7种蝴蝶兰红花品种的遗传多样性分析

寒性与抗病性.
花瓣深红色, 花朵小, 直径 3cm 左右, 分枝 性 2 小男孩 好, 总花朵 数可达 20 朵以 上, 花期 4 个 月,
无特殊耐性.
3
杰腾玫瑰
花瓣亮红色, 花朵直径约 9cm, 花朵数较 少, 一般 9 朵左右, 花期 3个月, 无特殊耐性.
收稿日期: 2010 01 18; 修回日期: 2010 03 30 基金项目: 国家自然科学基金项目 ( 30740017) 作者简介: 王磊 ( 1975 ) , 男, 山东泰安人。副教授, 博士, 主 要从事生物化学 与分子生物学 方面的研究。 T e:l 13220936371, E m ai:l w anglei9909@ 163. com。
表 2 随机引物编号及其序列
引物编号 S21 S22 S23 S24 S25 S33 S34 S38 S51 S52
引物序列 5! 3! CAGG CCCTTC TG CCGAG CTG AGTCAG CCAC AATCGGG CTG AGGG GTCTTG CA GCA CCCAC TCTGTG CTGG TTCCG AACCC AG CG CCATTG CA CCGTATCC
共有, 即这些引物的结合位点比较保守, 个别条带 存在差异, 这就构成了具有一定区分度的指纹图 谱, 为分析各品种间的亲缘关系提供重要依据.
图 2 引物 S38, P67, P72对 7个蝴蝶兰品种 DNA 的扩增电泳图谱 M 表示 DNA m ark er; 自上而下依次为: 2000, 1000, 750, 500, 100 bp.
3 ) RAPD 反 应体 系 分 别 对 模 板 浓 度、
dNT Ps浓度、引物浓度和 T aq 酶浓度设置不同的 浓度梯度进行优化, 最终优化的 RAPD反应体系
为: 总 体 积 为 25 L, 其 中 10 ∀ PCR 缓 冲 液 2 5 L, M g2+ ( 2 5 mm ol /L ) 2 5 L, dNTP ( 每种 2 5 mm o l/L ) 2 0 L, 随 机 引物 ( 10 0 m o l/L )
表 3 RAPD 位点统计结果
随机引物 RAPD 位点 /个 多态性位点 /个 多态性位点频率 /%
S38
12
9
75 0
P 67
18
13
72 2
P 72
9
5
55 6
总计
39
27
69 2
态性位点频率为 69 2% , 可以看出扩增结果多态 性较强, 说明该方法在蝴蝶兰品种间具有比较丰 富的遗传多样性.
分子标记技术是继形态学标记、细胞学标记
和生化标记之后发展起来的一类新型遗传标记, 因其不受季节和环境条件的限制、灵敏性高、操作 简单等诸多优点已广泛应用于园艺植物的种内和 种间遗传多样性以及分子育种研究等方面 [ 5] . 目 前, 人们利用 RAPD和 ISSR 分子标记技术在蝴蝶
兰的亲缘关系研究和种质资源鉴定等方面已取得 一定的成果 [ 6 8] . 本实验选用 7个全部是红色花的 蝴蝶兰品种, 利用 RAPD技术对不同蝴蝶兰品种的 遗传多样性进行分析, 确定品种间的遗传距离, 并 结合其花形和生物学特性在分子水平上分析供试 蝴蝶兰品种的遗传多样性及其进化关系, 从而为分 类鉴定和遗传育种提供更科学直观的依据.
1 实验材料和方法
1. 1 材料
供试品种见表 1, 均由烟台市农业科学研究
院花卉研究所提供.
