第8章动物细胞培养制药工艺-3
制药工艺学题库
简答题及论述题微生物发酵制药章节1微生物发酵过程分几个时期？各有什么特征？答：微生物发酵分三个时期，分别是菌体生长期，产物合成期和菌体自溶期。
菌体生长期的特点是在这一段时间内，菌体的数量快速增加维持到一定的数量保持不变。
产物合成期的特点是产物量逐渐增加，生产速率加快，直最大高峰合成能力维持在一定水平。
菌体自溶期的特点是菌体开始衰老，细胞开始自溶产物合成能力衰退，生产速率减慢。
2生产菌种选育方法有哪些？各有何优缺点？如何选择应用？生产菌种的选育方法主要有以下几种一，自然分离发现新菌种二，自然选育稳定生产菌种三，诱变育种改良菌种四，杂交育种创新菌种五基因工程技术改造菌种，六合成生物学定制菌种。
自然分离发现新菌种优点是价格便宜，易于处理，缺点是操作繁琐不易获得新菌种。
自然选育稳定生产菌种的特点是简单易行，可达到纯化菌种，防止退化生产水平和提高产量，但效率及增产幅度低。
诱变育种改良菌种的特点是速度快，收效大，方法相对简单，但缺乏定向性，要配合大规模的筛选工作。
杂交育种创新群种是具有定向性，但其技术难度高。
基因工程技术改造菌种生产能力大，产品质量高工艺控制方便，合成生物学定制育种特点是菌种生产能力高，药物的研发和高效生产量高。
3菌种保藏的原理是什么？有哪些主要方法？各有何优缺点?菌种的保存原理是其代谢处于不活跃状态，生长繁殖受抑制的休眠状态，保持原有特性，延长生命时限。
其主要保存方法有以下几种一，斜面低温保存二，液体石蜡密封保存三，砂土管保存，四冷冻干燥保存，五液氮保存。
其优缺点分别是斜面低温保存。
优点是操作简单，使用方便，缺点是保存时间短，不能经常移植。
液体石蜡密封保存优点是保存时间长。
砂土管保存优点是保存时间长。
缺点是本方法只适宜于形成孢子和芽孢的菌种，不适用只有菌丝的真菌和无芽孢的细菌保存。
冷冻干燥保存的优点是保持细胞完整性，保存时间长，但对动物细胞的保存效果不好。
液氮保存的特点是目前最可靠的一种长期保存方法，可用于细菌，酵母和体外培养动物细胞，也是长期保存主种子批的主要方法。
生物制药工艺设计学思考题及答案
抗生素发酵生产工艺1. 青霉素发酵工艺的建立对抗生素工业有何意义？青霉素是发现最早，最卓越的一种B-酰胺类抗生素，它是抗生素工业的首要产品，青霉素是各种半合成抗生素的原料。
青霉素的缺点是对酸不稳定，不能口服，排泄快，对革兰氏阴性菌无效。
青霉素经过扩环后，形成头孢菌素母核，成为半合成头孢菌素的原料。
2. 如何根据青霉素生产菌特性进行发酵过程控制？青霉素在深层培养条件下，经历7个不同的时期，每个时期有其菌体形态特性，在规定时间取样，通过显镜检查这些形态变化，用于工程控制。
第一期：分生孢子萌发，形成芽管，原生质未分化，具有小泡。
第二期：菌丝繁殖，原生质体具有嗜碱性，类脂肪小颗粒。
第三期：形成脂肪包含体，积累储蓄物，没有空洞，嗜碱性很强。
第四期：脂肪包含体形成小滴并减少，中小空泡，原生质体嗜碱性减弱，开始产生抗生素。
第五期：形成大空泡，有中性染色大颗粒，菌丝呈桶状。
脂肪包含体消失，青霉素产量提高。
第六期：出现个别自溶细胞，细胞无颗粒，仍然桶状，释放游离氨，pH上升。
第七期：菌丝完全自溶，仅有空细胞壁。
一到四期为菌丝生长期，三期的菌体适宜为种子。
四到五期为生产期，生产能力最强，通过工艺措施，延长此期，获得高产。
在第六期到来之前发束发酵。
3. 青霉素发酵工程的控制原理及其关键点是什么？控制原理：发酵过程需连续流加葡萄糖，硫酸铵以及前提物质苯乙酸盐，补糖率是最关键的控制指标，不同时期分段控制。
在青霉素的生产中，及时调节各个因素减少对产量的影响，如培养基，补充碳源，氮源，无机盐流加控制，添加前体等；控制适宜的温度和ph，菌体浓度。
最后要注意消沫，影响呼吸代。
4. 青霉素提炼工艺中采用了哪些单元操作？青霉素不稳定，发酵液预处理、提取和精制过程要条件温和、快速，防止降解。
提炼工艺包括如下单元操作：①预处理与过滤：在于浓缩青霉素，除去大部分杂质，改变发酵液的流变学特征，便于后续的分离纯化过程。
②萃取：其原理是青霉素游离酸易溶于有机溶剂，而青霉素易溶于水。
《动物细胞制药》课件
动物细胞培养的成本较高，细胞污染和变异性是制约其应用的主要问题。
2 机遇
随着技术的进步，细胞培养和基因工程的发展给动物细胞制药带来了创新机遇。
