流式细胞术样本制备.
流式细胞术的质量控制
流式细胞术的质量控制流式细胞术是一种在液流中快速检测和分析细胞特性的技术，广泛应用于医学、生物技术、免疫学等领域。
然而，要确保实验结果的准确性和可靠性，必须实施严格的质量控制措施。
本文将探讨流式细胞术的质量控制。
1、样本制备的质量控制样本制备是流式细胞术的关键步骤之一，包括细胞样本的收集、处理和标记。
在此过程中，应遵循标准化操作流程，并注意以下几点：（1）样本的收集和保存：应尽可能缩短样本采集到分析的时间，避免细胞状态的改变。
对于血液样本，应使用肝素抗凝，避免细胞聚集。
（2）细胞的分离和洗涤：应根据实验需求，采用合适的分离方法（如密度梯度离心法、贴壁培养法等）对细胞进行分离。
在洗涤过程中，应使用无菌、无内毒素的缓冲液洗涤细胞，去除杂质和死细胞。
（3）抗体标记：选择高质量的抗体，并遵循制造商的建议进行标记。
应避免抗体非特异性结合，确保标记的特异性和敏感性。
2、仪器设备的质量控制流式细胞仪是流式细胞术的核心设备。
为确保实验结果的准确性，应对仪器进行定期校准和维护。
具体措施包括：（1）校准激光功率：定期使用标准样本对激光功率进行校准，确保光路准直，提高光散射数据的准确性。
（2）清洗流动室：定期清洗流动室，防止样品残留物堵塞喷嘴，影响流速稳定性。
（3）校准光电倍增管：使用标准样本校准光电倍增管，确保光电倍增管输出的线性范围。
3、数据分析的质量控制数据分析是流式细胞术的关键步骤之一，包括数据的获取、处理和解析。
在此过程中，应遵循标准化操作流程，并注意以下几点：（1）数据获取：设置合适的参数和门控，确保获取最佳的数据。
（2）数据预处理：去除噪声和无效数据，进行数据归一化处理，提高数据质量。
（3）数据分析：选择合适的数据分析方法（如聚类分析、主成分分析等），对数据进行深入挖掘。
同时，应使用多个对照样本，评估实验结果的可靠性和稳定性。
4、实验室环境的质量控制实验室环境对流式细胞术的结果也有重要影响。
为确保实验结果的准确性，应采取以下措施：（1）温度控制：保持实验室温度稳定，避免温度波动对细胞状态的影响。
流式细胞术样品制备技术(完整)
流式细胞术样品制备技术流式细胞术对细胞的分析检测必须基于单细胞的基础上，这是流式细胞术的基本要求。
因此就必须把实体组织制备成单细胞悬液。
在应用FCM技术中，制备出合格的单分散细胞是流式细胞术样本制备技术中重要的一环。
它要求这种分散细胞方法既要使细胞成为单个细胞，又能保持细胞的固有生物化学成分及生物学特性。
流式细胞术样品制备大致可分为下面五个步骤：①取材：取手术或活检组织必须具有代表性，如取手术肿瘤组织，必须取瘤细胞生长旺盛部位；组织等标本必须在取材后保持样本的新鲜；一般在室温1个小时之内处理好样本或及时用固定剂或低温对组织进行保存；②对细胞的待测生物化学成分进行荧光染色；③按照厂家提供的软件程序对样本进行获取、检测和存储；④再依照软件提供的程序对检测结果进行定量分析；⑤检测分析结果在生物、医学上的意义进行分析和评价。
第1节样本单细胞悬液的制备方法一新鲜实体组织样本的制备FCM对单细胞快速进行各种参数分析必须基于单细胞基础上，根据各种组织成分的特点，可选择不同的分散细胞方法，以期达到单细胞产额高、损伤少的目的。
尽管标本制备已形成了标准化的程序，但实际操作中总会出现这样或那样的问题。
在实体组织分散为单个细胞过程中，解离的方法可能瞬间地或持久地影响细胞的性质、形态、结构、功能等。
所以，在对各种不同组织进行分散选择方法时，应尽量减少对细胞的这种影响。
目前常用的分散组织细胞的方法有如下3种。
（一）酶消化法1 作用原理：对实体组织分散的作用原理主要有3方面：①可以破坏组织间的胶原纤维、弹性纤维等；②可以水解组织间的粘多糖等物质；③可以水解组织细胞间的紧密联结装置的蛋白质物质。
酶消化法是实体瘤、培养细胞分散为单细胞的主要方法之一。
常用的酶类试剂有：蛋白酶类——胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、链酶蛋白酶和中性蛋白酶等，都能解离组织中的细胞。
胰蛋白酶能水解脂键和肽键；胶原酶能降解几种分子类型的胶原；溶菌酶能水解糖蛋白和肽的糖苷键；弹性蛋白酶能消化连接组织的糖蛋白和弹性蛋白的纤维。
流式细胞术待测样品制备方法建议2016
流式细胞术待测样品制备方法建议：
1）收集2×10^6个细胞，用1ml冷的PBS重悬，1500rpm离心5min，弃上清。
2）拍打混匀细胞团块，随后加入1ul 荧光直标的CD45抗体，混匀，冰上避光孵育15min；3）加入1ml PBS重悬细胞，1500rpm离心5min，弃上清；
4）加入1ml 1%中性多聚甲醛（注：用PBS将4%的多聚甲醛稀释为1%浓度使用即可）重悬细胞，避光固定15min，随后1500rpm离心5min，弃上清；
5）加入1ml PBS重悬细胞，1500rpm离心5min，弃上清；
6）用1ml含0.09%皂素的PBS重悬细胞，冰上避光放置10min，1500rpm离心5min，弃上清。
7）加入1ml PBS重悬细胞，1500rpm离心5min，弃上清；
8）以200ul PBS重悬细胞，加入Hsp70抗体，冰上避光放置30min，再用1ml冷的PBS 重悬细胞，1500rpm离心5min，弃上清，洗去未结合的一抗；
9）加入1ml PBS重悬细胞，1500rpm离心5min，弃上清；
10）以200ul PBS重悬细胞，加入FITC标记的二抗，冰上避光放置40min后，再用1ml冷的PBS 重悬细胞，1500rpm离心5min，弃上清，洗去未结合的二抗；
11）加入1ml PBS重悬细胞，1500rpm离心5min，弃上清；
