血凝及血凝抑制实验
血凝(HA)和血凝抑制试验(HI)资料
2、HI试验可用于发病禽群的诊断
鸡、鸭、鹅规模化养殖中虽进行相关疫病疫苗的免疫，但往往有部分家 禽由于各种原因免疫力水平达不到要求，因而造成某些传染病的流行。 由于免疫禽群发病时临床症状和病变不典型，给确诊带来困难。采用HI 试验对鸡群中禽流感、新城疫等抗体进行测定，依据抗体滴度的高低和 离散性有助于诊断。 例如：经新城疫活苗加灭活苗免疫过的鸡群，新城疫抗体水平平均为 7Log2～8Log2，最高为10Log2。而新城疫感染鸡群中HI抗体部分高 达11Log2～13Log2；就抗体分布而言，鸡新城疫免疫鸡群抗体水平呈 正态分布，HI抗体在10Log2以上者仅占10％以下，4Log2以下者在1 ％以下。而感染了新城疫强毒并出现发病的鸡群，HI抗体中10Log2以 上者占25％以上，而4oLg2以下者在10％～30％之间。因此，依据禽 群的抗体水平高低和分布，结合临床症状和病、死鸡的剖检变化，可诊 断禽群是否患有新城疫或禽流感等。
1.3 原理
血凝的原理因不同的病毒而有所不同,如:
痘病毒对鸡的红细胞发生凝集并非是病毒本身，而 是痘病毒的产物--类脂蛋白的作用。
流感病毒的血凝作用是病毒囊膜上的血凝素与红细 胞表面的受体糖蛋白相互吸附而发生的。
2、血凝抑制试验(HI)
2.1定义
当病毒的悬液中先加入特异性抗体，且这种抗体的 量足以抑制病毒颗粒或其血凝素，则红细胞表面的 受体就不能与病毒颗粒或其血凝素直接接触。这时 红细胞的凝集现象就被抑制，称为红细胞凝集抑制 (hemagglutination inhibiion，HI)反应，也称血 凝抑制反应，利用这种特性设计的试验称血凝试验 (HI) 。
三、实验步骤
（以禽流感为例，参照禽流感防治技术规范）
1 阿氏（Alsevers）液配制 量葡萄糖2.05g、柠檬酸钠0.8g、柠檬酸
血凝试验(HA)及血凝抑制试验(HI)
一、目的要求 掌握HA和HI试验的基本操作技术，了解其实用价值。 二、实验材料 1、禽流感毒 2、1%鸡红细胞 3、生理盐水 4、禽流感阳性血清 5、96孔“V”型微量反应板 三、实验内容 1、HA试验术式表： 2、HI试验术式表： 四、作业 1、病毒凝集红细胞是不是一种特异的抗原抗体反应？为什么？ 2、HI试验是不是特异的抗原抗体反应？为什么
25
25
1： 2 1： 4 1： 8 ﹟ 以100%凝集病毒最大稀释孔为该病毒的凝集价
血凝抑制试验(HI)
一、概念： 1 、 HI 试验：病毒的红细胞凝集现象，可以被特异性免疫血清所抑制， 称HI试验。 2、抗体效价：出现红细胞凝集抑制现象的血清的最大稀释倍数叫抗体 效价。
病毒的红细胞凝集试验（HA）
一、 概念 病毒的红细胞凝集现象：许多病毒表面有血凝素，能与各种动物的红细胞 表面受体结合，而出现红细胞凝集现象，简称为病毒的血凝现象。 二、应用 1 、当以被检动物的某一器官为病料，进行HA试验，结果为阳性者，证明 该被检材料中有能凝集红细胞的某种病毒。 2 、凝集价的测定：将被检病毒材料，稀释成不同的稀释倍数，进行 HA试 验，出现血凝现象的各稀释孔中，以100%能出现病毒的红细胞凝集现象的 病毒的最大稀释倍数者即定为凝集价(血凝价)
二、动物体内抗体存在情况 1、当动物感染某病毒而发病时，可在机体的相应器官查出病毒。
2、病毒相当于免疫效应物质中的抗原，病毒进入动物机体，将发生特异
性免疫反应，即产生免疫物质——抗体（ 90%抗体都存在于动物的血清 中），抗原和抗体发生特异性结合反应 3、病畜体内，因受病毒抗原刺激，产生大量相应抗体，故体内抗体效价 较高 4、健康动物，免疫接种后，因受疫苗（抗原）刺激，而发生免疫应答反 应，体内抗体效价较高
01实验一 病毒血凝和血凝抑制试验
弃 去 25
25 25
振荡混 合后 37℃ 1030min 振荡混 合后 37℃ 45min
血清
25
25
25
25
25
25
25
25
25
25
1%红 细胞
25
25
25
25
25
25
25
25
25
25
25
25
结果
+
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
抑制 价
