基称半合成培养基。如马铃薯蔗糖培养基。

⑶合成培养基：采用多种化学试剂配制的，各种成分及其用量都确切知道的培养基。如高氏一号培养基。

根据培养基制成后的物理状态可分为：

⑴液体培养基：呈液体状态的培养基。

⑵固体培养基：外观呈固体状态的培养基。

⑶半固体培养基：将各种营养成份按比例配制成营养液后，加入适量固化剂，处于半固体状态的培养基。

培养基的分类

（二）干、湿热灭菌

干热灭菌是利用高温使微生物细胞内的蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。细胞内的蛋白质凝固性与其本身的含水量有关，在菌体受热时，当环境和细胞内含水量越大，则蛋白质凝固就越快，反之含水量越小，凝固缓慢。

高压蒸汽灭菌是将待灭菌的物品放在一个密闭的加压灭菌锅内，通过加热，使灭菌锅隔套间的水沸腾而产生蒸汽。从而使沸点增高，得到高于100℃的温度。导致菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。

三.材料仪器

1.药品：牛肉膏、蛋白胨、氯化钠、可溶性淀粉、K2HPO4、KH2PO4 、蒸馏水、琼脂、1mol氢氧化钠、花生油、葡萄糖、溴甲酚紫、中性红、乙醇

2.器材：天平、药匙、瓷缸、玻璃棒、电炉、PH试纸、试管、三角瓶、移液管、牛皮纸、棉花、线绳、高压锅。

四.实验内容及方法

1.称量

按照培养基配方，准确称量各成份放于烧杯中。

2.溶解

向上述烧杯中加入所需要的水量，搅拌，加热使其溶解。如是配制固体培养基，在琼脂的熔化过程中，需不断搅拌，并控制火力不要使培养基溢出或烧焦。待完全熔化后，补足所失水分。

培养基的制备过程

称量---溶解----调节pH值----过滤----分装及包扎----灭菌----灭菌后试管摆放斜面

3.调节pH值

用玻璃棒沾少许液体，测量PH值。用氢氧化钠调节PH。

4.过滤

用滤纸或多层纱布过滤，一般无特殊要求可省去。

5.分装及包扎

根据不同的需要，可将制好的培养基分装入试管内（用分装漏斗）或三角瓶内，管（瓶）口塞上棉塞。最后用牛皮纸将棉塞部分包好。

6.灭菌：高压蒸汽灭菌，121 ℃灭菌20分钟。

7.灭菌后试管摆放斜面。

加水至外筒内，被灭菌物品放入内筒。盖上灭菌器盖，拧紧螺旋使之密闭。通电加热，同时打开排气阀门，排净其中冷空气。

待冷空气全部排出后（即水蒸气从排气阀中连续排出时），关闭排气阀。继续加热，待压力表渐渐升至所需压力时(一般是101.53kPa，即15磅/英寸2，温度为121.3℃)，开始计时，维持15-30min。灭菌时间到达后，停止加热，待压力降至零时，慢慢打开排气阀，排除余气，开盖取物。切不可在压力尚未降低为零时突然打开排气阀门，以免灭菌器中液体喷出。高压蒸汽灭菌器使用方法

