缺血性脑中风的动物模型研究进展

缺血性脑中风的动物模型研究进展

发表时间：2012-09-13T16:06:44.077Z 来源：《医药前沿》2012年第6期供稿作者：冯斌[导读] 大脑组织对局部缺血非常敏感，即使神经元的短时间缺血也会引发一系列的事件，最终导致细胞的死亡

冯斌（中南民族大学生命科学学院湖北武汉 430074）【摘要】脑中风是世界引起死亡的第二大病因，目前常用动物模型来研究脑中风。本文详细阐述了缺血性脑中风的三类动物模型，并指出缺血性脑中风动物模型的有关问题和发展前景。【关键词】急性缺血性脑中风动物模型【中图分类号】R322.8-3 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2012）06-0017-02 1.前言

脑中风是世界引起死亡的第二大疾病，在存活的病人中，它又有高致残率。脑中风一般可分为缺血性脑中风（占所有脑中风的85%）和出血性脑中风（占所有脑中风的15%）。其中缺血性脑中风的定义是血流减少导致正常细胞的功能改变。大脑组织对局部缺血非常敏感，即使神经元的短时间缺血也会引发一系列的事件，最终导致细胞的死亡。许多的实验模型用来研究中风损伤，对细胞损伤机制的研究是在特定模型中测试各种不同处理对细胞应激和死亡的影响。三个主要的缺血性中风动物模型是：（1）全脑缺血模型，（2）局灶性缺血模型，（3）体外研究模型。

2.全脑缺血中风模型

局灶性中风模型被认为是与人脑中风模型最接近的模型。然而，全脑缺血模型能模拟人的心搏停止和昏厥等临床症状[1]。从一个可逆的全脑缺血模型恢复的过程中，测量生理、生化和功能等方面的因素对于识别分子和细胞机制以及潜在的神经保护剂的药理作用等方面有着重要作用。因此全脑缺血模型可能与局灶性缺血模型一样有用。三种最常用的全脑缺血模型是：1、大鼠四血管阻塞（4-VO）或者低血压两血管阻塞（2-VO）；2、沙鼠-2-VO；3、小鼠-2-VO。小鼠-2-VO模型是为了研究转基因老鼠而发明的，是一个常用的模型 [1]。另一种全脑缺血模型是通过颈部缚带，心搏停止，或者通过结扎或压紧所有的心脏动脉制造全脑缺血。在这种模型中血流量小于1%或者为0。由于该模型的高死亡率，并没有得到广泛的应用。

2.1大鼠全脑缺血模型

四血管阻塞（4-VO）：该模型有许多优点，包括制造模型十分容易，可预测的缺血神经损伤的发病率高，惊厥的发病率低和不需要麻醉药。这个模型曾经并且仍然被广泛的用于寻找潜在的脑中风治疗药物。大鼠4-VO模型包括椎动脉永久结扎，以及两个颈动脉的临时结扎。

双血管阻塞（2-VO）：这个模型在一般的麻醉条件下进行并且需要注射肌肉松弛剂。大量证据表明双侧劲总动脉的栓塞不能使大脑充分缺血，或者扰乱脑组织能量状态产生可检测到的细胞死亡[2]。因此为了产生缺血性脑损伤，在双侧颈动脉阻塞的同时还必须通过降低血压的方法来减少脑内血流量。降低血压通常用以下三种方法的一种来达到：（1）放血控制法，（2）注射外周血管扩张剂，（3）联合运用以上两种方法。结扎双侧颈总动脉并且使血压减少到50mmHg导致的损伤结果比4-VO更严重。海马、新皮质和纹状体中的血流量降到3～5%。然而，在一些情况下血流量只下降到对照组的15%左右[1]。

2.2 沙鼠的全脑缺血模型

这个模型通常只临时结扎颈总动脉而不降低其血压。因为沙鼠中没有脑后部的动脉连接，所以一般会产生严重的前脑缺血。局部的中枢神经系统血流的改变与大鼠模型中相似，皮层中的血流量约为控制组的1%，海马中的血流量约为控制组的4%。

2.3 小鼠的全脑缺血模型

小鼠的全脑缺血模型与大鼠2-VO模型相似。一些研究表明用2-VO或者低血压2-VO技术制作的小鼠全脑缺血模型对海马CA1区神经元的损伤数量比较一致[3]。然而，由于通过后交通动脉的侧支循环的多样性，要在CA1区得到一致的损伤并且同时保持较高的存活率和实验成功率是困难的。一个模型结合了基底动脉和双侧颈总动脉栓塞——三血管栓塞。但在这个模型当中动物的存活率低，并且CA1区的损伤不一致。