12）以200ul PBS重悬细胞，避光备用；上机检测，每样品计数5000-50000个细胞。
备注：抗体的使用量请参照说明书。
流式细胞术的质量控制
流式细胞术的质量控制流式细胞术（Flow cytometry）是一种广泛应用于生物学和医学研究中的细胞分析技术。
它通过利用光传感器和激光来检测细胞悬浮液中的细胞数量、大小、形态和表面标记物等信息，从而实现对细胞的分析和分类。
为了保障流式细胞术的准确性和可重复性，质量控制是非常重要的。
样本制备的质量控制在进行流式细胞术之前，样本制备是流式细胞术质量控制的第一步。
样本质量对于结果的准确性和可重复性至关重要。
以下是一些常见的样本制备质量控制步骤：细胞样品准备细胞浓度的准确计数：使用细胞计数仪准确计数细胞数目，以确保每个样本含有足够数量的细胞进行分析。
细胞的适当处理：根据不同实验要求，对细胞进行适当的处理，如洗涤、培养基的选择等，以确保细胞状态的一致性。
样品标记物的质量控制标记物的选择：根据实验需要，选择合适的标记物，并确保其特异性、亲和力和荧光强度等符合要求。
样品标记物的浓度和时间：对于标记物的浓度和反应时间进行优化，避免过高或过低的浓度导致信号失真或信号强度不足。
流式细胞仪的质量控制流式细胞仪作为流式细胞术的核心仪器，其性能的稳定和准确也是流式细胞术质量控制的关键。
以下是常见的流式细胞仪质量控制步骤：光谱校正与补偿荧光信号校正：使用校正颗粒进行荧光信号校正，校正光谱重叠和荧光强度的变化，以提高结果的准确性。
荧光信号补偿：通过对不同通道之间的荧光信号进行补偿，避免荧光信号之间的交叉干扰，确保结果的准确性。
流速标定流速标定：使用标定颗粒进行流速标定，保证流速的准确性，以便对细胞进行准确的定位和计数。
指标质量控制正质量控制：使用已知正样本进行实验，确保仪器的稳定性和结果的准确性。
负质量控制：使用未标记的负样本进行实验，排除背景信号和非特异性结合，保证结果的准确性。
识别和排除异物：通过故障检查和核查流式细胞术结果，识别和排除可能存在的污染源和异常情况。
数据分析的质量控制流式细胞术之后，对数据的准确分析和解读也是质量控制的重要环节。
流式细胞术样品制备技术(完整)
流式细胞术样品制备技术流式细胞术对细胞的分析检测必须基于单细胞的基础上，这是流式细胞术的基本要求。
因此就必须把实体组织制备成单细胞悬液。
在应用FCM技术中，制备出合格的单分散细胞是流式细胞术样本制备技术中重要的一环。
它要求这种分散细胞方法既要使细胞成为单个细胞，又能保持细胞的固有生物化学成分及生物学特性。
流式细胞术样品制备大致可分为下面五个步骤：①取材：取手术或活检组织必须具有代表性，如取手术肿瘤组织，必须取瘤细胞生长旺盛部位；组织等标本必须在取材后保持样本的新鲜；一般在室温1个小时之内处理好样本或及时用固定剂或低温对组织进行保存；②对细胞的待测生物化学成分进行荧光染色；③按照厂家提供的软件程序对样本进行获取、检测和存储；④再依照软件提供的程序对检测结果进行定量分析；⑤检测分析结果在生物、医学上的意义进行分析和评价。
第1节样本单细胞悬液的制备方法一新鲜实体组织样本的制备FCM对单细胞快速进行各种参数分析必须基于单细胞基础上，根据各种组织成分的特点，可选择不同的分散细胞方法，以期达到单细胞产额高、损伤少的目的。
尽管标本制备已形成了标准化的程序，但实际操作中总会出现这样或那样的问题。
在实体组织分散为单个细胞过程中，解离的方法可能瞬间地或持久地影响细胞的性质、形态、结构、功能等。
所以，在对各种不同组织进行分散选择方法时，应尽量减少对细胞的这种影响。
目前常用的分散组织细胞的方法有如下3种。
（一）酶消化法1 作用原理：对实体组织分散的作用原理主要有3方面：①可以破坏组织间的胶原纤维、弹性纤维等；②可以水解组织间的粘多糖等物质；③可以水解组织细胞间的紧密联结装置的蛋白质物质。
酶消化法是实体瘤、培养细胞分散为单细胞的主要方法之一。
常用的酶类试剂有：蛋白酶类——胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、链酶蛋白酶和中性蛋白酶等，都能解离组织中的细胞。
胰蛋白酶能水解脂键和肽键；胶原酶能降解几种分子类型的胶原；溶菌酶能水解糖蛋白和肽的糖苷键；弹性蛋白酶能消化连接组织的糖蛋白和弹性蛋白的纤维。
流式细胞术样品制备(完整)
一、单层培养细胞分散为单个细胞
㈠贴壁的单层培养细胞单细胞悬液的制备
操作步骤： 1、将单层培养细胞(对数生长期)中的旧培养液倒掉。
2、加入少量0.25%胰酶，消化细胞，在倒置显微镜下观
察，见细胞稍变圆时，立即终止消化（假如含有10%胎 牛血清的培养基），收集细胞，离心后去上清，PBS液
洗涤细胞一次，离心去掉上清液，约留0.5ml细胞悬液， 用振荡器使细胞分散。
实验证实，用化学试剂处理组织导致细胞 成活率降低，细胞产额较低，细胞碎片和细胞 丛结的量不稳定，因此，化学试剂处理方法不 单独使用，可与其他方法联合使用。 机械法常常造成严重的细胞损伤，较低的 细胞产量，为使细胞碎片不影响FCM检测结果， 需采用适当的方法除去碎片或尽量减少碎片。 酶学法对实体肿瘤的分散解聚是较理想的， 但是会对所测化学成分造成不良影响，所以根 据使用目的去选择合适的单细胞悬液制备方法， 才能获得理想的样品和更好的FCM结果。
3、如果不是及时上机检测，则需要对细胞进行固定，常 规固定液为70%乙醇，然后保存于4℃冰箱中。
（二）悬浮培养细胞单细胞悬液的制备
操作步骤：
1、离心去除旧培养液，PBS液洗涤细胞一次，离心去掉 上清液，约留0.5ml细胞悬液，用振荡器使细胞分散。
2、如果不是及时上机检测，则需要对细胞进行固定，常 规固定液为70%乙醇，然后保存于4℃冰箱中。
