第8章动物细胞培养制药工艺-3
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热敏感）、支原体去除剂。
8.5.3 培养基成分检测与代谢控制
1、基质消耗的检测
营养的消耗：葡萄糖和谷氨酰胺的减少为指示； 副产物的积累：乳酸和铵离子的增加； 近红外测量技术可实现葡萄糖的在线测定。 控制铵离子浓度低于2~4 mmol/L，乳酸低于60
mmol/L。
2、代谢控制
生物制药工程
主讲教师： 刘 凯 liukai_1982@163.com
山东农业大学生命科学学院微生物系
第八章 动物细胞培养制药工艺
8.1 制药动物细胞的表达系统与特征 8.2 基因工程动物细胞系的构建 8.3 动物细胞培养基的制备 8.4 动物细胞培养技术 8.5 培养过程检测与工艺控制
Z-VAD-FMK（泛Caspase抑制剂/凋亡抑 制剂 ），YVAN
Caspase
尽管有许多信号可以诱导细 胞程序死亡，但它们有一些 共同的特征，其中之一是凋 亡时一系列细胞内蛋白水解 酶——Caspase的活化。
Caspase具有催化活性， “C”代表具有半胱氨酸水解 酶功能，“aspase”代表具 有切断天冬氨酸末端的功能。
使用剪切保护剂
离子表面活性剂：聚醚F-68和F-88，0.1%，首先 选用。
PVA（聚乙烯醇）：研究并不广泛，但效果也很 好。
混合分子量的PVP（聚乙烯吡咯烷酮）：鼓泡式 反应器内的剪切损伤。
血清：效果好，2~5%，但使蛋白质纯化变得复 杂，可能病毒污染，避免使用。
羧甲基纤维素：前景光明，需要做很多工作。
思考题
分析动物细胞培养工艺过程检测和控制的 特点，如何优化过程控制？
分析比较动物细胞培养工艺与微生物发酵 工艺的异同。
Thanks for your attention
A0-EB双重染色法
2、细胞凋亡检测
凋亡的主要生化特征是激活一种Ca2+/Mg2+依赖型 的核酸内切酶，将核DNA切割成200bp或更大的 片段，而坏死细胞不会出现DNA断裂片段。
细胞凋亡控制
细胞凋亡的化学抑制剂 乙酰半胱氨酸NAC 吡咯烷二硫氨基甲酸酯PDTC
半胱天冬蛋白酶Caspase抑制剂（参与诱导凋 亡的Caspase分成两大类：启动酶（inititaor） 和效应酶（effector）它们分别在死亡信号转导 的上游和下游发挥作用。 ）
培养基成分变化参数：葡萄糖消耗率、乳 酸生成率、铵离子浓度
生长状态参数：形态变化、活性高低、密 度大小
目标产物生产率：产物的合成与积累速度， 分泌情况
微生物的污染参数
8.5.1 细胞生长状态检测与控制
1、细胞数目与活性检测
离线分析：用血球计数板计数，或进行分光光度 计比色分析，确定反应器中细胞数目。
一定溶氧范围内，耗氧速率可近似为一常数。 耗氧比速率：0.05~0.5 μmol/106细胞/h
CHO为0.15；BHK-21为0.2；鼠杂交瘤： 0.03~0.48
2、溶解氧控制
必须保证氧浓度高于临界氧浓度，提高氧传质系 数（kL）、传质面积（a）、传质动力（△C）都 能改善供氧。
不同细胞类型的最适溶解氧水平不同 20~80%是一个可选范围 低于20%对细胞生长不利 高于80%的氧浓度对细胞有毒害 加入不同比例的氧气、空气或氮气或二氧化碳 溶氧量的控制常常与pH值控制结合在一起，根据
2、细胞凋亡检测
凋亡细胞排斥活体染料，台盼蓝不能检测。 光学显微镜：直接形态观察，凋亡小体 荧光显微镜：荧光染料（Hoechst，
Hoechst/PI，吖啶橙/溴化乙锭）染色，观 察细胞核的形态。