3. 局部脑缺血模型

局部脑缺血模型与全脑缺血模型有两点不同。首先，即使是在损伤的中心区域，血流量总是比全脑缺血模型要高些。其次，从损伤中心区域到损伤的外周有一个明显的梯度，因此在这个区域的代谢条件是不同的。由于局部脑缺血模型的持续时间和异质性，它的损伤比全脑缺血模型更加复杂。同时，它也是类似人脑中风的情况，所以被广泛的研究。

局部脑缺血模型有两类：短暂局部脑缺血模型和永久局部脑缺血模型。在短暂局部脑缺血模型中，血管在堵塞三小时后被再灌注；然而，在永久局部脑缺血模型中，血管被堵塞的时间通常是一天或者几天。

3.1短暂中动脉栓塞

该模型中有两个主要的栓塞位点。在近体端，栓塞位点在靠近颈内动脉的分支处。目前广泛运用的栓塞方法是在颈动脉中插入一段尼龙线，经过中动脉的分支处，从而造成中动脉栓塞。

具体的流程如下：将大鼠的颈部正中切开后，分离左侧的颈外动脉和翼腭动脉并用丝线结扎。在颈内动脉分叉的周围栓塞颈总动脉，同时用小夹子夹住翼腭动脉，用丝线结扎颈总动脉。用一根尼龙线(0.20-0.22 mm，尖端磨钝) 插入颈外动脉。用丝线扎紧颈外动脉和尼龙线。在中动脉栓塞中，用激光多普勒测速仪检测血流量，栓塞时血流量应为栓塞前基线的20%。在一段栓塞时间之后抽出尼龙线，血液从颈内动脉流出再灌注。

3.2永久性中动脉栓塞

常用的永久性局部脑缺血模型是栓塞中动脉的一个或者多个分支。简要步骤如下：把颞肌剥离开后，在靠近颧骨和鳞状骨结合2-3mm 处钻一个2-3mm深的孔。然后打开和剥离硬脑膜，使中动脉曝露。用一个钢钩通过显微操作仪把中动脉挑起并用电凝法使其栓塞。另外一个常用的永久性局部脑缺血模型是用线结扎中动脉24小时以上。

3.3光化学诱导局部脑缺血模型

在这个模型中，血管的血栓是由光源对通过静脉注射的感光染料产生作用而形成栓塞。电子显微镜和光镜观察发现血管内形成血栓物质，血红细胞停滞，血小板附着在血管壁，这些将最终导致脑梗塞。在这个模型中光化学反应破坏血脑屏障导致通透性增加。该模型的方法是：在大鼠右侧的眼睛和耳朵之间切开一个长度为1-1.5cm的垂直切口。然后钻开一个小孔，但不能伤到硬脑膜。右边的中动脉的末梢部分就会暴露出来。用波长为568nm的氪激光照射中动脉末梢4分钟。在激光照射的同时静脉注射感光染料。

4.缺血性中风的体外研究模型

脑切片，从皮层培养的原代神经细胞，胶质细胞以及胎儿期或围产期啮齿动物的海马和小脑，这些都广泛的被用作研究脑缺血样损伤的模型。通常把细胞培养在用N2/CO 2代替O 2/CO2的培养箱中。当培养条件缺氧而不缺葡萄糖时，损伤称为缺氧症，当氧糖都缺时，损伤称为体外脑缺血或者氧糖剥夺（OGD)。仅是缺糖也能导致神经元的死亡，并且其某些特征与体外脑缺血模型相似。用氰化物也能导致缺氧症，其原因是产生了过量的自由基。体外中风模型在许多方面不同于体内脑中风模型。例如，在体外需要长时间的缺氧才能使神经元死亡；ATP消耗比体内脑缺血模型少，谷氨酸的释放晚。由于体外没有血管和血流，就没有由血管和血流引起的体内重要的结构和功能损伤的过程。另外，体外胶质细胞的组织和反应性与完整大脑也是不同的。