表 1 7种蝴蝶兰品种编号、名称及生物学性状
编号 品种名称
生物学性状
花瓣亮红色, 中间 带有深 红色 的斑 点, 花 朵
1
火鸟
大, 直径 11 cm 左右, 为多花型 品种, 催花 容 易, 总花朵 数可达 15 朵, 花 期 4 个 月, 有 耐
品种 1 2 3 4 5 6 7
1 1 0000000 0 5384615 0 6666667 0 5641026 0 5897436 0 6666667 0 5897436
2
1 0000000 0 6153846 0 6153846 0 6410256 0 6153846 0 6923077
表 4 7个品种间的遗传 遗传相似度
3
4
5
1 0000000 0 8461538 0 7692308 0 Biblioteka Baidu435897 0 6666667
1 0000000 0 7692308 0 6923077 0 6666667
1 0000000 0 7179487 0 7435897
6
7
鲁东大学学报 (自然科学版 ) Ludong U n iversity Journa l( N atura l Sc ience Edition)
2010, 26( 3) : 250 254
7种蝴蝶兰红花品种的遗传多样性分析
王 磊1, 宿红艳 1, 顾 亮 1, 刘学庆2
( 1. 鲁东大学 生命科学学院, 2. 山东烟台市农科院 园林花卉研究所; 山东 烟台 264025 )
2 结果
2 1 7个品种的基因组 DNA 采用 CTAB 法提取 7个品种的基因组 DNA,
并用 RNase A 处理以降解其中混有的 RNA, 最后 电泳检测的基因组 DNA 的结果见图 1. 由图 1可 以看出 DNA 条带清晰, 无污染, 纯度较高, 能满足 RA PD 分 析的 要求 .
图 1 7个蝴蝶兰品种的基因组 DNA 电泳图谱 M 表示 DNA m arker; 自上而下依次为: 2000, 1000, 750, 500, 100 bp.
2 0 L, T aq DNA聚合酶 1 U, DNA 模板 10 ng.
4) RAPD扩增程序及产物检测 扩增程序为:
94 预变性 10 m in, 94 变性 60 s, 38 退火 60 s, 72 延伸 90 s, 45个循环, 72 补平 10 m in后结束 反应. 4 保存. 扩增产物在用 1 5% 琼脂糖凝胶电 泳分离, 以 DNA M arker ( DL 2000, T aKaRa) 为标 准分子量标记, 110 V 恒压电泳 45 m in. 电泳结束 后用凝胶成像系统观察结果. 每个引物重复 3次.
摘要: 采用 RAPD 技术对国内流行的蝴蝶兰 7个红花品种进行 了遗传多 样性分析. 经筛选 得到了 3个 较为理 想的随机引物, 共扩增出 39条 DNA 片段, 其中多 态性条带为 27条, 多态性位点频率为 69 2% , 说明品种间遗 传多样性较为丰富. 采用 Popgen32软件计算遗传距离并建立 U PGM A 聚 类图, 明确了 7个 蝴蝶兰品种 间的亲 缘关系. 实验结果表明该分子标记技术可以对外观较为接 近的蝴蝶兰 品种进行区 分, 对 蝴蝶兰育 种具有重要 的指导意义. 关键词: RA PD; 遗传多样性; 聚类分析; 蝴蝶兰 中图分类号: S646 文献标志码: A 文章编号: 1673 8020( 2010) 03 0250 05
2 2 7个品种的 DNA 多态性统计结果 从 20条随机引物中共筛选出扩增条带清晰、
稳定的引物 3个, 分别是 S38, P67和 P72. 由扩增图 谱 (图 2)可以看出, 每个引物对不同品种扩增的
2 52
鲁东大学学报 (自然科学版 )
第 26卷
DNA 条带多态性丰富, 数目不等, 一般在 4 19个. 绝大多数扩增片段大小在 500 2000 bp. 同时还可 看到, 某些引物扩增出的 DNA 片段为几个品种所
蝴 蝶 兰 为 兰 科 ( Orch idaceae ) , 蝴 蝶 兰 属 (Phalaenopsis), 因花朵形如蝴蝶, 故而得名. 全世 界原生种蝴蝶兰约有 70多种, 经杂交选育的品种 有数百种, 作为商品栽培的蝴蝶兰多是人工杂交 选育的品种. 目前蝴蝶兰是花卉市场的热销品种, 有很好的发展前景和巨大的市场需求, 其经济效 益非常可观. 国内外对于蝴蝶兰的研究开展得如 火如荼, 多集中在 快速繁殖与工业 化生产方 面 [ 1 3] . 影响蝴蝶兰经济效益的主要因素在于其 花质特性, 而对于花质而言, 花期、花色、形态又是 最为关键的因素. 因此, 培育优良的蝴蝶兰品种至 关重要. 由于不同地域之间经常相互引种栽培, 出 现了许多同种异名或同名异种的现象, 品种名和 品种分类十分混乱, 使育种工 作受到限制 [ 4] . 另 外, 部分原种蝴蝶兰的遗传资源在育种上尚未被 应用, 所以解读蝴蝶兰属成员的遗传亲缘关系, 快 速准确地对种类繁多的蝴蝶兰进行分类和鉴定将 是十分必要的.
