第14章 沉淀与结晶

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2.4.盐析用盐的选择
2.4.1选用盐析用盐的几点考虑

盐析作用要强
盐析用盐需有较大的溶解度 盐析用盐溶解度受T影响小 盐析用盐必须是惰性的
来源丰富、经济
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2.4.2一般的规律为
在相同离子强度下，盐的种类对蛋白质溶解度
的影响有一定差异：

半径小的高价离子的盐析作用较强，半径大 的低价离子作用较弱 （Ks）磷酸钾>硫酸钠>硫酸铵>柠檬酸钠

β－盐浓度为0时，蛋白质溶解度的对数值。
与蛋白质种类、温度、pH值有关，与盐无关；

Ks—盐析常数，与蛋白质和无机盐的种类有
关，与温度、pH值无关。
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2.3.2盐析的方法


Ks盐析法(分级沉淀）：在一定pH和温度下， 改变体系离子强度进行盐析的方法； β 盐析法(分级沉淀） ：在一定离子强度下， 改变pH和温度进行盐析； 其中，Ks盐析法由于蛋白质对离子强度的变 化非常敏感，易产生共沉淀现象，因此常用于 提取液的前处理。 而β 盐析法由于溶质溶解度变化缓慢，且变化 幅度小，因此分辨率更高，常用于初步的纯化。
PS：操作时注意事项 a. T b.分级盐析 c. 条件严格控制（有重 复性） d. 静止 0.5 － 1h 后过滤或 离心（沉淀完全） e.搅拌
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3 有机溶剂沉淀
3.1概念：在含有溶质的水溶液中加入一定量亲水的 有机溶剂，降低溶质的溶解度，使其沉淀析出。 3.2原理： （1）降低了溶质的介电常数，使溶质之间的静电引 力增加，从而出现聚集现象，导致沉淀。 （2）由于有机溶剂的水合作用，降低了自由水的浓 度，降低了亲水溶质表面水化层的厚度，从而降 低了亲水性，导致脱水凝聚－破坏水化膜。
Precipitation and Crystallization 沉淀法与结晶法都是将溶质以固体形式从溶液中 析出的方法，若析出的是晶体，则称为结晶；析出 的是无定形物质，则称为沉淀。 沉淀和结晶本质上同属一个过程，都是新相析出 的过程，两者的区别在于构成单位的排列方式不同 ，晶体的原子、离子或分子排列是规则的，而沉淀 是不规则的。沉淀和结晶通常被统称为固相析出技 术。

>硫酸镁
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2.4.3常用的盐析用盐
硫酸铵：溶解度大（767g/L），对T不敏感、分级
效果好，对蛋白有稳定作用，价廉；具腐蚀性且缓 冲能力差，


硫酸钠 磷酸盐 柠檬酸盐
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2.5影响盐析的因素
(1)溶质种类的影响：Ks和β 值 (2)溶质浓度的影响： 蛋白质浓度大，盐的用量小，共沉作用明显，分辨 率低； 蛋白质浓度小，盐的用量大，共沉作用小、分辨率 高 (3)pH值：影响蛋白质表面净电荷的数量 通常调整体系pH值使其在pI附近；且pr稳定性好 (4)盐析温度-常温 一般在高盐浓度下，温度升高，其溶解度反而下降
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25℃硫酸铵水溶液由原来的饱和度达到所需饱和度 时，每升硫酸铵水溶液应加入固体硫酸铵的克数
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（2）加饱和硫酸铵溶液
V V
S2 S1 0 S3 S2
V-加入体积；V0－原液体积 S3－所加硫酸铵的饱和度 S2－需要达到的硫酸铵的饱和度 S1－原液硫酸铵的饱和度
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2.6硫酸铵盐析操作
（1）固体加入法：
以少量多次方式缓慢加入硫酸铵，其用量由表可得。 如：现有20ml料液，饱和度为20％，以加固体硫酸铵的 方式盐析，需要达到的硫酸铵饱和度为40％，问需要 加入多少固体硫酸铵？ 盐析饱和度（Saturation）的概念： 以硫酸铵为例：250C时，硫酸铵的饱和溶解度是767g/L 定义为100%饱和度。（50％饱和度？）
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a.两性电解质，由于静电力的作用，分子间相互排 斥，形成稳定的分散系。 b.蛋白质周围形成水化膜，保护了蛋白质粒子，避 免了相互碰撞。
（2）原理
a.盐离子中和pr分子表面电荷，静电斥力减弱。
b.盐亲水性大于pr亲水性－破坏水化模
PS：不同的pr结构不同，溶解度不同，盐所需要的 浓度也不同－分级沉淀。
2.盐析法
2. 1基本概念：
盐析：在高浓度的中性盐存在下，蛋白质（酶）等生 物大分子物质在水溶液中的溶解度随盐浓度的升高会 急剧下降，并产生沉淀，这种现象称为盐析。
盐溶：在低盐浓度下，蛋白质的溶解度随盐浓度的 升高，溶解度略有上升，这种现象称为盐溶。 2.2 盐析原理
（1）首先需要了解生物大分子在水溶液中的存 在状态－蛋白质溶于水的原因
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2.3 盐析过程 2.3.1离子强度对盐析过程的影响

(1） Cohnx经验公式
log S K I s


β，Ks—常数
S—蛋白质溶解度，mol/L;
I—离子强度 c:离子浓度；Z：离子化合价
1 I ci Zi2 2
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（2）β 和Ks的物理意义
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（3）加有机溶剂后，pr等分子的空间结构可能发 生变化，使内部疏水基团部分外露，并与有机溶剂 的疏水基团结合成疏水层，从而使蛋白沉淀。
3.3溶剂选择



介电常数要小 致变性作用要小 毒性要小、挥发性适中 水溶性要好（与水无限混溶）
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3.4有机溶剂沉淀的特点
（1）分辨率高； （2）溶剂容易分离，并可回收使用；产品洁净；
（3）容易使蛋白质等生物大分子失活；
（4）应注意在低温下操作；
（5）成本高
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3.5常用的有机溶剂沉淀剂
（1）乙醇：
沉淀作用强，挥发性适中，无毒常用于蛋白质、核酸、 多糖等生物大分子的沉淀； （2）丙酮：沉淀作用更强，用量省，但毒性大，应用范围 不广；
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沉淀与结晶
沉淀法
1. 概述
（1）定义：利用沉淀剂使所需提取的生化物质或杂质 在溶液中的溶解度降低而形成无定形固体沉淀的过 程。 （2）特点：操作简单、经济、浓缩倍数高 （3）缺点：针对复杂体系而言，分离度不高、选择性 不强；杂质含量高 （4）种类：盐析、有机溶剂沉淀、等电点沉淀、非离 子型聚合物沉淀、金属离子沉淀法等 （5）一般操作过程 加沉淀剂→陈化→分离（过滤或离心）