手提式高压蒸汽灭菌器示意图

作业：

1. 在配制培养基的操作过程中应注意些什么问题？为什么？

2.你配制的高氏一号培养基有沉淀产生吗？说明产生或未产生的原因。

3.高压蒸气灭菌开始之前，为什么要将锅内冷空气排尽？灭菌完毕后，为什么待压力降低为“0”时才能打开排气阀，开盖取物？

实验六—实验八

微生物的分离与纯化

微生物培养特征的观察

微生物的平板菌落计数法

一.实验目的及要求

1.了解微生物分离和纯化的原理

2.掌握倒平板的方法和几种常用的分离纯化接种培养的基本操作技术，掌握微生物的无菌操作技术。

3.了解不同的微生物在固体培养基上的生长特征

4.学习并掌握平板菌落计数的基本原理和方法

二.实验原理

(一)微生物的分离纯化

微生物在自然界中呈混杂状态存在，要获得所需菌种，必须从中进行分离。在保藏菌种时不慎污染时也需予以分离。

分离纯化方法很多，基本原理相似，即将待分离样品进行一定的稀释，并使微生物的细胞（或孢子）尽量以分散状态存在，然后使其长成一个个纯种单菌落。上述工作又离不开接种，即将一种微生物移接到另一灭菌培养基上的过程。

分离纯化常用的方法有：

（1）简易单细胞挑取法

（2）平板分离法

选择适合于待分离微生物的生长条件，如营养成分、酸碱度、温度和氧等要求,或加入某种抑制剂造成只利于该微生物生长，而抑制其他微生物生长的环境，从而淘汰一些不需要的微生物

微生物在固体培养基上生长形成的单个菌落，通常是由一个细胞繁殖而成的集合体。因此可通过挑取单菌落而获得一种纯培养。获取单个菌落的方法可通过稀释涂布平板或平板划线等技术完成。

将微生物的培养物或含有微生物的样品移植到培养基上的操作技术称之为接种。接种的关键是要严格的进行无菌操作

土壤是微生物生活的大本营，它所含微生物无论是数量还是种类都是极其丰富的。因此土壤是微生物多样性的重要场所，是发掘微生物资源的重要基地，可以从中分离纯化得到许多有价值的菌株。

（二）微生物培养特征的观察

1、微生物的培养特征是指微生物在固体培养基、半固体和液体培养基中生长后所表现的群体形态特征。

2、不同的微生物具有不同的培养特征，这些特征一般用固体、半固体和液体培养基来进行检测。

3、固体培养基又分为平板和斜面两种。不同来源的样品接种于平板培养基上，在适宜温度下培养，1-2d内会形成菌落。

4、每一种细菌所形成的菌落有它自己的特点，如菌落的大小，表面干燥或湿润、隆起或扁平、粗糙或光滑，边缘整齐或不整齐，菌落透明或半透明或不透明，颜色以及质地疏松或紧密等。

5、可通过平板培养来检测不同的材料中微生物的数量和类型

（三）微生物的平板菌落计数

平板菌落计数法是将待测样品经适当稀释后接种到平板上，经过培养，由每个单细胞生长繁殖形成肉眼可见的菌落，即一个菌落应代表原样品中的一个单细胞。

统计菌落数，根据其稀释倍数和取样接种量即可换算出样品中的含菌数

三.材料仪器

牛肉膏蛋白胨培养基、土豆培养基、油脂培养基、淀粉培养基、移液管、三角瓶、无菌水、接种环、酒精灯、土壤悬液、无菌培养皿、涂棒、恒温培养箱等。

四.实验内容及方法

1.采集土样，制备土壤悬液：1g土稀释到10-7；

倒平板→划线→培养→挑单菌落→接种移植→保存

2.倒平板:

右手持盛培养基的三角瓶置火焰旁边，用左手将试管塞或瓶塞轻轻地拨出，试管或瓶口保持对着火焰；然后左手拿培养皿并将皿盖在火焰附近打开一缝，迅速倒人培养基约15ml，加盖后轻轻摇动培养皿，使培养基均匀分布在培养皿底部，然后平置于桌面上，待凝后即为平板。

3.涂布分离

将0.1m菌悬液小心的滴在平板培养基表面位置。右手拿无菌涂棒平放在平板培养基表面上，将菌悬液先沿一条直线轻轻地来回推动，使之分布均匀然后改变方向沿另一垂直线来回推动，平板内边沿处可改变方向用涂棒再涂布几次。