注意事项： 一定将石蜡从组织中脱干净，检验是否将石蜡 脱净的方法是，弃去二甲苯，加入100%乙醇， 如无絮状物浮起，即视为石蜡已脱净，反之则 没有脱净。 消化时间不可过长，以免造成已释放出的细胞 核被消化掉。 切片不可过薄或过厚，过薄则碎片增多，影响 流式分析结果，过厚造成脱蜡不净或脱蜡时间 过长，一般以40-50μm为宜。
免疫缺陷性疾病的流式细胞术(FACS)检测技术综述
免疫缺陷性疾病的流式细胞术（FACS）检测技术综述流式细胞术（FACS）是一种广泛应用于免疫学、细胞生物学和医学研究领域的高级技术。
它基于细胞表面标记物的特异性染色和流式细胞仪的高速多参数分析能力，能够对细胞的多个特征进行准确快速地评估。
在免疫缺陷性疾病的诊断、治疗和研究中，FACS检测技术发挥了重要作用。
一、FACS技术原理及基本流程FACS技术利用单克隆抗体或荧光染料标记的抗体与细胞表面的抗原结合，将细胞分为不同的亚群，并通过流式细胞仪进行高速分析和计数。
1. 样本制备：样本制备是FACS分析的重要步骤，它要求样本细胞的高质量提取和制备。
血液和组织样本通常经过红细胞溶解、细胞过滤和标记前的预处理。
2. 孵育抗体：单克隆抗体或荧光染料标记的抗体与样本中的特定细胞表面抗原结合，形成荧光标记的细胞。
3. 过滤和洗涤：样本离心去除未结合的抗体并进行洗涤，以去除杂质和多余的荧光染料。
4. 流式细胞术仪器：使用流式细胞仪进行细胞的高速分析。
该仪器利用激光器照射细胞，测量细胞释放的荧光和散射光的特性，从而对细胞进行鉴定和分类。
5. 数据分析：通过流式细胞仪获得的数据经过专业的软件进行分析和解读，得出相应的结果和图表。
二、FACS在免疫缺陷性疾病中的应用1. 免疫缺陷性疾病的诊断：FACS技术可以通过检测细胞表面抗原与参考范围进行比较，确定患者是否存在免疫缺陷。
例如，在先天性免疫缺陷疾病中，可以检测T细胞、B细胞和NK细胞等免疫细胞的数量和功能。
2. 免疫细胞亚群的鉴定：FACS技术可以通过检测不同免疫细胞表面标记物，准确鉴定不同免疫细胞亚群的比例和数量。
对于免疫缺陷性疾病研究来说，这对于确定异常细胞亚群以及监测治疗效果具有重要意义。
3. 细胞活力和细胞周期分析：FACS技术还可以通过检测细胞的活力标记物和细胞周期相关标记物，评估细胞的生存能力和增殖情况。
这对于免疫功能评估和治疗效果的监测具有重要意义。
4. 免疫治疗效果的评估：FACS技术可用于监测免疫治疗的效果，包括免疫细胞的增加、功能的改善以及异常细胞的清除。
流式细胞术样品制备(完整)
注意事项：
Ⅰ新鲜组织标本应及时进行保存，以免组织在室温下放 置时间过长，造成细胞自溶导致DNA降解，影响FCM 测定结果。
Ⅱ根据实验目的选用最佳的细胞固定方法，以免由于固 定剂的原因，造成FCM检测结果的不稳定。
Ⅲ酶学法要注意条件的选择和影响因素，要注意酶的溶 剂，消化时间、pH值、浓度等方面对酶消化法的影响。
消化时间不可过长，以免造成已释放出的细胞 核被消化掉。
切片不可过薄或过厚，过薄则碎片增多，影响 流式分析结果，过厚造成脱蜡不净或脱蜡时间 过长，一般以40-50μm为宜。
二、血液单细胞样品的制备
血液是天然的单细胞分散细胞悬液，血中 的细胞成分在生理状态下呈分散的游离状态， 它是流式细胞分析的最合适的样品，全血中含 有红细胞，白细胞和血小板三种有形成分，但 流式细胞的检测是以某一群细胞为测定对象， 因此在检测前须将所测的某群细胞分离出来， 下面分别介绍几种血细胞的分离制备方法。
新鲜实体组织单细胞悬液制备方法如下：
⒈酶消化法 ⒉机械法
剪碎法 网搓法 研磨法
⒊化学试剂处理法
⒈酶消化法
酶对实体组织分散作用原理主要有三方面：
﹡一是可以破坏组织间的胶原。
﹡二是可以水解组织细胞的紧密连结装置的蛋白性物质。
﹡三是可以水解组织间的粘多糖物质。
酶消化法是实体组织分散为单细胞的主要方法，常用 的酶类试剂有：
1. 取肝素1000u/ml抗凝全血3.0m1,加入3.0ml生理
盐水将血稀释,均在无菌条件下操作。
2.1640培养液10.0ml,放入培养瓶内,将稀释血加入
培养液中,混匀,与培养瓶接触面要大。
3.放入37℃恒温箱内孵育30-40分钟,取出培养瓶 , 将血倾倒掉,用生理盐水将培养瓶轻轻冲洗一次, 以去掉残留的血液,这时培养瓶壁上贴附了大量 的单核细胞,因为单核细胞具有短时培养期内贴 附快的特点 ,而其他细胞没有这个特性,所以利 用这一特性进行短时培养可获得较纯的单核细 胞。
流式细胞术实验步骤
流式细胞术实验步骤流式细胞术（flow cytometry）是一项非常常用的细胞生物学研究技术，在许多领域都有着广泛的应用。
本文将为您介绍流式细胞术实验步骤，帮助您更好地掌握这一技术。
1. 细胞样品制备首先需要一个合适的细胞样品进行实验。
样品的选取要考虑细胞类型、细胞密度、细胞状态等因素，以保证实验结果的准确性和可靠性。
对于非粘附生长的细胞，先用PBS洗涤一次，离心沉淀，将上清液倒掉，然后用PBS冲洗沉淀细胞一次，离心沉淀，去掉上清液，用含0.25%胰蛋白酶和0.02%EDTA的PBS中消化脱落细胞。
之后用PBS洗涤脱落细胞，离心沉淀，去掉上清液，最后加入凝胶化培养基冻存备用。
2. 细胞计数在流式细胞术中，细胞计数非常重要。
可以使用hemocytometer或自动计数器进行计数。
计数完毕后，将细胞密度调整到准确的浓度，以免在后续实验中出现杂质和误差。
3. 细胞标记细胞标记可使用fluorescently-labeled antibodies或其他的探针，标记细胞表面分子或胞内分子。
标记的目的是识别和区分样品中的不同细胞类别。
处理方法：向细胞样品中加入适量标记抗体或荧光素等探针，使其与样品中的目标分子发生特异性结合。
4. 细胞过筛将经过标记的样品通过过滤网口，筛去大于0.22um的细胞碎片等杂质，以获得单个细胞进行后续实验。