动物细胞制药的未来发展趋势
个性化药物
动物细胞制药将越来越多地 用于个体化治疗，根据患者 的基因组信息生产定制药物。
细胞工程技术
细胞工程技术的发展将为动 物细胞制药提供更多的途径 和方法，不断拓展其应用领 域。
纳米技术
纳米技术的应用将改变药物 的传输和释放方式，提高药 物的疗效和安全性。
动物细胞制药的潜在风险和监管措施
1
风险
动物细胞制药可能存在风险，如免疫
监管措施
2
原性、感染风险等，需加强监测和安 全评估。
相关监管机构应加强动物细胞制药的
监管，确保其质量和安全性。
3
关键因素
成功的动物细胞培养需要控制细胞密度、培养基组分、培养温度、培养pH值等 多个关键因素。
动物细胞制药的应用领域
生物药物
动物细胞制药在生物药物生产中起着重要作用，包括抗体、疫苗、生长因子等。
诊断试剂
动物细胞制药广泛应用于制备各种诊断试剂，如血清学试剂、酶联免疫吸附试剂等。
基因工程产品
动物细胞制药在基因工程产品的生产中具有重要意义，如重组蛋白、基因治疗等。
பைடு நூலகம்
常见的动物细胞制药产品
单克隆抗体
单克隆抗体是一类重要的生物 药物，常用于治疗癌症、自身 免疫性疾病等。
重组蛋白
重组蛋白是通过基因工程技术 制备的蛋白质，用于治疗多种 疾病，如糖尿病、血友病等。
疫苗
疫苗是预防传染病的重要手段， 动物细胞制药可用于生产多种 疫苗，如流感疫苗、乙肝疫苗 等。
生物技术制药复习知识点
生物技术制药复习知识点第一章绪论1.生物制药的研究内容包括基因工程制药, 细胞工程制药, 酶工程制药和发酵工程制药。
2.生物技术制药, 是采用现代生物技术人为地创造一些条件, 借助某些微生物、植物或动物来生产所需的医药品。
3.生物技术药物, 是采用DNA 重组技术、单克隆抗体技术或其它生物新技术研制的蛋白质、治疗性抗体或核酸类药物。
4.生物药物, 指包括生物制品在内的生物体的初级和次级代谢产物或生物体的某一组成部分, 甚至整个生物体用作诊断和治疗的医药品。
5.现代生物药物四种类型: ①应用DNA重组技术制造的基因重组多肽、蛋白质类治疗剂。
②基因药物, 如基因治疗剂、基因疫苗、反义药物和核酶等。
③来自动植物和微生物的天然生物药物。
④合成与部分合成的生物药物。
6.生物药物按功能用途分为三类: 治疗药物, 预防药物和诊断药物。
7.生物技术药物的特性：分子结构复杂, 具种属特异性, 治疗针对性强、疗效高, 稳定性差, 基因稳定性, 免疫原性、重复给药会产生抗体, 体内半衰期短, 受体效应, 多效性和网络效应, 质量控制的特殊性, 生产系统的复杂性。
8.生物技术制药特征：高技术, 高投入, 长周期, 高风险, 高收益。
9.基因诊断: 指采用分子生物学的方法在DNA水平或RNA水平对基因的结构和功能进行分析从而对特定的疾病进行诊断。
第二章基因工程制药1.利用基因工程技术生产药品的优点: （1）可以大量生产过去难以获得的生理活性蛋白和多肽（如胰岛素、干扰素、细胞因子等）, 为临床使用提供有效的保障；（2）可以提供足够数量的生理活性物质, 以便对其生理、生化和结构进行深入的研究, 从而扩大这些物质的应用范围；（3）利用基因工程技术可以发现、挖掘更多的内源性生理活性物质；（4）内源性生理活性物质在作为药物使用时存在的不足之处, 可通过基因工程和蛋白质工程进行改造和去除；（5）利用基因工程技术可获得新型化合物, 扩大药物筛选来源。
制药工艺学国家精品课习题
10-12 发酵过程中温度和搅拌有何影响，如何控制？ 10-13 发酵过程中 pH 和溶氧有何影响，控制策略有哪些？为什么？ 10-14 分析发酵中泡沫形成的原因及其对发酵的影响，提出消沫措施和方式。 10-15 微生物发酵制药的基本过程是什么?各阶段的主要任务是什么？ 10-16 如何确定发酵终点？如何实现发酵过程的最优化控制？
第八章 8-1 路线 1 与路线 2 有哪些不同？ 8-2 在制备氢化可的松过程中，哪些步骤采用化学合成，哪些为生物法？ 8-3 制备氢化可的松哪步采用 Oppenauer 氧化反应，其机理是什么？ 8-4 制备 17α-羟基黄体酮时，氢解除溴为什么要加入吡啶？ 8-5 制备氢化可的松中可能产生的“三废”是什么？
第二章 2-1 工艺路线设计有几种方法，各有何特点？如何应用？ 2-2 工艺路线评价的标准是什么？为什么？ 2-3 如何进行工艺路线的选择？