Hoechst 33258染 色
DNA粘性3’-OH末端被荧光 标记的脱氧核苷酸末端转移 酶标记
鼓泡反应器：气体应该从生物反应器重移走。或 使用高径比较大（至少2-3）的反应器进行悬浮培 养。
搅拌、鼓泡、气升反应器：使用剪切保护剂。 多空微载体：用各种搅拌/混合强度检测，显微镜
下检查微载体的机械损伤程度。
3、转速
在动物细胞培养中，搅拌速率控制在 20~200 rpm为宜，所以需要更慢的驱动器， 即使是小范围的控制。
在对哺乳动物同源基因ced3（线虫C. Elegans的细胞 死亡基因）的研究中，首次 发现了具有半胱氨酸水解酶 活性的Caspase家族。
8.5.2 微生物污染检测与防治
1、污染的检测 细菌污染：肉汤培养基于37℃恒温培养，
检查。 支原体污染：染色、培养、DNA杂交和共
培养，至少同时使用两种方法。荧光染色 在荧光显微镜下观察。
动物细胞群体生长特点
动物细胞体积大，无细胞壁，细胞倍增时 间长，生长缓慢，易受污染；
培养过程需氧量少，对机械搅拌或剪切力 敏感；
细胞间主要以聚集体形成百度文库在； 原代细胞一般繁殖50代左右即退化死亡。
8.5 细胞培养过程的检测与工艺控制
生长环境参数：温度、pH、溶氧、转速、 液流量
2、pH值检测与控制
开酸始，p时H，会p下H为降7，.4但，不随能着低细于胞7产.0生。较精多确控CO制2和pH乳， 一般为7.0~7.5，其波动范围为0.05~0.9。
直接加HCl或NaOH不适合动物细胞培养。 磷酸盐缓冲液中的磷酸及高HEPES(羟乙基哌嗪
乙硫磺酸，一种非离子两性缓冲液, pH 7.2~7.4） 对细胞有毒性。 碳酸氢盐缓冲剂：加入CO2可降低pH值，加入碳 酸氢盐可提高pH值。缓冲能力弱。 控制DO：增加溶氧量会使培养基中CO2被置换出 来，导致pH值升高。应该合理配置，达到控制目 的。
生产工艺中，优化二者之间关系，使之协调。
把细胞活力、ATP、DNA和蛋白质的含量，与生 物量或细胞计数、底物和产物代谢变化相结合， 评价代谢过程，建立调控模型，进行有效控制。
对于生长速率恒定的连续培养，细胞内ATP含量 与生长速率相关。
氨基酸的比吸收速率和比生成速率、细胞内酶 （如乳酸脱氢酶，谷氨酸草酰乙酸转氨酶）的比 释放速率，都可作为培养过程的瞬间参数和控制 节点的阈值。
2、污染的防治
使用抗生素，以避免轻度污染。注意在传代及种 子培养阶段不应使用抗生素，否则会掩盖早期污 染。
对于支原体污染，常用卡那霉素、金霉素处理培 养物。
卡那霉素对细胞无毒性，金霉素有较大毒性。注 意一旦支原体被消除后，就要及时终止抗生素的 使用，以免产生新的抗药性的支原体。
特异性的支原体血清、高温（如41℃，支原体对
蛋白胨、乳白蛋白水解产物、胰蛋白磷酸盐、酵 母提取物、酵母水解产物等。
8.5.5 溶解氧检测与控制
1、溶解氧影响
较大氧压范围（15%~90% DO）内生长良好。低 水平阻碍细胞代谢，过高，产生氧自由基，对细 胞造成伤害。
细胞类型、细胞密度、增殖速率、葡萄糖浓度以 及谷氨酰胺浓度等都影响耗氧速率。
对细胞损伤可用悬浮培养中的胞外蛋白浓度来表 征，它决定了细胞的裂解程度。
最常用的是细胞质中的乳酸脱氢酶（LDH），在 指数生长阶段为一常数。通过监测LDH释放可评 价不同搅拌对细胞损伤程度。
2、搅拌剪切控制—反应器设计
表面通气反应器：避免漩涡。高速搅拌，安装挡 板。
填充反应器：无顶部气体空间，消除夹带和气泡 破裂带来的剪切。