引物编号 P 56 P 57 P 58 P 59 P 60 P 61 P 62 P 84 P 72 P 67
引物序列 5! 3! AGGGCGTAA G TTTCCCA CGG GAGAG CCAAC CTGGGGA CTT A CCCGGTCA C TTCGAG CCAG G TGAGG CGTC GGGG GTCTTT CCG CA TCTAC GA TGACCGCC
5) RAPD 谱带分析 应用 DL 2000标准分子 量 M arker来确定各条谱带的分子量大小范围, 选 择重复性好且稳定的扩增谱带进行分析. 电泳图 谱中每条谱带代表有关随机引物与模板 DNA 互 补结合的一对位点, 将它作为一个单位, 即一个相 应的 RAPD 位点, 无带的赋值为 0, 有带的赋值为 1. 将统计结果利用 P opgen 软件计算菌株间遗传 距离, 基于此遗传距离再按算数平均数的非加权 成组配对法 ( UPGMA 方法 ) 进行聚类分析, 构建 各品种的聚类树状图 [ 10] .
寒性强.
1. 2 方法
1) 基因组 DNA 的提取与检测 蝴蝶兰基因 组 DNA 提取采用 CTA B 法 [ 9 ] , 经 1 0% 琼脂糖凝
胶电泳检测后, - 20 保存备用. 取所提 DNA 溶
液 5 L, 加入 2 L 上 样缓 冲 液, 混匀 上 样. 在
1 0% 的琼脂糖凝胶 100 V 条件下电泳 45 m in后 用自动紫外凝胶成像仪观察、拍照.
2 3 7个品种间的遗传距离
用 P opgen软件计算各种材料间的遗传距离 (表 4) . 由表 4可知, 7个蝴蝶兰品种间的遗传距 离数值变化范围为 0 538 0 846, 各供试品种之 间的相 似性较 大. 其 中亲 缘关系 最近的 是 3 号 (杰腾玫瑰 ) 和 4号 (巨宝红玫瑰 )品种, 其遗传相 似度为 0 846; 最小遗传相似度为 0 538, 是 1号 ( 火鸟 ) 和 2号 (小男孩 ) 品种, 亲缘关系最远.
对 7个品种 DNA 多态性的分析结果见表 3. 由表 3可以看出, 不同引物的多态性位点频率不 同. 引物 P72的多态性位点频率仅为 55 6% , 而 引物 S23的多态性位点频率则高达 75 0% , 二者 相差较大. 另外, 在 3个随机引物扩增得到的总共 39个 RAPD位点中, 有 27个位点具多态性, 其多
2) 引物筛选 本实验采用的随机引物由上
海生物工程技术有限服务公司生产, 20种随机引 物的序列见表 2. 从中剔除无扩增产物和带纹模
糊难于分辨的引物, 利用扩增条带清晰、条带特异
性强、可重复性高的引物扩增不同株系的 DNA 样
本, 以检测引物的群体间多态性. 本实验筛选出的 3种较为理想的随机引物分别为 P67, P72和 S38.
第 3期
王 磊, 等: 7种蝴 蝶兰红花品种的遗传多样性分析
2 51
续表 1 编号 品种名称
生物学性状
花瓣亮红色, 两边具白边, 花朵直径约 9 cm, 4 巨宝红玫瑰 花朵数 10朵 左右, 花期长 达 2 3 个月, 无
特殊耐性.
花瓣亮红色, 花形大, 花 朵直径 约 13 cm, 多 5 红龙 花型品种, 催花 时 间较 长, 花 朵数 10 朵 左
右, 花期 3个月以上, 耐寒性强.
花瓣红色, 花 朵直 径约 10 cm, 为 多花 型 品 6 玉山 S048 种, 总花朵 数可达 10 朵以 上, 花期 3 个 月,
耐寒性强.
花瓣紫红色, 有深 红脉纹 和少 量雪 花点, 为
7
红珍珠
中花多花型品种, 花朵直 径约 8 cm, 总花 朵 数可达 20朵, 花期 2 3 个月, 耐热 性和 耐