第三章 3-1 化学合成药物工艺研究的的主要内容是什么？ 3-2 分析影响反应的各种条件与工艺之间的关系是什么？ 哪些反应条件需要进行极限试 验？为什么？ 3-3 合成工序的确定一般在哪个阶段？对于整个生产过程具有什么重要意义？ 3-4 单分子反应、双分子反应、一级反应、二级反应之间的关系？ 3-5 比较重结晶的溶剂要求与普通反应溶剂的异同点？ 3-6 化学反应中不符合 Van’tHoff 经验规则具有哪些情况？ 3-7 冠醚类属于哪种催化剂，其最适合哪类反应？除此以外，还有哪些催化剂也具有类似的
工程动物细胞培养制药工艺过程
工程动物细胞培养制药工艺过程工程动物细胞培养制药工艺过程是一种利用动物细胞培养技术来生产各种药物的方法。
该过程通常包括以下几个步骤：1. 动物细胞的选取和培养基的准备：首先，需要选择合适的动物细胞作为生产细胞株。
通常使用哺乳动物细胞，如CHO细胞等。
然后需要准备培养基，培养基中包含了生长和繁殖细胞所需的营养物质、生长因子和其他必要的成分。
2. 细胞的扩增和传代：将选取好的动物细胞接种在培养基中，通过提供适当的温度、pH和氧气浓度等环境条件，使细胞可以持续增殖和扩增。
当细胞达到一定的密度时，需要将其传代到新的培养器中，以维持细胞的生长状态。
3. 细胞的表达和分泌：在培养过程中，可以向培养基中添加适当的诱导剂，促使细胞表达和分泌所需的药物。
细胞内的基因表达会产生药物的前体分子，然后通过细胞分泌系统将其释放到培养基中。
此外，细胞内的代谢途径也会参与药物的合成和修饰。
4. 收集和纯化药物：当细胞分泌出药物后，需要对培养基进行采集和处理。
这通常包括离心和过滤等步骤，以去除细胞碎片和其他杂质。
然后可以通过柱层析、电泳或其他分离技术对药物进行纯化，以得到纯度较高的药物样品。
5. 进一步的处理和制剂制备：在得到纯化的药物后，可以进行进一步的处理和制剂制备。
这包括稳定性研究、配方优化和药物制剂的制备等。
最终，通过临床试验和质量控制等步骤，可以得到最终用于临床应用的制药产品。
总结而言，工程动物细胞培养制药工艺过程是一个复杂的生产过程，需要合理设计培养条件、监控细胞生长和药物表达等关键参数。
同时，也需要严格的质量控制和合规操作，以确保药物的质量和安全性。
这一过程在现代制药工业中扮演着重要的角色，为生产高质量的药物提供了可靠的方法。
工程动物细胞培养制药工艺过程是一种利用动物细胞培养技术来生产各种药物的方法，广泛应用于药品研发和制造领域。
它比传统的化学合成方法更安全、高效，并能够生产出高质量的药物。
在工程动物细胞培养制药工艺中，动物细胞株的选取是至关重要的一步。
制药工艺学
制药工艺学第一章绪论制药工艺学是研究药的工业生产过程的共性规律及其应用的一门学科，摆阔制备原理、工艺路线和质量控制。
制药工艺的研究可分为小试、中试及工业化生产三个步骤，分别在实验室、中试车间和生产车间进行。
1小试研究在实验室规模的条件下，研究化学或生物合成反应步骤及其规律、工艺参数与原料，并估算成本。
对于工艺路线研究，可选择的策略有天然原料的直接分离提取、全化学合成、半合成、微生物发酵、动植物细胞培养，甚至是动植物的养殖与种植，很大程度上基于经济可行性的考虑。
工艺研究还包括各反应步骤相关的分离纯化技术及其单元组合对收率的影响。
同时，研究建立成品、半成品、中间品、中间品、原料的检验分析与质量控制方法。
最终设计出合理的工艺路线，确定出收率稳定、质量可靠的操作条件，为中试放大的研究提供技术资料。
2中试研究在中试车间的条件下，进行工艺试验与工业化生产的考查和优化。
研究放大方法及其影响因素，确定最佳操作条件。
进行物料衡算、能量衡算，对工艺进行经济性评价。
取得工业生产所需的资料和数据，为工程设计和工业化生产奠定基础。
3工业化生产工艺研究基于中试研究的结果，制定出生产工艺规程，在生产车间进行试生产。
对工艺进行验证，在各项指标达到预期要求后进行正式生产。
按照制造技术可分化学合成药物、生物合成药物、和中药三大类。
把制药工艺过程分为4类：化学制药工艺、生物技术制药工艺、中药制药工艺和制剂工艺。
第二章一种化学药物可通过若干种不同的途径获得，通常将具有工业生产价值的合成途径称为该药物的生产工艺路线。
化学药物的设计方法与有机合成设计方法有许多类似之处，诸如类型反应法、分子对称法、追溯求源法和模拟类推法等。