细胞活性：组织化学染色法和细胞形态的观察测 细胞活性。台盼蓝染色排除法（死细胞质膜不完 整，成蓝色），MTT比色分析（增殖细胞能量代 谢中，琥珀酸脱氢酶能将四甲基偶氮唑盐(MTT) 还原为不溶的蓝色的甲臜结晶物质；死细胞该酶 已失活。 ）
在线分析：近红外线传感器，可把细胞计数和活 性的控制结合在一起。
8.5.7 目标产物检测与控制
目标产物进行跟踪检测：免疫方法测定活性。 产物并非100%具有生物活性，它依赖于糖基化完
整性和蛋白酶的降解程度。 活性影响因素：培养方式、生长时期、葡萄糖和
铵离子浓度、培养液成分和pH、氧浓度等。 提高比生长速率对增加产量有积极作用：非培养
液成分，添加丁酸、增加渗透压等。
如果存在过量的葡萄糖，细胞将消耗90%以上葡 萄糖作为乳酸分泌到培养液，即使在完全有氧条 件下也如此。
流加过量谷氨酰胺会导致铵离子、丙氨酸或天门 冬氨酸的积累。
限制葡萄糖的流加量，将减少乳酸的总量，增加 葡萄糖的产量系数。
限制谷氨酰胺的流加量，可减少铵盐和氨基酸的 生成。
如果进行双控制（同时控制葡萄糖和谷氨酰胺）， 乳酸和铵离子将同时减少，使细胞代谢编的更有 效。
需要进行调节。
8.5.6 温度和pH检测与控制
1、温度
动物细胞对温度变化很敏感，控制要求十分严格。 高灵敏温度计（±0.25℃）在线检测。温度探头
（铂100），进行反馈控制。 预热培养基，或加热水套层，是温度恒定。 哺乳动物细胞：37℃；鸡胚细胞：39~40℃；昆
虫细胞25~28℃
如果能自动检测产物并计算产率，通过计算程序 可使过程自动优化。多元参数分析的计算程序， 能改变所有的相关参数，最终找到一个最佳的生 产条件。
8.5.4 搅拌剪切的检测与控制
1、搅拌剪切的检测
搅拌混合为生物反应器提供了均相环境，提高了 氧及其他营养物质的传递速率。
但搅拌产生剪切力会对哺乳动物细胞造成损伤。
8.5.3 培养基成分检测与代谢控制
1、基质消耗的检测
营养的消耗：葡萄糖和谷氨酰胺的减少为指示； 副产物的积累：乳酸和铵离子的增加； 近红外测量技术可实现葡萄糖的在线测定。 控制铵离子浓度低于2~4 mmol/L，乳酸低于60
mmol/L。
2、代谢控制
生物制药工程
主讲教师： 刘 凯 liukai_1982@163.com
山东农业大学生命科学学院微生物系
第八章 动物细胞培养制药工艺
8.1 制药动物细胞的表达系统与特征 8.2 基因工程动物细胞系的构建 8.3 动物细胞培养基的制备 8.4 动物细胞培养技术 8.5 培养过程检测与工艺控制
Z-VAD-FMK（泛Caspase抑制剂/凋亡抑 制剂 ），YVAN
Caspase
尽管有许多信号可以诱导细 胞程序死亡，但它们有一些 共同的特征，其中之一是凋 亡时一系列细胞内蛋白水解 酶——Caspase的活化。
Caspase具有催化活性， “C”代表具有半胱氨酸水解 酶功能，“aspase”代表具 有切断天冬氨酸末端的功能。
使用剪切保护剂
离子表面活性剂：聚醚F-68和F-88，0.1%，首先 选用。
PVA（聚乙烯醇）：研究并不广泛，但效果也很 好。
混合分子量的PVP（聚乙烯吡咯烷酮）：鼓泡式 反应器内的剪切损伤。
血清：效果好，2~5%，但使蛋白质纯化变得复 杂，可能病毒污染，避免使用。
羧甲基纤维素：前景光明，需要做很多工作。
思考题
分析动物细胞培养工艺过程检测和控制的 特点，如何优化过程控制？
分析比较动物细胞培养工艺与微生物发酵 工艺的异同。
Thanks for your attention
A0-EB双重染色法
