多维液相色谱分离技术在复杂蛋白质组学样品鉴定中的应用

多维液相色谱分离技术在复杂蛋白质组学样品鉴定中的应用作者：张罗敷胡晓芳徐学敏（上海交通大学上海200030）期刊：现代生物医学进展Progress in Modern Biomedicine Vol.13 NO.1 JAN.2013一目的在蛋白质组学研究中，无论是以分析生物体内尽可能多的蛋白质组成情况的" 竭泽法" 研究策略，还是以分析不同时期细胞内蛋白质组成变化的"功能法" 研究策略，若要良好的实现研究目标，很大程度上取决于是否有强大的样品分离和鉴手段，对蛋白质组样本进行深入的分析。

生物体内蛋白质组的复杂性很高，其动态范围达到1010，而质谱检测范围具有一定的限制性。

对于复杂的蛋白组学样品，在进入质谱检测之前进行有效的分离是提高质谱检测效率的关键。

经典的蛋白质组学样品分离手段是二维凝胶电泳（2D-E），蛋白质混合物先后按照等电点差异和分子量差异，在凝胶上分离和富集，这种方法能分析数千个蛋白质，在蛋白质组学研究中发挥过重大作用。

但是，由于基于二维凝胶电泳的蛋白质分离和鉴定技术耗费人力，并且在高分子量蛋白、低分子量蛋白、极碱性蛋白和疏水性蛋白检测方面有限制。

近年来，随着蛋白组学技术的发展，液相色谱- 串联质谱的联用技术（液质联用）逐渐成为蛋白组学的主流技术。

高效液相色谱（high performance liquid chro-matography，HPLC）由于其高自动化、高重现性以及高分离效率，成为蛋白和肽段分离的重要方法，而且通过与质谱联用，能够形成高自动化的分离和鉴定系统。

在基于液质联用的蛋白质组学工作方法中，常使用"鸟枪法（shotgun strategy）"，即蛋白质混合物通过酶解后生成的肽段混合物进行色谱分离，并将洗脱的肽段连续地输送到质谱中检测。

现在人们普遍认为，由于从实际生物学样本中提取的蛋白质组学样品复杂性很高，仅通过一维色谱分离无法对其达到满意的分离效果，多维液相色谱分离技术由此应运而生。

" 多维液相色谱"（multi-dimensional liquid chromatography，MDLC）是指通过不同分离原理的液相色谱的串联使用，提高分离系统的峰容量和分辨率，从而实现复杂样品充分分离的一种技术。

根据Giddings 等建立的数学模型，在理想的多维液相色谱分离系统中，每一维分离都应该是正交的，即具有相互独立的分离原理。

此时多维液相色谱系统的总峰容量（n）等于系统中每一维分离的峰容量（ni）的乘积，即n=n1×n2×n3……。

因此，恰当使用各种分离模式，可以使单维的色谱分离效果得到最大的发挥，组合形成的多维色谱分离系统可以大幅度地提高分离系统的峰容量和分离能力，充分解析复杂程度较高的样品。

在本文中，我们介绍了在蛋白质组学研究中用到的多种多维液相色谱分离系统。

在这些系统中，为了使样品得到充足的分离，多种不同的分离原理HPLC 方法被灵活地结合运用。

充分利用样品分子的各种理化特性，在每一个分离维度上都尽量达到较好的分离效果，在整体上有效降低了样品的复杂程度。

同时，在不断追求深入而全面的蛋白鉴定的同时，多维液相色谱分离系统的维数也有所提高，出现了二维、三维甚至更高分离维数的系统。

二做了什么1二维液相色谱分离系统为了有效的分离在鸟枪法分析方法中产生的复杂肽段混合物，二维液相色谱分离系统（two dimensional liquid chro-matography，2DLC）结合了两种原理不同的HPLC 类型，先后对肽段混合物进行2 次分离。