尽管体内和体外两个实验体系有明显的不同，但是它们在模拟脑中风发生的条件也有许多相似之处。因此，我们有一个简洁、高度可控的实验体系提供细胞怎样响应氧糖剥夺的相关信息。另一方面，脑部结构的复杂性也需要一个体内缺血性中风模型。这两个方法是互补的，而这在疾病的动物模型中是少有的，为该领域的研究提供了很好的实验条件。

4.1器官型脑切片培养

器官型脑切片培养技术的优点是神经元的形态、解剖上的连接和神经网络都得到了很好的保持。器官型脑切片越来越多的被用于检测神经细胞的死亡，细胞迁移的机制，髓鞘的形成，神经元电生理活动和突触的可塑性等实验。它也被用来研究基本的细胞机制和缺血性脑中风的治疗方法。器官供体通常是啮齿动物。

大多数的脑切片来自于出生十天以内的动物。有两种主要的切片培养方法：G禇hwiler 发明的滚筒技术[4]和Stoppini的界面培养技术[5]。脑切片在界面培养法中是静止的，适合于研究三维结构，而在滚筒中通常被用来做图像学实验。

4.2 原代神经元培养

培养原代皮层神经元通常来源于妊娠期15到17天的大鼠或者小鼠。麻醉怀孕的老鼠，取出胎儿，把脑部分离并捣碎，放入Hanks溶液中（HBSS）。过一段时间移入含酶的消化液中消化。接下来再用HBSS清洗，并进一步磨碎细胞，直到肉眼可见的组织块消失。再把细胞悬浮液放在含有Neurobasal的培养皿中培养。适合于培养原代神经元的基质是多聚左旋赖氨酸，多聚右旋赖氨酸和聚乙烯亚胺。对基质的选择依赖于实验的性质。一般细胞要培养5到7天再用于实验。

4.3 原代神经胶质细胞的培养

星形胶质细胞占成年哺乳动物脑细胞的50%。除了为神经元提供结构，代谢和营养方面的支持之外，最近还发现它们有保护神经元免受有害刺激的作用。因此，在体外条件下研究它们有助于理解它们在脑中风病理学中的作用。星形胶质细胞来源通常是一到三天的幼年动物。首先，取下大脑放入含有HBSS的培养皿中。将大脑切成小的组织块。然后用胰蛋白酶消化。得到的悬浮液在室温中离心。再在分装到新的培养液中培养。在开始阶段，每隔三天换一次液体。最后培养得到的结果是星形胶质细胞、小神经胶质细胞和少突细胞的混合培养物。最后经过震荡分离、胰蛋白酶消化、离心等步骤就可以得到高度纯化的星形胶质细胞。

5.总结与展望

许多中风模型已经开发出来了。体内中风模型最主要的三类是全脑缺血模型，局部缺血模型和体外研究模型。中风损伤的细胞和分子机制的研究不断深入，大量针对损伤不同通路的药物正在被开发出来。然而，尽管在动物模型中许多的药物都能阻断导致神经元缺血性死亡的级联反应，但是在人脑中风中却没有发现到有良好效果神经保护的药物。这种在动物模型和临床试验中存在的不一致性可能是由于以下的一些因素：人脑中风的异质性，人和动物脑部形态和功能的区别，中风后临床试验注射药物的时间相对较晚，在动物实验中实验条件能得到更好的控制（如温度，血压等）。把动物模型转换成临床试验任然有许多重要的问题没有解决。最近的一项实验采用灵长类动物研究缺血性脑中风[6]，这也许为我们将来的研究指明了方向。参考文献

[1] McBean DE, Kelly PAT. Rodent models of global cerebral ischemia: A comparison of two-vessel occlusion and four-vessel occlusion [J]. General Pharmacology, 1998, 30:431-434.

[2] Sicard KM, Fisher M. Animal models of focal brain ischemia [J]. Exp Transl Stroke Med,2009,1 :7.

[3] Yonekura I, Kawahara N, Nakatomi H, et al. A model of global cerebral ischemia in C57BL/6 mice [J]. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism, 2004, 24:151-158

[4] Gahwiler BH. Organotypic monolayer-cultures of nervous-tissue [J].Journal of Neuroscience Methods, 1981, 4:329-342.

[5] Stoppini L, Buchs PA, Muller D. A simple method for organotypic cultures of nervous-tissue [J]. Journal of Neuroscience Methods, 1991, 37:173-182.

[6] Cook D J, L Teves, Michael T. Treatment of stroke with a PSD-95 inhibitor in the gyrencephalic primate brain [J]. Nature, 483(7388):213-217.