5. 流式细胞术分析使用流式细胞仪进行分析，将样品喷入细胞术的流管中，在激光束之下，测量样品中标记细胞的荧光强度、散射度等参数。
通过比较样品与对照组，分析细胞类型、浓度和状态，建立起荧光相关表达式，以判定目标细胞类别。
6. 数据解析在流式细胞术分析的过程中采集了大量的数据，需要使用专业的软件进行数据解析、图形和表格生成。
数据解析的准确性和可靠性，对于实验结果和结论的推导有着至关重要的作用。
流式细胞术是一项详细的实验过程，需要严格遵守操作规范，才能获取可重复的实验结果。
本文简单介绍了流式细胞术实验步骤，希望能够提供实验操作指导，为广大科研工作者开展实验研究提供一定的帮助。
流式细胞检测实验方法篇
流式细胞检测实验方法篇流式细胞技术（Flow cytometry, FCM）是利用流式细胞仪进行的一种单细胞定量分析和分选技术。
流式细胞术是单克隆抗体及免疫细胞化学技术、激光和电子计算机科学等高度发展及综合利用的高技术产物，它能有效地从单细胞水平区分异质性细胞群体，检测对象包括但不限于悬浮细胞、贴壁细胞或从实体组织分离的单细胞悬液和其他生物颗粒。
一、细胞表面染色步骤1. 样本准备①采集全血或组织（脾，淋巴结，胸腺和骨髓）用细胞染色buffer(或含0.1%BSA的PBS)制成单细胞悬液。
对于体外刺激的细胞，直接将刺激后的细胞悬浮在细胞染色buffer(或含0.1%BSA的PBS)中，然后进行第2步。
②加满细胞染色buffer(或含0.1%BSA的PBS), 300g离心细胞悬液5分钟，弃掉上清。
2. 红细胞裂解①需裂解红细胞（如脾脏），将10x红细胞裂解液(ACK buffer)用去离子水稀释到1x，放置到室温。
将细胞重悬于3mL的1x ACK buffer中，室温孵育3-5分钟；如不需要裂解红细胞，直接进入第3步。
②加入10mL细胞染色buffer(或含0.1%BSA的PBS)终止红细胞裂解，300g离心细胞悬液5分钟，弃掉上清。
③重复洗涤一次，加满细胞染色buffer(或含0.1%BSA的PBS)至15mL, 300g离心细胞悬液5分钟，弃掉上清。
④细胞计数，用细胞染色buffer(或含0.1%BSA的PBS)将细胞制成1x107/mL悬液。
将100μL细胞悬液加入流式管中备用。
3. 封闭Fc受体封闭Fc受体能减少染色过程中的非特异性染色。
①小鼠中，纯化的CD16/CD32单抗能和FcγRⅢ/Ⅱ结合，封闭非特异性染色，使阴性细胞的背景荧光降至未标记细胞的水平。
加入0.5-1μg纯的抗小鼠CD16/32单克隆抗体，室温孵育10分钟。
②对于人和大鼠，可直接使用过量的与荧光抗体相同来源和亚型的纯化Ig或者相同来源血清进行阻断，或者用商业化的Fc受体阻断剂。
流式细胞仪标本制备的操作步骤与注意事项
流式细胞仪标本制备的操作步骤与注意事项(一)原理活细胞表面保留有较完整的抗原或受体，先用特异性鼠源性单克隆抗体与细胞表面相应抗原结合，再用荧光标记的第二抗体结合，根据所测定的荧光强度和阳性百分率即可知相应抗原的密度和分布。
(二)操作步骤制备活性高的细胞悬液(培养细胞系、外周血单个核细胞、胸腺细胞、脾细胞等均可用于本法)↓用10％FCS RPMI1640调整细胞浓度为5×10６～１×10７／ml↓取40μl细胞悬液加入预先有特异性McAb(5～50μl)的小玻璃管或塑料离心管，再加50μl 1∶20(用DPBS稀释)灭活正常兔血清↓4℃30min用洗涤液洗涤2次，每次加洗涤液2ml左右1000rpm×5min↓弃上清，加入50μl工作浓度的羊抗鼠(或兔抗鼠)荧光标记物，充分振摇↓4℃30min用洗涤液洗涤2次，每次加液2ml左右1000rpm×5min↓加适量固定液(如为FCM制备标本，一般加入1ml固定液，如制片后在荧光显微镜下观察，视细胞浓度加入100～500μl固定液)↓FCM检测或制片后荧光显微镜下观察(标本在试管中可保存5～7天)(三)试剂和器材1.各种特异性单克隆抗体。
2.荧光标记的羊抗鼠或兔抗鼠第二抗体，灭活正常兔血清。
3.10％FCS RPMI1640, DPBS、洗涤液、固定液(见附录)。
4.玻璃管、塑料管、离心机、荧光显微镜等。
(四)注意事项1.整个操作在4℃下进行，洗涤液中加有比常规防腐剂量高10倍的NaNO３，上述实验条件是防止一抗结合细胞膜抗原后发生交联、脱落。
2.洗涤要充分，以避免游离抗体封闭二抗与细胞膜上一抗相结合，出现假阴性。
3.加适量正常兔血清可封闭某些细胞表面免疫球蛋白Fc受体，降低和防止非特异性染色。
4.细胞活性要好，否则易发生非特异性荧光染色。
附:1. DPBS (×10, 贮存液)NaCl 80gKCl 2g 蒸馏水加至1000mlNa２HPO４11.5g 临用时用蒸馏水1∶10稀释KH２PO４2g2.洗涤液DPBS900mlFCS 50ml (终浓度5％)4％NaNO３终浓度0.2％)3.固定液DPBS1000ml葡萄糖20g (终浓度2％)甲醛10mlNaNO３0.2g (终浓度0.02％)流式细胞术常规检测时的样品制备(一)直接免疫荧光标记法取一定量细胞(约1X106细胞／ml)，在每一管中分别加入50μl的HAB，并充分混匀，于室温中静置1分钟以上(),再直接加入连接有荧光素的抗体进行免疫标记反应(如做双标或多标染色，可把几种标记有不同荧光素的抗体同时加入)，。
流式细胞仪标本的制备
流式细胞仪标本的制备流式细胞仪(FCM)是八十年代集单克隆抗体、荧光化学、激光、计算机等高技术发展起来的一种先进仪器，已广泛应用于免疫学、生物化学、生物学、肿瘤学以及血液学等方面的研究和临床常规工作。
其中检测人白细胞表面标志可对白血病、淋巴瘤作用迅速正确的诊断，对淋巴细胞群和亚群进行精确分类，还能分离纯化某一群或亚群细胞。