最常用的2DLC 是离子交换色谱- 反相色谱的二维串联。

1999 年，J. Yates 实验室首次提出了将强阳离子交换（strong cation exchange，SCX）色谱- 反相色谱这一二维分离系统和质谱连接，后来称为多维蛋白鉴定技术（multi-dimensional protein identification technology，Mud PIT）的高自动化分析方法。

在这一方法中，通过一根前后两段分别装有SCX 和PR 填料的双相毛细管柱构建了在线SCX-RP 分离系统。

在这一方法中的两维分离有着良好的正交性，肽段混合物在第一维SCX 中通过增加的盐浓度梯度台阶，按照其带电状态分离，在第二维RP 中按照疏水性质分离，利用两种不同的色谱分离机制，将在第一维色谱中分离程度较低的肽段继续在第二维色谱中进一步分离。

而且，这一系统中双相柱的使用，避免了阀切换系统和管路系统的死体积影响，在一定程度上提高了2DLC 的分离效率。

该系统在2001 年的研究中被应用于酵母细胞裂解液的蛋白质组检测中，在一次实验中能鉴定到1484 个蛋白，蛋白性质分析发现这些鉴定到的蛋白涵盖较大的丰度和各种理化性质。

为了进一步优化此系统，Wolters等使用挥发性盐进行SCX 洗脱，以减少离子化阶段盐离子对肽段的抑制；另一些研究组为了实现在线除盐，发展了含有富集柱的柱切换系统，增加了二维色谱的兼容性。

在许多已经针对蛋白质组学研究而设计的商业化二维液相色谱分离系统中，大多都采用了自动化技术上发展比较成熟的强阳离子交换色谱- 反相色谱串联的系统。

在二维液相色谱分离系统中，除了阳离子交换色谱常担任第一维分离之外，其他几种不同原理的色谱类型也能随着待研究样品的特性被选择为第一维分离。

例如，肽段在发生磷酸化或糖基化修饰之后，电性发生了变化，亲水性也增强，可以使用阴离子交换色谱（anion exchange，AX）或亲水作用色谱（hy-drophilic interaction chromatography，HILIC）分离。

另外还有诸如RP1-RP2（RP1 和RP2 分别在不同p H 条件下运行）、SEC-RPLC等。

Gilar 等将多种二维液相色谱串联系统的正交性和分离能力进行了对比，包括SCX-RP、RP1-RP2、SEC-RP、HILIC-RP。

其中，由于单维色谱类型本身就有着较高的分离能力，以及肽段样品在两维色谱中洗脱情况差异较大，RP1-RP2、HILIC-RP、SCX-RPLC 这几种系统都有着良好的正交性和峰容量。

在二维液相色谱分离中，两种不同的色谱分离方法叠加，已经显示出了多维分离方法的高分离能力。

为了进一步提高复杂样品的蛋白组学鉴定的深度和广度，研究者已经在此基础上发展了三维液相色谱分离系统，进一步提高了样品的分离程度。

2 基于肽段水平一维分离的三维液相色谱分离系统为了进一步增加复杂的蛋白质组学样品的分离程度，直接的方法是在经典的二维液相色谱分离的基础上，在前端加上一维肽段水平的预分离，建立肽段水平上的三维液相色谱分离系统。

Wolters 等在Mud PIT 法之前加入了一维基于肽段分离的离线反相色谱，将酵母细胞裂解液的酶解产物先按照极性差异分离为5 个组分，鉴定到的蛋白数目为不通过预分离而直接Mud PIT 分析的2.1 倍，体现了三维液相色谱分离潜在的能力。

Mc Donald 等将Mud PIT 法中所用的SCX-RP 双相柱扩展为RP1-SCX-RP2 三相柱，这段添加在最前端的RP 的主要作用是实现在线除盐。

以牛微管相关蛋白的肽段混合物为样品，和经典的Mud PIT 方法相比，三相柱的蛋白鉴定数目有所升高，表明有效的除盐步骤能够有助于样品的后续分离增加蛋白的鉴定数目。