类型反应法是指利用常见的典型的有机化学反应与合成方法进行合成工艺路线设计的方法。
【抗真菌药物克霉唑的拆分】具有分子对称性的药物往往可由两个相同的分子片段经化学合成反应制得，或在同一步反应中将分子的相同部分同时构建起来，这就是分子对称法。
动物细胞制药课件
概述
（1）发现细胞和细胞学说创立。1665年英国物理学家 Hooke通过自制的显微镜观察切成薄片的软木时看到死 细胞的细胞壁。
（2）组织培养或细胞培养。1885年德国生理盐水培养 鸡胚组织，至1907年，细胞体外培养宣布进入一个新时 代。
（3）细胞工程学时代。对细胞进行人工改造及培养以 使其为人类服务的时代，包括真核细胞的基因重组、导 入、扩增和表达的理论和技术，细胞融合的理论和技术， 细胞器特别是细胞核移植的理论和技术，染色体改造的 理论和技术，转基因动、植物的理论和技术，细胞大量 培养的理论和技术，以及产物分离纯化的理论和技术。
另一种是先将细胞和培养基加入反应器，待细胞 生长至一定密度后，向反应器内加入诱导剂或病 毒等，经一端时间作用后，将反应物取出，如产 生Namalwa干扰素和疫苗等。
二、动物细胞培养的操作方式
2、半连续式操作
该方式是当细胞和培养基一起加入反应器后，在细胞增长和 产物形成过程中，每间隔一段时间，取出部分培养物，或单 纯是条件培养基，或连同细胞、载体一起，然后补充同样数 量的新鲜培养基，或另加新鲜载体，继续培养。该操作方式 在动物细胞培养和药品生产中被广泛采用，它的优点是操作 简便，生产效率高，可长期进行生产，反复收获产品，而且 可使细胞密度和产品产量一直保持在较高的水平。
二、动物细胞的生理特点
1、细胞的分裂周期长 一般为12~48h，细胞分裂周期=间期（G1期+S期
+G2期）+分裂期（M期） G1期：凡细胞无增殖活动时皆滞留在G1期 S 期：DNA的合成，一般为6~8小时 G2期：DNA量加倍，RNA合成和染色体螺旋化，
持续时间短，一般为2~5h。 M期：一般持续时间很短，仅0.5~1h。相当于有
8讲第2节-动物细胞大规模培养技术
由于动物细胞生长的特殊性，如贴壁、脆弱等， 与微生物细胞培养不同，需要特别注意反应器结构 设计以及特物细胞培养的剪切力损伤？ 2.如何满足细胞贴壁要求又能充 分利用反应器空间体积？
1.动物细胞培养的生物反应器
机械搅拌式：浆叶改造
充气搅拌式：需要改造
一次性培养袋
在线分析技术
中空纤维生物反应器
中空纤维是一种细微的管状结 构，管壁为极薄的半透膜。 主体是由微孔中空纤维管束制成 的中空丝，纤维束由外壳包裹， 因此可分为中空内腔与中空外腔 两部分，每部分各有其进出口。 新鲜培养液从中空内腔导入。气 体在管体部分通过，其中一部分 则均匀地扩散至壳体内部。
3.良好的传质性能
4.强的机械性能：重复利用、保护细胞 5.好的热稳定性：高压灭菌
制备微载体的材料
1.人工合成聚合物 聚甲基丙烯酸-2 羟乙酯（PHEMA）、聚苯乙烯（PS）、聚丙烯酰 胺、聚氨酯泡沫、葡聚糖、低聚合度聚乙烯醇等。 2.天然聚合物及其衍生物 明胶、胶原、纤维素、甲壳质及其衍生物、海藻酸盐
一种微载体产品（Fibra-Cel）
人胚肾细胞HEK293
人上皮细胞—— SoloHill微载体上的生长
微载体对细胞生长具有显著的影响
问题：
微载体培养如何收获细胞？接 种细胞传代呢？
胰蛋白酶消化
球传球(bead to bead)技术
将贴满细胞的微载体与新鲜微载体混合，实现细 胞因随机碰撞而实现转移贴附在新载体表面的技 术。
转化细胞一般具有永生性，但是永生性不一定成瘤。 一般转化细胞并不致瘤。 致瘤性评价：接种到动物体内，发展形成肿瘤结 节，为生瘤阳性。 随着对肿瘤发生机制等研究的深入，转化细胞于20 世纪80年代获得批准用于生产。
细胞工程制药技术 动物细胞培养技术
Part2 植物细胞培养技术 二、动物细胞培养类型
2、动物组织培养
从动物体内取出组织，模拟体内的生理环境，在无菌、适温和丰富的营养条 件下，使离组织生存、生长并维持结构和功能的技术
（观看视频：用脂肪细胞培养骨 头-以色列干细胞治疗的新突破）
玻璃离子粘固剂（glass ionomer cement，GIC）
器官培养
培养类型 组Biblioteka 培养细胞培养Part2 植物细胞培养技术
二、动物细胞培养类型 1、动物器官培养