培养后可观察有无孤立菌落生长，每一孤立菌落即为一纯种细菌。一般病原菌的菌落数少于杂菌，故在分离培养时，应力求出现较多的孤立菌落，以提高病原菌检出率。

4.恒温培养箱培养

土豆培养基板于24 ℃倒置培养24天，牛肉膏蛋白胨培养基、土豆培养基、油脂培养基、淀粉培养基于37 ℃倒置培养24小时后观察

5.观察并记录菌落形态

6.计算同一稀释度三个平板上的菌落平均数，并按下列公式进行计算:

每毫升中菌落形成单位（cfu）=

同一稀释度三次重复的平均菌落数×

稀释倍数×5

作业

1.在三种不同的平板上你分离得到哪些类群的微生物？简述它们的菌落特征。

2.如何确定平板上某个菌落是否为纯培养？请写出试验的主要步骤。

3.如果一项科学研究内容许从自然界中筛选到能产生高温蛋白酶的菌株，你将如何完成？请写出简明的实验方案。

大分子物质水解试验

实验九

1、了解不同微生物对各种有机大分子的水

解能力。

2、了解不同微生物有不同的酶系统。

3、掌握微生物大子水解试验的原理和方法。

4、掌握大分子试验在微生物鉴别中的作用。

一.实验目的及要求

二.实验原理

各种细菌在代谢类型上表现了很大的差异。不同的细菌分解大分子碳水化合物、蛋白质和脂肪的能力不同，所能发酵的类型和最终产物也不一样。不同细菌对营养的要求不同也说明了它们有不同的合成能力。所有这些都反映了它们是有不同的酶系统。

细菌的生化反应的多样性也被人们作为细菌的鉴定和分类方法来利用。

三.实验器材

菌种：学生从土壤中分离的菌株

材料：油脂培养基，淀粉培养基，无菌平皿、接种环、卢戈氏碘液（Lugol's iodine solution）等。

四.实验步骤

1．油脂水解试验

(1)将溶化的油脂培养基冷至45℃左右时，充分

振荡，使油脂均匀分布，用无菌操作倒入平

皿中，待凝。

(2)接种从土壤中分离的菌株

(3)将接种的平板倒置于37℃温室中培养24小时。

(4)取出平板，观察平板底层长菌的地方，如出

现红色斑点，说明脂肪被水解，为阳性反应。

2．淀粉水解试验

(1)将淀粉培养基溶化后，冷至45℃左右，以无菌操作制

成平板。

(2)接种从土壤中分离的菌株

(3)将上述已接种的平板倒置于37℃温室中培养24小时。

(4)将已培养24小时的平皿取出，打开皿盖，加少量卢戈

氏碘液于平板上，轻轻旋转平皿，使碘液均匀铺满整

个平板。如菌苔周围出现无色透明圈，说明淀粉已被

水解，为阳性。透明圈的大小可初步判断该菌水解能

力的强弱，即产生胞外淀粉酶活力的高低。

五.实验结果

将结果填入课本上的表格里。“+”表示阳性；“-”表示阴性。

实验十

糖发酵试验

一.实验目的及要求

1 .了解糖发酵的原理和在肠道细菌鉴定中的

作用。

2. 掌握通过糖发酵鉴别不同微生物的方法。

糖发酵试验是最常用的生化反应，在肠道细菌的鉴定上尤为重要。绝大多数细菌都能利用糖类作为碳源和能源，但是它们在分解糖的能力上有很大的差异，有些细菌能分解某种糖并产酸（如乳酸、醋酸、丙酸等）和气体（如氢、甲烷、二氧化碳等）；有些细菌只产酸不产气。例如大肠杆菌能分解乳糖和葡萄糖产酸并产气；伤寒杆菌能分解葡萄糖产酸不产气，不能分解乳糖；普通变形杆菌分解葡萄糖产酸产气，不能分解乳糖。