不过，这里使用第一维RP1 实际上并没有真的将肽段通过此段分离为多个组分，因此，不是完全的三维液相色谱分离系统，只是Mud PIT 方法的初步延伸。

在此基础上，Wei 等用类似的三相混合色谱柱（RP1-SCX-RP2）分离酵母细胞的全酶解产物。

在这一系统中，通过对结合于第一段反相色谱（RP1）上的肽段进行分步洗脱，使RP1 的功能由单纯的除盐扩展到了真正意义上的肽段水平色谱分离。

酵母细胞可溶性蛋白的酶解产物通过96h 的三维循环嵌套洗脱程序得到分离，在一次实验中能鉴定出1495个蛋白，是经典Mud PIT 法的4.5 倍；而且平均每个蛋白对应着5 条不重复肽段（unique peptide）。

而同一系统下，如果RP1 单纯用于除盐，仅能从相同的样品中鉴定到632 个蛋白，而且平均每个蛋白只对应 3.5 个不重复肽段，证明了有效的利用RP1进行肽段分离，不仅能大大提高三维色谱分离系统鉴定蛋白的能力，而且蛋白鉴定的可信度更高。

另外，该系统使得上样后分析的过程完全实现了自动化，适合复杂样品的分析。

这一种三维液相色谱分离系统已经在一些蛋白质组学样品的研究中得到具体应用，如败血症病人血浆、小鼠心肌细胞等。

SEC 也因为和二维分离系统中的SCX 以及RP 具有不同的选择性而应用于三维分离系统中的第一维。

Zhang 等在SCX-RPLC-MS/MS 的基础上，在前端加入了SEC 作为预分离，将一次实验中的蛋白鉴定数目提高至二维分离方法的2.8倍，证实了采用肽段水平上的三维液相色谱分离能大大提高蛋白鉴定能力。

本实验室在经典二维SCX-RP 液质联用之前，先将来自小鼠乳腺癌细胞裂解液的肽段混合物用亲水作用色谱进行肽段水平的预分离，和直接用二维液相色谱分离的样品相比，鉴定到的蛋白数目是后者的2 倍。

以上的三维液相色谱分离在对组织、细胞裂解液或体液分析中能一次检测到的蛋白数与二维分离相比都有着大幅提高，说明三维液相色谱分离能有效提高样品分离的程度，从而提升了蛋白鉴定的数量和可信度。

但是，由于复杂样品中的高丰度蛋白含量很大，酶解后产生的肽段通过肽段水平的HPLC分离后，常常会弥散在多个分离后的肽段组分中，影响了这些组分之中来自低丰度蛋白的肽段的检测。

这些来自低丰度蛋白的肽段在含量较少的情况下，又被来自高丰度蛋白的肽段所掩盖，在质谱检测时不占优势，很有可能被屏蔽，导致蛋白鉴定效率难有进一步提高。

3 基于蛋白水平一维分离的三维液相色谱分离系统一些研究者提出在蛋白水平的一维预分离能有效克服肽段三维分离方法的缺点。

从原理上看，蛋白水平上的预分离和肽段水平上的预分离相比，具有更大的优势：（1）从分离对象来说，直接在蛋白水平上分离，能够更有效地富集蛋白；（2）从分子结构来说，蛋白比肽段更加复杂，在各种物理化学性质方面（比如分子大小、等电点、亲疏水性以及电荷分布）差异更大，能产生更优的色谱选择性。

一些实际的分离实验表明，在蛋白水平上进行的预分离和其后酶解产物肽段水平的分离之间，即使使用相同的色谱分离模式，由于蛋白和肽段的保留行为差异，也能充分利用每一维中色谱分离的效果，产生" 假正交性"。

因此，在多维液相色谱分离的第一步中，将分析物保持在蛋白状态是更好的选择。