部分或整体器官在不损伤正常组织结构的条件下进行的培养，即仍保持组织 的三维结构，并模仿在各种状态下的器官功能
美国科学家从一只死亡的实验鼠 体内取出一颗完整的心脏，去除 其中的细胞结构，只留下心脏基 本的胶原结构，再向其注入从新 生鼠体内提取的未完全发育的心 脏细胞，并供给营养，成功地培 养出一颗活心脏
Part2 植物细胞培养技术
二、动物细胞培养类型 3、动物细胞培养
取动物胚胎或幼龄动物器官、组织。将材料剪碎，并用胰蛋白酶（或用胶原 蛋白酶）处理（消化），形成分散的单个细胞，将处理后的细胞移入培养基 中配成一定浓度的细胞悬浮液（观看视频：primary cells culture）
生化制药工艺
项目四 细胞工程制药技术
CONTENTS
目 录
1 细胞融合 2 植物细胞培养技术 3 动物细胞培养技术
03
动物细胞培养技术
Part2 植物细胞培养技术
一、动物细胞的生理特点 1、动物细胞生理特点
细胞的分裂周期长：12～18 h 细胞生长需贴附于基质，并有接触抑制现象 正常二倍体细胞的生长寿命有限 动物细胞对周围环境敏感 动物细胞对培养基的要求高 动物细胞对蛋白质的合成途径和修饰功能与细菌不同
生物技术制药课后习题答案
第一章绪论1生物技术是以生命科学为基础，利用生物体（或生物组织、细胞及其组分）的特性和功能，设计构建有预期性状的新物种或新品系，并与工程相结合，进行加工生产，为社会提供商品和服务的一个综合性的技术体系。
2生物技术的主要内容：P1基因工程、细胞工程、酶工程、发酵工程蛋白质工程：运用基因工程全套技术改变蛋白质结构的技术。
染色体工程：探索基因在染色体上的定位，异源基因导入、染色体结构改变。
生化工程：生物反应器及产品的分离、提纯技术。
3生物技术制药采用现代生物技术人为创造条件，借助微生物、植物或动物来生产所需的医药品过程被称为4生物技术药物采用DNA重组技术或其它生物新技术研制的蛋白质或核酸类药物才能被称为5生物药物生物技术药物与天然生化药物、微生物药物、海洋药物和生物制品一起归类为PPT复习题第二章基因工程制药1、简述基因工程制药的基本程序。
P162、说明基因工程技术用于制药的三个重要意义。
P15第一段第一行3、采用哪两种方法来确定目的cDNA克隆？P18（7目的基因c DN A的分离和鉴定）①核酸探针杂交法用层析法或高分辨率电泳技术(蛋白质双向电泳技术或质谱技术)分离出确定为药物的蛋白质，氨基酸测序，按照密码子对应原则合成出单链寡聚核苷酸，用做探针，与cDNA文库中的每一个克隆杂交。
这个方法的关键是分离目的蛋白，②免疫反应鉴定法（酶联免疫吸附检测）4、说明用大肠杆菌做宿主生产基因工程药物必须克服的6个困难。
①原核基因表达产物多为胞内产物，必须破胞分离，受胞内其它蛋白的干扰，纯化困难；②原核基因表达产物在细胞内多为不溶性(包含体, inclusi on body)，必须经过变性、复性处理以恢复药物蛋白的生物学活性，工艺复杂；③没有翻译后的加工机制，如糖基化，应用上受到限制；④产物的第一个氨基酸必然是甲酰甲硫氨酸，因无加工机制，常造成N-Met冗余，做为药物，容易引起免疫反应；⑤细菌的内毒素不容易清除；⑥细菌的蛋白酶常常把外源基因的表达产物消化；5、用蓝藻做宿主生产基因工程药物有什么优越性？蓝藻：很有前途的药物基因的宿主细胞①有内源质粒，美国Wolk实验室已构建1200种人工质粒，可用做基因载体。
动物细胞培养制药工艺
动物细胞培养
动物细胞培养技术
2、悬浮培养
概念：细胞在反应器内游离悬浮在培养液中生长的培 养过程。
优点： 操作简单，培养条件相对均一 传质和传氧较好，容易放大培养。
缺点： 细胞体积小 密度低 培养病毒易失去标记而降低免疫能力。
适用范围：悬浮细胞，兼性贴壁细胞，杂交瘤。 借鉴微生物发酵理论和经验，发挥动物细胞的特性。 培养容器：通气式搅拌和气升式生物反应器
动物细胞培养
动物细胞培养技术
3、半连续式操作
动物细胞培养生产药物中经常采用。已应用于大规模生产 乙肝表面抗原、t-PA等基因工程产物。
半连续操作特别适用于分泌表达型细胞，如杂交瘤细胞的 培养，尤其是微载体系统。
微载体系统培养基因工程CHO细胞，待细胞长满载体后， 反复收获细胞的分泌产物乙肝表面抗原，制备乙肝疫苗。
动物细胞培养
2、流加式操作
动物细胞培养技术