2、细胞凋亡检测
凋亡的主要生化特征是激活一种Ca2+/Mg2+依赖型 的核酸内切酶，将核DNA切割成200bp或更大的 片段，而坏死细胞不会出现DNA断裂片段。
细胞凋亡控制
细胞凋亡的化学抑制剂 乙酰半胱氨酸NAC 吡咯烷二硫氨基甲酸酯PDTC
半胱天冬蛋白酶Caspase抑制剂（参与诱导凋 亡的Caspase分成两大类：启动酶（inititaor） 和效应酶（effector）它们分别在死亡信号转导 的上游和下游发挥作用。 ）
培养基成分变化参数：葡萄糖消耗率、乳 酸生成率、铵离子浓度
生长状态参数：形态变化、活性高低、密 度大小
目标产物生产率：产物的合成与积累速度， 分泌情况
微生物的污染参数
8.5.1 细胞生长状态检测与控制
1、细胞数目与活性检测
离线分析：用血球计数板计数，或进行分光光度 计比色分析，确定反应器中细胞数目。
一定溶氧范围内，耗氧速率可近似为一常数。 耗氧比速率：0.05~0.5 μmol/106细胞/h
CHO为0.15；BHK-21为0.2；鼠杂交瘤： 0.03~0.48
2、溶解氧控制
必须保证氧浓度高于临界氧浓度，提高氧传质系 数（kL）、传质面积（a）、传质动力（△C）都 能改善供氧。
不同细胞类型的最适溶解氧水平不同 20~80%是一个可选范围 低于20%对细胞生长不利 高于80%的氧浓度对细胞有毒害 加入不同比例的氧气、空气或氮气或二氧化碳 溶氧量的控制常常与pH值控制结合在一起，根据
2、细胞凋亡检测
凋亡细胞排斥活体染料，台盼蓝不能检测。 光学显微镜：直接形态观察，凋亡小体 荧光显微镜：荧光染料（Hoechst，
Hoechst/PI，吖啶橙/溴化乙锭）染色，观 察细胞核的形态。
Hoechst 33258染 色
DNA粘性3’-OH末端被荧光 标记的脱氧核苷酸末端转移 酶标记
鼓泡反应器：气体应该从生物反应器重移走。或 使用高径比较大（至少2-3）的反应器进行悬浮培 养。
搅拌、鼓泡、气升反应器：使用剪切保护剂。 多空微载体：用各种搅拌/混合强度检测，显微镜
下检查微载体的机械损伤程度。
3、转速
在动物细胞培养中，搅拌速率控制在 20~200 rpm为宜，所以需要更慢的驱动器， 即使是小范围的控制。
在对哺乳动物同源基因ced3（线虫C. Elegans的细胞 死亡基因）的研究中，首次 发现了具有半胱氨酸水解酶 活性的Caspase家族。
8.5.2 微生物污染检测与防治
1、污染的检测 细菌污染：肉汤培养基于37℃恒温培养，
检查。 支原体污染：染色、培养、DNA杂交和共
培养，至少同时使用两种方法。荧光染色 在荧光显微镜下观察。
动物细胞群体生长特点
动物细胞体积大，无细胞壁，细胞倍增时 间长，生长缓慢，易受污染；
培养过程需氧量少，对机械搅拌或剪切力 敏感；
细胞间主要以聚集体形成百度文库在； 原代细胞一般繁殖50代左右即退化死亡。
8.5 细胞培养过程的检测与工艺控制
生长环境参数：温度、pH、溶氧、转速、 液流量
2、pH值检测与控制
开酸始，p时H，会p下H为降7，.4但，不随能着低细于胞7产.0生。较精多确控CO制2和pH乳， 一般为7.0~7.5，其波动范围为0.05~0.9。
直接加HCl或NaOH不适合动物细胞培养。 磷酸盐缓冲液中的磷酸及高HEPES(羟乙基哌嗪
乙硫磺酸，一种非离子两性缓冲液, pH 7.2~7.4） 对细胞有毒性。 碳酸氢盐缓冲剂：加入CO2可降低pH值，加入碳 酸氢盐可提高pH值。缓冲能力弱。 控制DO：增加溶氧量会使培养基中CO2被置换出 来，导致pH值升高。应该合理配置，达到控制目 的。