酸的产生可利用指示剂来断定。在配制培养基时预先加入溴甲酚紫[pH5．2（黄色）-6．8

（紫色）]，当发酵产酸时，可使培养基由紫色变为黄色。气体的产生可由发酵管中倒置的德汉氏小管中有无气泡来证明。

二.基本原理

三.实验器材

菌株：大肠杆菌，枯草杆菌

材料：盛有葡萄糖发酵培养基的试管（内装

有倒置的德汉氏小管），试管架，接种

环等。

四.实验步骤

1、编号用记号笔在各试管上分别标明发酵培

养基名称和所接种的菌名。

2、接种：取盛有葡萄糖发酵培养基的试管3

支，按编号1支接种大肠杆菌，另1支接种

产气肠杆菌，第3支不接种，作为对照。

3、将上述已接种的葡萄糖发酵试管和对照管

置37℃温室中培养24小时。

4、观察结果。

五.实验结果

将实验结果填入课本上的表格。“”表示产酸产气；“+”表示产酸不产气；“-”表示不产酸不产气。

实验十一

吲哚试验

甲基红试验

伏-普试验

一.实验目的和要求

1.了解IMViC的原理及方法。

2.掌握IMVIC在肠道菌群鉴定中的作用

二.基本原理

1、甲基红试验（M.R试验）

某些细菌（如大肠杆菌、志贺氏菌、产气杆菌等）分解葡萄糖产生多种有机酸，导致培养基PH值下降。当降至4.5以下时，甲基红呈红色，即为阳性反应；当PH高于4.5时则呈黄色，即为阴性反应。根据此现象可进行菌种鉴定。

2、吲哚试验

有些细菌含有色氨酸酶，能分解蛋白胨中的色氨酸产生吲哚。吲哚与对二甲基氨基苯甲醛结合，就会形成红色的玫瑰吲哚。

大肠杆菌吲哚反应阳性，产气肠杆菌阴性。

3、乙酰甲基甲醇试验（V-P试验）

某些细菌在葡萄糖蛋白胨水培养液中能分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸缩合，脱羧成乙酰甲基甲醇，后者在强碱环境下，被空气中氧气氧化为二乙酰，二乙酰与蛋白胨中的胍基生成红色化合物，称V.P.（+）反应。

三.材料仪器

1.活材料：大肠杆菌、产气肠杆菌

2.培养基

葡萄糖蛋白胨水培养基、蛋白胨水培养基

3.试剂

甲基红试剂、吲哚试剂、V.P.试剂。

4.器材

接种环、酒精灯、恒温培养箱

四.实验内容及方法

1. 试管标记：M.R.、吲哚、V.P.培养液试管各一支，标记上所要接种的菌种。

2. 接种：以无菌操作分别接种少量菌苔至以上各相应试管中。

3.培养：置37℃恒温箱中培养，在培养48h后观察结果。

五.实验结果

M.R.试验结果观察

于M.R.培养液中，各加入2～3滴甲基红指示剂，注意沿管壁加入，仔细观察培养液上层，若培养液上层变成红色，即为阳性反应；若仍呈黄色，则为阴性反应，分别用“＋”或“－”表示。

吲哚试验结果观察

取吲哚试管，加入10滴乙醚，摇动数次，静置5-10分钟，待乙醚上升后，沿管壁徐徐加入2滴吲哚试剂，等量V.P.试剂，摇匀，以使空气中的氧溶入，在乙醚和培养物之间产生红色环状物为阳性反应，，记录为吲哚试验阳性结果（用“＋”表示）；

若无红色环状物出现者记录为吲哚试验阴性结果（用“－”表示）。

V.P.试验结果观察

取V.P.试管，加入等量V.P.试剂，摇匀，以使空气中的氧溶入，静置于37℃恒温箱中保温15～30min后，若培养液呈红色，记录为V.P.试验阳性结果（用“＋”表示）；

若不呈红色，仍未为黄中带蓝色者记录为V.P.试验阴性结果（用“－”表示）。