最常见的流加物质是葡萄糖、谷氨酰胺等能源和碳源物质。 通过流加控制，可实现高密度培养。
杂交瘤细胞培养，细胞密度可达1.4×107，生产抗体的产量 比分批操作提高几～10倍，可达500 mg/L。
由于培养体积不断变化，流加对过程的控制能力仍然有限 在实际生产中应用少。
动物细胞培养
1、单层贴壁培养
动物细胞培养技术
概念：细胞贴附于一定的固体支持表面上，形成单层 细胞的培养方法。大多数动物细胞属于贴壁依赖性，贴 壁培养是动物细胞培养的一种重要方法。
生长过程：
接种，细胞经过吸附、接触而贴附于基质表面； 进行生长、分裂繁殖，很快进入对数期。 数天就长满整个表面，形成致密单层细胞。
动物细胞培养技术
4、微载体培养
微载体
微载体：是指直径在60-250μm，能适用于贴壁细胞生长 的微珠。
动物细胞培养制药工艺
动物细胞培养制药
激素：胰岛素、促卵泡激素、甲状腺素。
细胞因子：表皮生长因子、成纤维细胞生 长因子和神经细胞生长因子。
贴附因子：纤维结合蛋白、胶原等
二、动物细胞培养的环境需求
水与渗透压 温度 氧气 pH 生长基质 抗生素
动物细胞培养基制备
动物细胞培养制药
1.水与渗透压
水:细胞反应的重要介质 高渗溶液:高于310 mOsm/kg， 低渗透压溶液:低于280mOsm/kg 离体培养的渗透压应控制为等渗透溶液 增 减 NaCl 的 浓 度 调 整 渗 透 压 ， 每 增 加 1 mg/ml NaCl，渗透压增加32 mOsm/kg。
CHO细胞不能合成等分N-乙酰葡萄糖胺，而鼠细 胞系却能形成半乳糖末端，对人有免疫原性。
要根据糖基化的结构，选择适宜的细胞系。
动物细胞表达系统
动物细胞培养制药
二、昆虫细胞表达系统与特征
昆虫病毒，转染昆虫细胞，表达出目标蛋白质。
昆虫病毒：杆状病毒科核多角体病毒。600多种昆虫
苜蓿尺蠖核多角体病毒－秋黏虫细胞表达系统，家 蚕核多角体病毒－家蚕幼虫表达系统。
动物细胞培养制药
合成培养基用化学成分明确的试剂配制的培 养基，组分稳定。
组成：无机盐、糖、氨基酸、维生素及其他 成分。
已有几十种合成培养基，大部分已商品化。
往往需要添加血清，才能培养。
动物细胞培养基制备
动物细胞培养制药
3.无血清培养基
全部用已知成分组配、不加血清的培养基。
合成培养基基础之上，添加激素与生长因子、结 合蛋白、贴壁与伸展因子、低分子营养成分。
动物细胞培养基制备
动物细胞培养制药
4. 无机盐类
Na＋和Cl－参与生理电活动 维持水平衡、保持渗透压和酸碱平衡 生理盐水的离子浓度（0.9% NaCl） Ca2＋、Mg2＋，细胞间的互黏稳定作用。 离体培养，螯合细胞间的Ca2＋和Mg2＋， 可以达到分散细胞的目的。
动物细胞培养制药工艺3课件
羧甲基纤维素：前景光明，需要做很多工作。
蛋白胨、乳白蛋白水解产物、胰蛋白磷酸盐、酵 母提取物、酵母水解产物等。
8.5.5 溶解氧检测与控制
1、溶解氧影响
较大氧压范围（15%~90% DO）内生长良好。低 水平阻碍细胞代谢，过高，产生氧自由基，对细 胞造成伤害。
不同细胞类型的最适溶解氧水平不同 20~80%是一个可选范围 低于20%对细胞生长不利 高于80%的氧浓度对细胞有毒害 加入不同比例的氧气、空气或氮气或二氧化碳 溶氧量的控制常常与pH值控制结合在一起，根据
需要进行调节。
8.5.6 温度和pH检测与控制
1、温度
动物细胞对温度变化很敏感，控制要求十分严格。 高灵敏温度计（±0.25℃）在线检测。温度探头
mmol/L。
2、代谢控制
如果存在过量的葡萄糖，细胞将消耗90%以上葡 萄糖作为乳酸分泌到培养液，即使在完全有氧条 件下也如此。
流加过量谷氨酰胺会导致铵离子、丙氨酸或天门 冬氨酸的积累。
限制葡萄糖的流加量，将减少乳酸的总量，增加 葡萄糖的产量系数。
限制谷氨酰胺的流加量，可减少铵盐和氨基酸的 生成。
1、搅拌剪切的检测
搅拌混合为生物反应器提供了均相环境，提高了 氧及其他营养物质的传递速率。
但搅拌产生剪切力会对哺乳动物细胞造成损伤。
对细胞损伤可用悬浮培养中的胞外蛋白浓度来表 征，它决定了细胞的裂解程度。
最常用的是细胞质中的乳酸脱氢酶（LDH），在 指数生长阶段为一常数。通过监测LDH释放可评 价不同搅拌对细胞损伤程度。
直接加HCl或NaOH不适合动物细胞培养。 磷酸盐缓冲液中的磷酸及高HEPES(羟乙基哌嗪