32
16
8
4
2
1
1：21
1
孔号
1
原液
2
1：21
3
血抑制试验（HI） 4 5 6 7 8 9 10
1：23 1：24 1：25 1：26 1：27 1：28 1：29
11 12
1： 210
备注
稀释 度 生理 盐水
1：22
25
25
25
25
25
25
25
25
25
25
25
病毒 液
25
25
从上一稀释孔的混合液中吸取25 μ L致下一孔
三、实验材料 新城疫病毒液0.1mL 1%鸡红细胞50mL 生理盐水50mL 阳性血清0. 5mL 96孔“U”形或“V”形微量反应板 25μ L定量移液管 滴头
四、实验内容及操作程序 1．血球凝集试验（HA） 以新城疫病毒为例，操作 过程如下（表10-1） • （1）在96孔“V”形微量反应板上进行，自左至 右各孔加25μ L生理盐水。 • （2）于左侧第1孔加25μ L病毒原液或收获液，混 合均匀后，吸25μ L至第2孔，混合均匀后，吸 25μ L至第3孔，依次倍比稀释，至第11孔，吸弃 25μ L，稀释后病毒稀释度为第1孔1:2，第2孔1:4， 第3孔1:8……。最后1孔为对照。
血凝HA和血凝抑制试验HI
HA值可用于评估血液凝固功能和血栓形成风险
试验方法
添加标题
添加标题
添加标题
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试验材料：抗凝剂、试管、离心机、凝血因子活性检测试剂等。
试验原理：通过观察血液凝固过程，检测血浆中凝血因子的活性。
试验步骤：采集血液样本，加入抗凝剂，离心分离血浆，加入凝血因子活性检测试剂，观察血液凝固时间并记录结果。
不同点：血凝HA试验只能判断是否存在凝血功能障碍或血栓前状态，而血凝抑制试验HI不仅可以判断是否存在凝血功能障碍或血栓前状态，还可以检测抗凝物质的具体类型和浓度。
试验方法的比较
血凝HA试验：通过观察血凝块的形成和溶解过程，检测抗凝物质的存在和含量
操作简便性：血凝HA试验操作相对简单，而血凝抑制试验HI需要更多的样本和操作步骤
参考值：血凝HA试验结果的参考值一般为阴性或阳性，具体参考值因不同病毒而异。
临床意义
用于诊断血栓栓塞性疾病
评估血液高凝状态的风险
辅助诊断易栓症等血栓前状态
监测抗凝治疗的效果
02
血凝抑制试验HI
试验原理
血凝抑制试验HI是一种检测病毒抗体的方法，通过与特异性抗体结合，抑制病毒的凝集活性，从而检测出病毒抗体。
临床意义
用于诊断疾病：血凝抑制试验HI可以用于诊断多种疾病，如流感、麻疹等病毒感染性疾病，以及疟疾、血友病等出血性疾病。
监测治疗效果：通过血凝抑制试验HI，可以监测治疗效果，评估病情进展和预后。
指导治疗：血凝抑制试验HI的结果可以指导治疗，例如在输血时，通过血凝抑制试验HI可以确定最佳的输血量。
流行病学调查：血凝抑制试验HI还可以用于流行病学调查，了解疾病的流行趋势和分布情况。
试验意义：用于检测凝血因子活性，评估血液凝固功能，协助诊断凝血障碍相关疾病。
血凝和血凝抑制试验原理(一)
血凝和血凝抑制试验原理(一)血凝和血凝抑制试验1. 概述血凝和血凝抑制试验是一种常见的临床实验室检查方法，用于评估血液凝结和抗凝功能。
它可以帮助医生判断个体的凝血状态，从而进行相应的治疗和预防措施。
2. 血凝原理血液的凝结是一种复杂的生理过程，涉及多种凝血因子和细胞的相互作用。
当大血管破裂时，损伤的组织会释放一种称为组织因子的物质，它与循环中的凝血因子相互作用，引发一系列的凝血反应。
凝血反应中，血浆中的凝血因子会被激活并相互作用，最终形成稳定的纤维素凝块，促使伤口止血。
这个过程中，包括凝血因子I（纤维原）、II（凝血酶原）、III（组织因子）等在内的多个物质起到关键作用。
3. 血凝抑制原理为了避免血液在正常情况下过度凝结，人体内也存在一系列抗凝物质。
这些抗凝物质包括抗凝酶、抗凝素、溶纤酶等，并与凝血因子形成复杂的调控网络。
血凝抑制试验通过检测这些抗凝物质的活性，来评估抗凝功能的正常与否。
常见的血凝抑制试验包括凝血酶时间（TT）、部分凝血活酶时间（APTT）、血浆纤维蛋白原等。
4. 血凝和血凝抑制试验的应用血凝和血凝抑制试验广泛应用于临床诊断和治疗中。