活细胞免疫荧光技术是用于FCM检测的标本准备，染色后也能在荧光显微镜下进行观察，在某些实验条件下，活细胞免疫荧光染色后的特异性和敏感性要优于滴片固定的常规间接免疫荧光的结果。
(一) 原理活细胞表面保留有较完整的抗原或受体，先用特异性鼠源性单克隆抗体与细胞表面相应抗原结合，再用荧光标记的第二抗体结合，根据所测定的荧光强度和阳性百分率即可知相应抗原的密度和分布。
(二) 操作步骤制备活性高的细胞悬液(培养细胞系、外周血单个核细胞、胸腺细胞、脾细胞等均可用于本法)用10％FCS RPMI1640调整细胞浓度为5×10６～１×10７／ml取40μl细胞悬液加入预先有特异性McAb(5～50μl)的小玻璃管或塑料离心管，再加50μl 1∶20(用DPBS稀释)灭活正常兔血清4℃ 30min用洗涤液洗涤2次，每次加洗涤液2ml左右1000rpm×5min弃上清，加入50μl工作浓度的羊抗鼠(或兔抗鼠)荧光标记物，充分振摇4℃ 30min用洗涤液洗涤2次，每次加液2ml左右1000rpm×5min加适量固定液(如为FCM 制备标本，一般加入1ml固定液，如制片后在荧光显微镜下观察，视细胞浓度加入100～500μl固定液)FCM 检测或制片后荧光显微镜下观察(标本在试管中可保存5～7天)(三) 试剂和器材1. 各种特异性单克隆抗体。
2. 荧光标记的羊抗鼠或兔抗鼠第二抗体，灭活正常兔血清。
3. 10％ FCS RPMI1640, DPBS、洗涤液、固定液(见附录)。
流式细胞仪的样本制备与数据分析指南
引言：
流式细胞仪（flow cytometer）是一种广泛应用于生物学、医学研究领域的仪器，能够对单个细胞进行快速、准确的分析和排序。为了获得可靠的实验结果，正确的样本制备和数据分析至关重要。本文将为您介绍流式细胞仪的样本制备和数据分析的基本指南。
一、样本制备
1.细胞准备
3.细胞染色
细胞染色是为了标记细胞内特定的分子或结构，以便在流式细胞仪中进行检测和分析。常见的细胞染色方法包括荧光染色、酶标记等。在选择染色方法时，需要考虑染色效果、染色稳定性以及对细胞活力的影响。
4.样本预处理
在进行流式细胞仪分析之前，有时需要对样本进行预处理，以消除背景噪音、增强信号等。常见的样本预处理方法包括细胞排序、细胞分选、细胞富集等。
结语：
流式细胞仪的样本制备和数据分析是流式细胞仪实验中至关重要的环节。正确的样本制备和数据分析方法能够提高实验结果的可靠性和准确性，为后续的研究工作提供有力支持。希望本文所提供的指南能够对您的流式细胞仪实验有所帮助。
二、数据分析
ห้องสมุดไป่ตู้1.数据获取
在流式细胞仪实验完成后，需要将得到的原始数据导出到计算机进行后续的数据分析。通常，流式细胞仪会输出FCS（Flow Cytometry Standard）格式的数据文件，其中包含了细胞的荧光强度、散射信号等信息。
2.数据清洗
在进行数据分析之前，需要对原始数据进行清洗，去除噪音、异常数据等。常见的数据清洗方法包括设置门控条件、排除双重tsne等。
3.数据解读
数据解读是流式细胞仪数据分析的核心环节。通过对数据的统计学分析、聚类分析、细胞子群分析等，可以获得关于细胞表型、细胞数量、细胞状态等信息。在数据解读过程中，需要结合实验设计和研究目的，从中提取有意义的结果。
流式细胞术的样品制备
流式细胞术的样品制备节概述待测标本的制备是流式细胞术分析的关键，本节分别直接免疫荧光标记、间接免疫荧光标记、微量全血法免疫荧光标记、双标记、培养细胞DNA荧光标记与细胞凋亡检测样品的制备。
知识点导航1.直接免疫荧光标记的样品制备用标有荧光素的特异抗体对细胞进行直接染色，然后用流式细胞仪检测，阳性者即表示有相应抗原存在。
实验步骤如下：(1)每份取100 μl单细胞悬液(细胞密度约1×106个细胞)。
(2)一份加入相应量的异硫氰酸荧光素或者藻红蛋白标记的特异性荧光直标单抗，另一份加入荧光标记的无关单抗，作为阴性参照样品。
(3)室温下避光反应一定时间(时间长短根据试剂说明书要求进行)，通常在室温下反应15～30min 即可。
(4)加入500 μl磷酸缓冲液重悬成单细胞悬液即可上机检测。
2.间接免疫荧光标记的样品制备(1)取1×106个细胞/100μl，先加入一抗混匀，置室温下避光反应30 min。
(2)用PBS洗涤细胞2次，离心沉淀弃掉上清液(离心转数通常为800～1000 r/min，5 min)。
(3)用100 μl PBS重悬细胞，再加入FITC或者PE标记荧光二抗(用量均按说明书要求加入)混匀，室温下反应30 min。
(4)用PBS再洗涤细胞2次，加入500 μl PBS重悬成单细胞悬液，上机检测。
注意：以上两种染色方法的抗体加入量与反应时间，没有非常具体的规定，通常应根据试剂使用说明书的要求进行。
若说明书上未说明，应先进行预实验，掌握好剂量与最佳反应时间后，再进行流式样品的制备。
制备好的样品，若不能及时上机检测，用1％～4％的多聚甲醛固定，4℃下可储存5d。
3.微量全血法免疫荧光标记的样品制备目前制备全血细胞样品的方法很多，且很成熟，常用的方法是用淋巴细胞分离液分离淋巴细胞，然后进行特异性荧光染色，其染色方法与前面介绍的方法相同。
下面要紧介绍与流式细胞仪配套的Q PREP(免疫学样品处理器)进行快速制备微量全血样品的方法：(1)微量全血直接荧光染色法：具体方法为①取肝素或者EDTA抗凝全血100 μl置12 mm×75 mm 专用塑料试管中；②每份加入20 μl特异性荧光单抗，另一份加入荧光标记的无关单抗作阴性参照，室温下避光染色15 min；③置 Q PREP 仪上溶解红细胞、稳固与固定白细胞，静置5 min；④上流式细胞仪检测。
流式细胞术样本制备.