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搅拌、鼓泡、气升反应器：使用剪切保护剂。 多空微载体：用各种搅拌/混合强度检测，显微镜
下检查微载体的机械损伤程度。
3、转速
在动物细胞培养中，搅拌速率控制在 20~200 rpm为宜，所以需要更慢的驱动器， 即使是小范围的控制。
在对哺乳动物同源基因ced3（线虫C. Elegans的细胞 死亡基因）的研究中，首次 发现了具有半胱氨酸水解酶 活性的Caspase家族。
8.5.2 微生物污染检测与防治
1、污染的检测 细菌污染：肉汤培养基于37℃恒温培养，
检查。 支原体污染：染色、培养、DNA杂交和共
培养，至少同时使用两种方法。荧光染色 在荧光显微镜下观察。
思考题
分析动物细胞培养工艺过程检测和控制的 特点，如何优化过程控制？
分析比较动物细胞培养工艺与微生物发酵 工艺的异同。
Thanks for your attention
需要进行调节。
8.5.动物细胞对温度变化很敏感，控制要求十分严格。 高灵敏温度计（±0.25℃）在线检测。温度探头
（铂100），进行反馈控制。 预热培养基，或加热水套层，是温度恒定。 哺乳动物细胞：37℃；鸡胚细胞：39~40℃；昆
虫细胞25~28℃
2、污染的防治
使用抗生素，以避免轻度污染。注意在传代及种 子培养阶段不应使用抗生素，否则会掩盖早期污 染。
对于支原体污染，常用卡那霉素、金霉素处理培 养物。
卡那霉素对细胞无毒性，金霉素有较大毒性。注 意一旦支原体被消除后，就要及时终止抗生素的 使用，以免产生新的抗药性的支原体。
特异性的支原体血清、高温（如41℃，支原体对
一定溶氧范围内，耗氧速率可近似为一常数。 耗氧比速率：0.05~0.5 μmol/106细胞/h
CHO为0.15；BHK-21为0.2；鼠杂交瘤： 0.03~0.48
2、溶解氧控制
必须保证氧浓度高于临界氧浓度，提高氧传质系 数（kL）、传质面积（a）、传质动力（△C）都 能改善供氧。
不同细胞类型的最适溶解氧水平不同 20~80%是一个可选范围 低于20%对细胞生长不利 高于80%的氧浓度对细胞有毒害 加入不同比例的氧气、空气或氮气或二氧化碳 溶氧量的控制常常与pH值控制结合在一起，根据
热敏感）、支原体去除剂。
8.5.3 培养基成分检测与代谢控制
1、基质消耗的检测
营养的消耗：葡萄糖和谷氨酰胺的减少为指示； 副产物的积累：乳酸和铵离子的增加； 近红外测量技术可实现葡萄糖的在线测定。 控制铵离子浓度低于2~4 mmol/L，乳酸低于60
mmol/L。
2、代谢控制
如果存在过量的葡萄糖，细胞将消耗90%以上葡 萄糖作为乳酸分泌到培养液，即使在完全有氧条 件下也如此。
流加过量谷氨酰胺会导致铵离子、丙氨酸或天门 冬氨酸的积累。
限制葡萄糖的流加量，将减少乳酸的总量，增加 葡萄糖的产量系数。
限制谷氨酰胺的流加量，可减少铵盐和氨基酸的 生成。
如果进行双控制（同时控制葡萄糖和谷氨酰胺）， 乳酸和铵离子将同时减少，使细胞代谢编的更有 效。
Z-VAD-FMK（泛Caspase抑制剂/凋亡抑 制剂 ），YVAN
Caspase
尽管有许多信号可以诱导细 胞程序死亡，但它们有一些 共同的特征，其中之一是凋 亡时一系列细胞内蛋白水解 酶——Caspase的活化。
Caspase具有催化活性， “C”代表具有半胱氨酸水解 酶功能，“aspase”代表具 有切断天冬氨酸末端的功能。
2、pH值检测与控制
开酸始，p时H，会p下H为降7，.4但，不随能着低细于胞7产.0生。较精多确控CO制2和pH乳， 一般为7.0~7.5，其波动范围为0.05~0.9。
直接加HCl或NaOH不适合动物细胞培养。 磷酸盐缓冲液中的磷酸及高HEPES(羟乙基哌嗪
乙硫磺酸，一种非离子两性缓冲液, pH 7.2~7.4） 对细胞有毒性。 碳酸氢盐缓冲剂：加入CO2可降低pH值，加入碳 酸氢盐可提高pH值。缓冲能力弱。 控制DO：增加溶氧量会使培养基中CO2被置换出 来，导致pH值升高。应该合理配置，达到控制目 的。
对细胞损伤可用悬浮培养中的胞外蛋白浓度来表 征，它决定了细胞的裂解程度。
最常用的是细胞质中的乳酸脱氢酶（LDH），在 指数生长阶段为一常数。通过监测LDH释放可评 价不同搅拌对细胞损伤程度。
2、搅拌剪切控制—反应器设计
