免疫荧光双染
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免疫荧光双染
在同一组织细胞标本上需要同时检测两种抗原时，需进行双重荧光染色。
双重免疫荧光标记法（double immu nofluoresce nee labeli ng method）也分为直接法和间接法。
冰冻切片荧光tunel +免疫荧光双标实验步骤
1、？冰冻切片固定：冰冻切片从冰箱拿出来复温，晾干水分，冷丙酮固
定10min，待丙酮完全干后于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
2、?修复：切片稍甩干后用组化笔在组织周围画圈（防止液体流走），
在圈内滴加蛋白酶K工作液（蛋白酶K储存液用PBS?1:9稀释）覆盖组织，
37度温箱孵育30min。
将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
3、？破膜：切片稍甩干后在圈内滴加破膜工作液覆盖组织，常温下孵育
20min，将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
4、？加试剂1,2：按片子数量和组织大小取tunel试剂盒内适量试剂1?
（TdT）? 和试剂2（dUTP）按2:29混合（试剂1,2为现配现用），加到圈内覆盖组织，切片平放于湿盒内，37 C恒温孵育2小时，湿盒内加少量水保持湿度。
5、?BSA封闭:将玻片置于PBS （PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，
每次5min，在圈内滴加用3%BSA均匀覆盖组织，室温封闭30min。
6、？加一抗：轻轻甩掉封闭液，在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗，
切片平放于湿盒内4 °孵育过夜。
（湿盒内加少量水防止抗体蒸发）7、？加二
抗：玻片置于PBS ( PH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min 。
切片稍甩干后在圈内滴加与一抗相应种属的二抗覆盖组织，避光室温孵育50min 。
8、？DAPI复染细胞核：切片用PBS( PH7.4)洗涤3次，每次5min。
去除PBS
后在圈内滴加DAPI 染液，避光室温孵育10min。
9、封片：玻片置于PBS (PH7.4) 中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次
5min 。
切片稍甩干后用抗荧光淬灭封片剂封片。
10、?镜检拍照：切片于尼康倒置荧光显微镜下观察并采集图像。
(紫
外激发波长330-380nm，发射波长420nm；FITC绿光激发波长465-495nm，
发射波长515-555?nm；CY3 红光激发波长510-560，发射波长590nm)
石蜡切片荧光tunel +免疫荧光双标实验步骤
1、?石蜡切片脱蜡至水：依次将切片放入二甲苯I 15- 20min-二甲苯
n 15- 20min-无水乙醇I 10min-无水乙醇n 10min-95%酒精5min-90%酒精
5min-80%酒精5min-70%酒精5min-蒸馏水洗(冬天脱蜡时间稍微延长) 。
2、?修复：切片稍甩干后用组化笔在组织周围画圈(防止液体流走)，
在圈内滴加蛋白酶K工作液(蛋白酶K储存液用PBS?1:9稀释)覆盖组织，
37度温箱孵育30min。
将玻片置于PBS ( PH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3 次，每次5min 。
3、?破膜：切片稍甩干后在圈内滴加破膜工作液覆盖组织，常温下孵育
20min，将玻片置于PBS( PH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
4、？加试剂1,2：按片子数量和组织大小取tunel试剂盒内适量试剂1?(TdT)?
和试剂2(dUTP)按2:29混合，加到圈内覆盖组织，切片平放于湿盒内，
37C恒温箱孵育2小时，湿盒内加少量水保持湿度。
5、？BSA封闭:将玻片置于PBS ( PH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次，
每次5min，在圈内滴加用3%BSA均匀覆盖组织，室温圭寸闭30min。
6、？加一抗：轻轻甩掉封闭液，在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗，切
片平放于湿盒内4 °孵育过夜。
(湿盒内加少量水防止抗体蒸发)
7、？加二抗：玻片置于PBS ( PH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次
5min。
切片稍甩干后在圈内滴加与一抗相应种属的二抗覆盖组织，避光室温孵育
50min。
8、？DAPI复染细胞核：切片用PBS (PH7.4)洗涤3次，每次5min。
去除PBS
后在圈内滴加DAPI染液，避光室温孵育10min。
9、封片：玻片置于PBS (PH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次
5min。
切片稍甩干后用抗荧光淬灭封片剂封片。
10、?镜检拍照：切片于尼康倒置荧光显微镜下观察并采集图像。
(紫
外激发波长330-380nm，发射波长420nm；FITC绿光激发波长465-495nm，发射波长515-555?nm; CY3红光激发波长510-560,发射波长590nm)
1、荧光染色后一般在1h内完成观察，或于4C保存4h,时间过长，可能会使荧光提前衰退。
2、每次试验均需设置以下三种对照：
(1)阳性对照：阳性血清+荧光标记物; ⑵阴性对照：阴性血清+荧光标记物;
(3)荧光标记物对照：PBS荧光标记物。