样本制备实例:细胞表面蛋白荧光染色 (Immunofluorescence Staining原理:对细胞表面蛋白质的染色可以分为直接染色(DIF 和间接染色(IIF 两种。
直接染色是指用直接联有荧光的抗体染色;而间接染色则是采用一级抗体和蛋白先结合,然后再用带有荧光的与一级抗体有亲和力的二级抗体进行染色。
荧光染色的方法在蛋白质检测中使用非常普遍,因为只要采用合适的抗体,几乎任意的蛋白都可以用指定的荧光标记。
但是由于各种蛋白表达的强度和荧光染料自身荧光强度不同,以及临近通道串色的问题, 多色实验的基本原则是:最强的染料配表达最弱的蛋白,最弱的染料配表达最强的蛋白; 如果使用染料的数量不大则应尽量避免使用临近通道。
还需要考虑染料之间的溢漏、以及偶联染料已降解的问题。
现出现了 405nm 的激光激发的新型染料如 BV421、 BV605等为多色实验提供了更多的选择空间。
材料:∙被检测细胞∙FACS Lysing Solution (细胞裂解液, 1倍或 10倍, 10倍的要先稀释到 1倍后使用∙相应的蛋白荧光染色抗体 (e.g. CD4 FITC, CD8 PE, CD3 APC步骤:1. 在 100 µL外周血加入抗体:a. 同型对照:PB 100µL +Isotope FITC 20 µL+Isotope PE 20 µL+Isotope APC 5 µLb. 单阳管:PB 100µL +CD4 FITC 20 µL+Isotope PE 20 µL+Isotope APC 5 µLc. 单阳管:PB 100µL +Isotope FITC 20 µL+CD8 PE 20 µL+ Isotope APC 5 µLd. 单阳管:PB 100µL +Isotope FITC 20 µL+ Isotope PE 20 µL+CD3 APC 5 µLe. 样品管:PB 100µL +CD4 FITC 20 µL+CD8 PE 20 µL+CD3 APC 5 µL2. 避光 15min3. 在每管中加入 2mL 裂解液,室温下避光孵育 10min4. 将裂解好的外周血离心 1200rpm , 5min ,去上清液5. 加入 2mL 鞘液,混匀6. 离心 1200rpm , 5min ,去上清液7. 加入 500 µL鞘液,混匀8. 3小时内上机(如果不能立刻上机, 2⁰ C -8⁰ C 避光保存样本对照:a. 同型对照(和使用的抗体同源、同亚型、同荧光标记:Isotope*3b. 单阳 CD4 加 Isotope PE & APCc. 单阳 CD8加 Isotope FITC & APCd. 单阳 CD3 加 Isotope FITC & PE细胞周期 (Cell Cycle原理:细胞在有丝分裂的过程中,核内的 DNA 会进行复制,造成 DNA 含量的波动。
流式细胞术的样本制备方法
流式细胞术的样本制备方法流式细胞术的样本制备和染色方法是进行流式分析的基础，虽然是基础，但是样本制备可并没有那么容易，比如细胞数目的掌握很难，过于稀释浓度不够，过于稠又会在通过细胞仪时影响分析，做不出结果，这是我们做流式的一大通病，特别是从组织中分离样本时，这样的问题常常遇到。
今天，我们就看看如何从不同组织中分离出优质样本。
与贴壁或者悬浮细胞相比，组织样本的单细胞制备相对有一定的难度和复杂性，也是同学们最容易出现问题的地方，如细胞数量太少，细胞活性不好，细胞碎片太多等。
下面就具体看看组织中的细胞如何制备。
目前，最常用两种方法是物理法和酶解消化法。
一、物理方法：原理：是指利用物理方法(机械法)分散组织，经过滤网过滤获得单细胞悬液。
应用：常用于处理部分软组织例如骨髓、胸腺、脾脏、淋巴结等，或富含细胞的肿瘤组织----淋巴肉瘤、视神经母细胞瘤、脑瘤、未分化瘤、髓样瘤以及一些软组织肉瘤等，用单纯的机械法就可以获得大量高质量的单分散细胞。
优势：操作方便，耗时短，且能获得大量的细胞。
缺点：易造成组织细胞机械损伤，如细胞碎片和细胞团块，所以常与其他方法配合使用;对硬组织或纤维组织效果不好。
操作步骤：1. 吹打：用移液枪或注射器反复吹打组织以获得单个细胞的方法。
应用于：骨髓、腹腔、肺等组织中相对比较游离的细胞(骨髓、巨噬细胞等)。
2. 剪碎研磨法：用锋利的剪刀将组织剪碎后，并研磨以获得单个细胞的方法。
应用于：脾脏、淋巴结、胰腺等新鲜组织。
3. 网搓法：用100-300目的尼龙滤网固定于烧杯口，组织在网上轻搓，可用此法获得单个细胞的方法。
常应用于：正常的组织、瘤组织、淋巴结等标本。
二、酶解消化法：原理：利用酶(主要是胶原酶和蛋白酶)破坏组织间的胶原纤维、弹性纤维等、水解组织细胞的紧密连接结构的蛋白质和粘多糖物质以将实体组织分散为单个细胞的方法。
应用：既可用于普通单层的传代细胞也适合致密的组织样本，如上皮、肝、肾等或含有大量结缔组织的肿瘤----食管癌、乳腺癌、皮肤癌等。
【求助】流式分选具体细节
【求助】流式分选具体细节流式细胞术对细胞的分析检测必须基于单细胞的基础上，这是流式细胞术的基本要求。
因此就必须把实体组织制备成单细胞悬液。
在应用FCM技术中，制备出合格的单分散细胞是流式细胞术样本制备技术中重要的一环。
它要求这种分散细胞方法既要使细胞成为单个细胞，又能保持细胞的固有生物化学成分及生物学特性。
流式细胞术样品制备大致可分为下面五个步骤：① 取材：取手术或活检组织必须具有代表性，如取手术肿瘤组织，必须取瘤细胞生长旺盛部位；组织等标本必须在取材后保持样本的新鲜；一般在室温1个小时之内处理好样本或及时用固定剂或低温对组织进行保存；② 对细胞的待测生物化学成分进行荧光染色；③ 按照厂家提供的软件程序对样本进行获取、检测和存储；④再依照软件提供的程序对检测结果进行定量分析；⑤ 检测分析结果在生物、医学上的意义进行分析和评价。
第1节样本单细胞悬液的制备方法一新鲜实体组织样本的制备FCM对单细胞快速进行各种参数分析必须基于单细胞基础上，根据各种组织成分的特点，可选择不同的分散细胞方法，以期达到单细胞产额高、损伤少的目的。
尽管标本制备已形成了标准化的程序，但实际操作中总会出现这样或那样的问题。
在实体组织分散为单个细胞过程中，解离的方法可能瞬间地或持久地影响细胞的性质、形态、结构、功能等。
所以，在对各种不同组织进行分散选择方法时，应尽量减少对细胞的这种影响。