表面通气反应器：避免漩涡。高速搅拌，安装挡 板。
填充反应器：无顶部气体空间，消除夹带和气泡 破裂带来的剪切。
生物制药工程
主讲教师： 刘 凯 liukai_1982@
山东农业大学生命科学学院微生物系
第八章 动物细胞培养制药工艺
8.1 制药动物细胞的表达系统与特征 8.2 基因工程动物细胞系的构建 8.3 动物细胞培养基的制备 8.4 动物细胞培养技术 8.5 培养过程检测与工艺控制
培养基成分变化参数：葡萄糖消耗率、乳 酸生成率、铵离子浓度
生长状态参数：形态变化、活性高低、密 度大小
目标产物生产率：产物的合成与积累速度， 分泌情况
微生物的污染参数
8.5.1 细胞生长状态检测与控制
1、细胞数目与活性检测
离线分析：用血球计数板计数，或进行分光光度 计比色分析，确定反应器中细胞数目。
生产工艺中，优化二者之间关系，使之协调。
把细胞活力、ATP、DNA和蛋白质的含量，与生 物量或细胞计数、底物和产物代谢变化相结合， 评价代谢过程，建立调控模型，进行有效控制。
对于生长速率恒定的连续培养，细胞内ATP含量 与生长速率相关。
氨基酸的比吸收速率和比生成速率、细胞内酶 （如乳酸脱氢酶，谷氨酸草酰乙酸转氨酶）的比 释放速率，都可作为培养过程的瞬间参数和控制 节点的阈值。
蛋白胨、乳白蛋白水解产物、胰蛋白磷酸盐、酵 母提取物、酵母水解产物等。
8.5.5 溶解氧检测与控制
1、溶解氧影响
较大氧压范围（15%~90% DO）内生长良好。低 水平阻碍细胞代谢，过高，产生氧自由基，对细 胞造成伤害。
细胞类型、细胞密度、增殖速率、葡萄糖浓度以 及谷氨酰胺浓度等都影响耗氧速率。
2、细胞凋亡检测
凋亡细胞排斥活体染料，台盼蓝不能检测。 光学显微镜：直接形态观察，凋亡小体 荧光显微镜：荧光染料（Hoechst，
Hoechst/PI，吖啶橙/溴化乙锭）染色，观 察细胞核的形态。
Hoechst 33258染 色
DNA粘性3’-OH末端被荧光 标记的脱氧核苷酸末端转移 酶标记
使用剪切保护剂
离子表面活性剂：聚醚F-68和F-88，0.1%，首先 选用。
PVA（聚乙烯醇）：研究并不广泛，但效果也很 好。
混合分子量的PVP（聚乙烯吡咯烷酮）：鼓泡式 反应器内的剪切损伤。
血清：效果好，2~5%，但使蛋白质纯化变得复 杂，可能病毒污染，避免使用。
羧甲基纤维素：前景光明，需要做很多工作。
细胞活性：组织化学染色法和细胞形态的观察测 细胞活性。台盼蓝染色排除法（死细胞质膜不完 整，成蓝色），MTT比色分析（增殖细胞能量代 谢中，琥珀酸脱氢酶能将四甲基偶氮唑盐(MTT) 还原为不溶的蓝色的甲臜结晶物质；死细胞该酶 已失活。 ）
在线分析：近红外线传感器，可把细胞计数和活 性的控制结合在一起。
动物细胞群体生长特点
动物细胞体积大，无细胞壁，细胞倍增时 间长，生长缓慢，易受污染；
培养过程需氧量少，对机械搅拌或剪切力 敏感；
细胞间主要以聚集体形成存在； 原代细胞一般繁殖50代左右即退化死亡。
8.5 细胞培养过程的检测与工艺控制
生长环境参数：温度、pH、溶氧、转速、 液流量
A0-EB双重染色法
2、细胞凋亡检测
凋亡的主要生化特征是激活一种Ca2+/Mg2+依赖型 的核酸内切酶，将核DNA切割成200bp或更大的 片段，而坏死细胞不会出现DNA断裂片段。
细胞凋亡控制
细胞凋亡的化学抑制剂 乙酰半胱氨酸NAC 吡咯烷二硫氨基甲酸酯PDTC
半胱天冬蛋白酶Caspase抑制剂（参与诱导凋 亡的Caspase分成两大类：启动酶（inititaor） 和效应酶（effector）它们分别在死亡信号转导 的上游和下游发挥作用。 ）
8.5.7 目标产物检测与控制
目标产物进行跟踪检测：免疫方法测定活性。 产物并非100%具有生物活性，它依赖于糖基化完
整性和蛋白酶的降解程度。 活性影响因素：培养方式、生长时期、葡萄糖和
铵离子浓度、培养液成分和pH、氧浓度等。 提高比生长速率对增加产量有积极作用：非培养
液成分，添加丁酸、增加渗透压等。
如果能自动检测产物并计算产率，通过计算程序 可使过程自动优化。多元参数分析的计算程序， 能改变所有的相关参数，最终找到一个最佳的生 产条件。
8.5.4 搅拌剪切的检测与控制
1、搅拌剪切的检测
搅拌混合为生物反应器提供了均相环境，提高了 氧及其他营养物质的传递速率。
但搅拌产生剪切力会对哺乳动物细胞造成损伤。