生产工艺中，优化二者之间关系，使之协调。
把细胞活力、ATP、DNA和蛋白质的含量，与生 物量或细胞计数、底物和产物代谢变化相结合， 评价代谢过程，建立调控模型，进行有效控制。
对于生长速率恒定的连续培养，细胞内ATP含量 与生长速率相关。
氨基酸的比吸收速率和比生成速率、细胞内酶 （如乳酸脱氢酶，谷氨酸草酰乙酸转氨酶）的比 释放速率，都可作为培养过程的瞬间参数和控制 节点的阈值。
2、污染的防治
使用抗生素，以避免轻度污染。注意在传代及种 子培养阶段不应使用抗生素，否则会掩盖早期污 染。
对于支原体污染，常用卡那霉素、金霉素处理培 养物。
卡那霉素对细胞无毒性，金霉素有较大毒性。注 意一旦支原体被消除后，就要及时终止抗生素的 使用，以免产生新的抗药性的支原体。
特异性的支原体血清、高温（如41℃，支原体对
蛋白胨、乳白蛋白水解产物、胰蛋白磷酸盐、酵 母提取物、酵母水解产物等。
8.5.5 溶解氧检测与控制
1、溶解氧影响
较大氧压范围（15%~90% DO）内生长良好。低 水平阻碍细胞代谢，过高，产生氧自由基，对细 胞造成伤害。
细胞类型、细胞密度、增殖速率、葡萄糖浓度以 及谷氨酰胺浓度等都影响耗氧速率。
对细胞损伤可用悬浮培养中的胞外蛋白浓度来表 征，它决定了细胞的裂解程度。
最常用的是细胞质中的乳酸脱氢酶（LDH），在 指数生长阶段为一常数。通过监测LDH释放可评 价不同搅拌对细胞损伤程度。
2、搅拌剪切控制—反应器设计
表面通气反应器：避免漩涡。高速搅拌，安装挡 板。
填充反应器：无顶部气体空间，消除夹带和气泡 破裂带来的剪切。
细胞活性：组织化学染色法和细胞形态的观察测 细胞活性。台盼蓝染色排除法（死细胞质膜不完 整，成蓝色），MTT比色分析（增殖细胞能量代 谢中，琥珀酸脱氢酶能将四甲基偶氮唑盐(MTT) 还原为不溶的蓝色的甲臜结晶物质；死细胞该酶 已失活。 ）
在线分析：近红外线传感器，可把细胞计数和活 性的控制结合在一起。
8.5.7 目标产物检测与控制
目标产物进行跟踪检测：免疫方法测定活性。 产物并非100%具有生物活性，它依赖于糖基化完
整性和蛋白酶的降解程度。 活性影响因素：培养方式、生长时期、葡萄糖和
铵离子浓度、培养液成分和pH、氧浓度等。 提高比生长速率对增加产量有积极作用：非培养
液成分，添加丁酸、增加渗透压等。
如果存在过量的葡萄糖，细胞将消耗90%以上葡 萄糖作为乳酸分泌到培养液，即使在完全有氧条 件下也如此。
流加过量谷氨酰胺会导致铵离子、丙氨酸或天门 冬氨酸的积累。
限制葡萄糖的流加量，将减少乳酸的总量，增加 葡萄糖的产量系数。
限制谷氨酰胺的流加量，可减少铵盐和氨基酸的 生成。
如果进行双控制（同时控制葡萄糖和谷氨酰胺）， 乳酸和铵离子将同时减少，使细胞代谢编的更有 效。
需要进行调节。
8.5.6 温度和pH检测与控制
1、温度
动物细胞对温度变化很敏感，控制要求十分严格。 高灵敏温度计（±0.25℃）在线检测。温度探头
（铂100），进行反馈控制。 预热培养基，或加热水套层，是温度恒定。 哺乳动物细胞：37℃；鸡胚细胞：39~40℃；昆
虫细胞25~28℃
如果能自动检测产物并计算产率，通过计算程序 可使过程自动优化。多元参数分析的计算程序， 能改变所有的相关参数，最终找到一个最佳的生 产条件。
8.5.4 搅拌剪切的检测与控制
1、搅拌剪切的检测
搅拌混合为生物反应器提供了均相环境，提高了 氧及其他营养物质的传递速率。
但搅拌产生剪切力会对哺乳动物细胞造成损伤。