目前常用的分散组织细胞的方法有如下3种。
（一）酶消化法1 作用原理：对实体组织分散的作用原理主要有3方面：① 可以破坏组织间的胶原纤维、弹性纤维等；②可以水解组织间的粘多糖等物质；③可以水解组织细胞间的紧密联结装置的蛋白质物质。
酶消化法是实体瘤、培养细胞分散为单细胞的主要方法之一。
常用的酶类试剂有：蛋白酶类——胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、链酶蛋白酶和中性蛋白酶等，都能解离组织中的细胞。
胰蛋白酶能水解脂键和肽键；胶原酶能降解几种分子类型的胶原；溶菌酶能水解糖蛋白和肽的糖苷键；弹性蛋白酶能消化连接组织的糖蛋白和弹性蛋白的纤维。
流式样本制备
流式样本制备
流式样本制备是一种通过流式细胞仪或流式细胞分选仪对细胞或颗粒物进行快速精确的分离和分类的技术。
它可以对样本中的细胞进行筛选、鉴定和排序，并根据细胞的特定性质进行直接分离和收集。
流式样本制备的步骤通常包括样本准备、样本染色、细胞排序和收集等过程。
下面是一个基本的流程：
1. 样本准备：首先需要将待分析的样本制备成单细胞悬浮液。
对于组织样本，可以通过机械或酶解法将组织细胞分离并制备成单细胞悬浮液。
对于细胞悬浮液，需要将其进行稀释，使得细胞以单个细胞的形式存在于悬浮液中。
2. 样本染色：将样本中的细胞或颗粒物经过染色，以便于流式细胞仪对其进行鉴定和分类。
常用的染色方法包括标记细胞表面标志物的流式抗体染色和使用细胞荧光探针的染色等。
3. 细胞排序：将染色后的样本通过流式细胞仪进行分析和鉴定。
流式细胞仪通过检测细胞的大小、形状、荧光染色强度等特性对细胞进行分类和区分。
4. 细胞收集：根据需要，流式细胞分选仪可根据细胞的特定性质（如荧光染色强度）对细胞进行分离和收集。
分选后的细胞可以进一步用于后续实验，如基因分析、细胞培养等。
注意事项：
- 在进行流式样本制备时，需要注意使用无菌的操作条件以避免细胞的污染。
- 样本准备和染色的步骤需要根据具体实验目的和方法进行优化和调整。
- 对于染色步骤，需要选择适当的流式抗体或荧光探针，并根据实验要求对样本进行处理和处理时间的控制。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
样本制备实例:细胞表面蛋白荧光染色 (Immunofluorescence Staining原理:对细胞表面蛋白质的染色可以分为直接染色(DIF 和间接染色(IIF 两种。
直接染色是指用直接联有荧光的抗体染色;而间接染色则是采用一级抗体和蛋白先结合,然后再用带有荧光的与一级抗体有亲和力的二级抗体进行染色。
荧光染色的方法在蛋白质检测中使用非常普遍,因为只要采用合适的抗体,几乎任意的蛋白都可以用指定的荧光标记。
但是由于各种蛋白表达的强度和荧光染料自身荧光强度不同,以及临近通道串色的问题, 多色实验的基本原则是:最强的染料配表达最弱的蛋白,最弱的染料配表达最强的蛋白; 如果使用染料的数量不大则应尽量避免使用临近通道。
还需要考虑染料之间的溢漏、以及偶联染料已降解的问题。
现出现了 405nm 的激光激发的新型染料如 BV421、 BV605等为多色实验提供了更多的选择空间。
材料:∙被检测细胞∙FACS Lysing Solution (细胞裂解液, 1倍或 10倍, 10倍的要先稀释到 1倍后使用∙相应的蛋白荧光染色抗体 (e.g. CD4 FITC, CD8 PE, CD3 APC步骤:1. 在 100 µL外周血加入抗体:a. 同型对照:PB 100µL +Isotope FITC 20 µL+Isotope PE 20 µL+Isotope APC 5 µLb. 单阳管:PB 100µL +CD4 FITC 20 µL+Isotope PE 20 µL+Isotope APC 5 µLc. 单阳管:PB 100µL +Isotope FITC 20 µL+CD8 PE 20 µL+ Isotope APC 5 µLd. 单阳管:PB 100µL +Isotope FITC 20 µL+ Isotope PE 20 µL+CD3 APC 5 µLe. 样品管:PB 100µL +CD4 FITC 20 µL+CD8 PE 20 µL+CD3 APC 5 µL2. 避光 15min3. 在每管中加入 2mL 裂解液,室温下避光孵育 10min4. 将裂解好的外周血离心 1200rpm , 5min ,去上清液5. 加入 2mL 鞘液,混匀6. 离心 1200rpm , 5min ,去上清液7. 加入 500 µL鞘液,混匀8. 3小时内上机(如果不能立刻上机, 2⁰ C -8⁰ C 避光保存样本对照:a. 同型对照(和使用的抗体同源、同亚型、同荧光标记:Isotope*3b. 单阳 CD4 加 Isotope PE & APCc. 单阳 CD8加 Isotope FITC & APCd. 单阳 CD3 加 Isotope FITC & PE细胞周期 (Cell Cycle原理:细胞在有丝分裂的过程中,核内的 DNA 会进行复制,造成 DNA 含量的波动。
如果把处于 G0/1期的细胞的 DNA 含量看做 1倍的话,处于 G2/M期的细胞的 DNA 含量则为 2倍。
荧光染料 propidium iodide (PI 是一种核染料。
因为每一个 PI 分子只能插在两组相邻的碱基对中,所以 PI 染料的荧光强度与被染的 DNA 的数量成正比。
根据 PI 的这种特性,我们常常用它来揭示细胞内 DNA 倍性的关系,从而推导出细胞所处的周期。
然而,流式细胞术只能检测在某一时刻穿过激光的细胞的荧光强度,但无法直接判断在这一时刻到底穿过了几个细胞。
如果有细胞粘在一起或是正巧同时穿过激光,流式细胞仪则会读取其整个荧光强度,从而导致对单个细胞 DNA 含量测定上的误差。
为了解决这个问题,我们常常做一张以 FL2-W 和 FL2-A 分别为横纵坐标的散点图。
FL2-W 指的是第二通道(PI 里该细胞通过时的时间,而 FL2-A 指的是第二通道里该细胞的总荧光强度。
当细胞粘联时,期总体积与质量变大,导致通过激光时间变长,所以 FL2-W 的值会比单个细胞大出很多。
通过这种方式,我们可以将 FL2-W 比较统一(小的细胞用门圈出,以排除粘联体,从而确保周期分析的准确性(如下图所示。
然后我们就可以在 FL2-A 的直方图上直观地对细胞倍性进行分析了。
材料:∙被检测细胞∙ FACS Lysing Solution (细胞裂解液, 1倍或 10倍, 10倍的要先稀释到 1倍后使用∙BD CycletestTM Plus DNA Reagent Kit (340242∙Solution A (10mL×1 (Trypsin in Spermine Tetrahydrochloride Detergent Buffer ∙Solution B (8mL×1 (RNase A and trypsin Inhibitor in Spermine Buffer∙Solution C (8mL ×1 (Propidium Iodide (PI in Spermine Buffer ∙Buffer Solution (50mL ×3 (DMSO in Sucrose-Sodium Citrate注意:Solution A, B, C 中含有 spermine tetrahydrochloride,对皮肤和粘膜有刺激性;Solution C中 PI 有毒,并具有潜在的致癌性;Buffer Solution 中含有 DMSO ,具有潜在的致畸性。
操作时戴手套,注意避免眼睛,皮肤和衣服与以上试剂的接触。
Solution A 和 B 在室温下使用(20⁰ C-25⁰ C , Solution C 要在 2⁰ C -8⁰ C 下避光保存。
步骤:1. 在 200 µL外周血加入 2mL 裂解液,室温下孵育 10min2. 将裂解好的外周血离心 1200rpm , 5min ,去上清液3. 加入 2mL 鞘液,混匀(如不含红细胞样本无需裂红,从此步骤开始,取 106细胞4. 离心 1200rpm , 5min ,去上清液5. 加入 250µL Solution A, 轻轻混匀(不要涡旋 ,室温下孵育 10min6. 加入 200µL Solution B, 轻轻混匀(不要涡旋 ,室温下孵育 10min7. 加入 200µL Solution C,混匀,在冰上或者冰箱里避光孵育 10min8. 将样本用 35-50µm的滤网(300目过滤9. 3小时内上机(如果不能立刻上机, 2⁰ C -8⁰ C 避光保存样本对照:1内参:样本内含有已知倍性的细胞亚群2外参(optional :同类已知倍性的细胞。
细胞凋亡 (Apoptosis原理:细胞程序性死亡 /凋亡(apoptosis 是机体移除不需要的细胞的一种常见的机制。
细胞凋亡早期的标记之一是 PS (phosphatidylserine 自胞膜内表面到外表面的转移。
Annexin V (AV 和 PS 有很强的亲和力,所以被荧光标记后常常在流式中被用来检测外翻的 PS 。
在细胞凋亡后期,细胞膜常常会破裂。
这种现象在流式中可以用propidium iodide (PI 检测。
PI 是一种核染料。
当细胞膜完整时, PI 无法穿透胞膜,故无法对细胞核进行染色。
AV 与 PI 共同使用时,可以对细胞凋亡的各个时期进行检测:正常活细胞显示 AV 和 PI 的共阴性;早凋细胞显示 AV 阳性和 PI 阴性;晚凋细胞则显示 AV 和 PI 的双阳性。
然而,可以被 AV 和 PI 共同染色的细胞并不一定处于凋亡晚期。
坏死的细胞在晚期也会被 AV 和 PI 共同染色。
所以要想做到对细胞凋亡精确的检测则需要对整个凋亡过程进行监测, 即 AV 阴性 & PI阴性→ AV阳性 & PI阴性→ AV 阳性 & PI 阳性。
材料:∙被检测细胞∙BD PharmingenTM FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I (556547∙10X Annexin V Binding Buffer (50mL×1 51-66121E ∙FITC Annexin V (AV (0.5mL×1 51-65874X ∙Propidium Iodide (PI Staining Solution (2.0mL ×1 51-66211E注意: PI 有毒,并具有潜在的致癌性。
操作时注意安全,要戴手套。
步骤:1. 将 10倍的 Annexin V Binding Buffer 稀释为 1倍 (将 1容积的 Buffer 加到 9容积的蒸馏水中2. 用冷 PBS 把细胞溶液清洗 2次(离心1200rpm/5min → 去上清液→ +2mL PBS → 混匀→ 离心1200rpm/5min → 去上清液→ +2mL PBS→ 混匀离心→1200rpm/5min → 去上清液3. 将清洗好的细胞加入 1倍 Annexin V Binding Buffer中(终浓度 106细胞 /mL4. 在 5mL 的流式管中加入 100 µL步骤 3的细胞溶液(应含 105细胞5. 在每一管样本溶液中加入 5µL的 FITC Annexin V 和 5µL的 PI6. 将溶液轻轻地震荡后,避光在室温下(25⁰ C 孵育 15min7. 加入 400 µL 1倍 Annexin V Binding Buffer8. 在 1小时内上机对照:1. 未染色细胞(全阴2. 单染 FITC Annexin V3. 单染 PI4. 正常细胞(未经凋亡药物处理加 AV 和 PI6-C TBNK检测原理:人类的淋巴细胞按照表面抗原的表达可以被分成三大类:T 细胞(CD3+, B 细胞(CD19+和 NK 细胞(Natural Killer自然杀手(CD16+CD56+。
这些淋巴细胞表面还会表达一些其他的抗原。
根据这些抗原的表达,我们可以做出对某些疾病的检测和诊断。
例如:CD3+CD4+淋巴细胞的比例和绝对数量是检测 HIV 阶段的重要指标(随着 HIV 的加重, 患者血液中 CD3+CD4+淋巴细胞的数量会逐渐减少; CD3+CD4+淋巴细胞的比例和绝对数量以及 T 细胞和 B 细胞的总量也常常是诊断其他免疫缺失疾病和自免疫疾病的依据;表达 CD3-CD16+/CD56+的 NK 细胞往往对某些肿瘤细胞和被病毒感染的细胞有杀伤力,所以其数量是个体对该症状抵抗力的量化表达。