通过这些试验可以帮助医生判断患者的凝血功能是否正常，从而指导药物治疗和手术操作。
一些疾病，例如血栓性疾病和出血性疾病，都与凝血功能紊乱有关。
通过血凝和血凝抑制试验，可以及早发现这些疾病的存在并进行治疗。
此外，血凝和血凝抑制试验还被广泛用于药物研发和安全性评价。
一些药物可以影响凝血功能，通过检测血液的凝血和抗凝状态，可以评估药物的药理学性质和安全性。
5. 结语血凝和血凝抑制试验是一项重要的临床实验室检查方法，可以帮助医生评估患者的凝血功能和抗凝功能。
它在临床诊断、治疗和药物安全性评价中发挥着重要作用。
通过这些试验，我们可以更好地了解人体的生理状态，并为临床工作提供有力的支持。
6. 试验过程血凝和血凝抑制试验通常需要在临床实验室进行，以下是一般的试验过程：1.采集血样：先使用消毒剂清洁采血点，然后使用注射针和导管采集适量的静脉血。
血凝和血凝抑制试验
血凝和血凝抑制试验一些病毒或病毒的血凝素能选择性地使某种或某几种动物的红细胞发生凝集，这种凝集红细胞的现象称为血凝(Hemagglutination，HA)。
正粘病毒和副粘病毒是最主要的红细胞凝集性病毒；其他病毒包括披膜病毒、细小病毒、某些肠道病毒和腺病毒等也有凝集红细胞的作用，但常要求比较严格的反应条件，例如一定的pH范围等。
各种病毒的血凝素性质不尽相同。
某些病毒可在很广的pH条件下呈现血凝作用，某些病毒则只在很窄的pH范围内才能凝集红细胞。
某些病毒的血凝作用具有温度依赖性，也就是只在一定温度范围内才出现血凝现象；但另一些病毒却可在4℃、室温和37℃呈现同样的血凝作用。
病毒凝集的红细胞种类，也随病毒种类而不同，例如某些病毒主要对人和禽的红细胞呈现凝集作用，另一些病毒则可凝集豚鼠或大鼠等的红细胞。
当病毒的悬液中先加入特异性抗体，且这种抗体的量足以封闭病毒颗粒或其血凝素时，则红细胞表面的受体就不能与病毒颗粒或其血凝素直接接触，这时红细胞的凝集现象就被抑制，称为红细胞凝集抑制(HemagglutinationInhibition，HI)，也称为血凝抑制反应。
血凝的原理因病毒而有所不同，如痘病毒对鸡红细胞发生凝集作用并非是病毒的本身，而是痘病毒的产物类脂蛋白的作用。
而流感病毒的血凝作用是病毒囊膜上的血凝素与红细胞表面的受体糖蛋白相互吸附而发生的。
病毒的血凝现象大致可以分为可逆转型、不可逆转性、凝集条件严格型三类。
血凝和血凝抑制试验有常量法和微量法两种，目前国内外广泛使用的都是微量法，各要素用量均为25ul，微量法省时、省料、高效。
以下简要介绍本次试验的主要内容，详细内容参见各国标。
各实验室所采用的HA和HI试验程序不同，下面的例子是应用V型微量板进行的试验，两种方法反应总体积都为75ul，本试验所用试剂为如下：1.生理盐水：用蒸馏水或去离子水配制成0.85％NaCl溶液，高压灭菌备用。
2.红细胞悬液：采鸡血液，加于倍量的红细胞保存液-阿氏液中，置4℃普通冰箱保存，可用一个月。
血凝、血凝抑制试验
⾎凝、⾎凝抑制试验红细胞凝集试验（HA）与红细胞凝集抑制试验（HI）⼀、实验⽤设备：1、离⼼机 1台*（3000转离⼼红细胞）2、冰箱 1台*（存放抗原）3、振荡器 1台*（振荡96孔V型板）4、抗原新城疫（ND）、减蛋（EDS）、流感（AI）抗原，从正规⼚家进。
5、96孔V型板稀释⾎清清洗后可重复使⽤6、⼋道移液器 1把（5-50微升稀释⾎清）7、吸头和⼋道移液器配套使⽤，清洗后重复使⽤）8、积液槽配制4个单位抗原及盛放⽣理盐⽔加样⽤9、⼀次性采⾎管采⾎⽤10、2毫升注射器采⾎⽤11、红细胞⾮免疫鸡⼼脏采⾎或免疫鸡也可，但需离⼼5次后使⽤。
12、柠檬酸三钠配制3.8％抗凝剂⽤13、重铬酸钾配制清洁液⽤14、硫酸配制清洁液⽤15、吸管 1毫升、10毫升16、吸⽿球和吸管配套使⽤17、针头 9*13（采雏鸡）、9*25（采⼤鸡）18、蒸馏⽔当地买。
清洗96孔V型板、吸头⽤19、10毫升离⼼管离⼼红细胞⽤（塑料制）20、⽣理盐⽔做⾎清稀释液⽤、配制4单位抗原⼆、实验前的准备：1.抗原：从指定⼚家购买稳定浓缩抗原。
2.抗凝剂的配制：⽤天平称量3.8克柠檬酸三钠，溶⼊100ml⽣理盐⽔中，待溶解完全后即可使⽤。
3.1％红细胞悬液：由鸡⼼脏或翅静脉采⾎，放⼊加有抗凝剂的离⼼管内（按抗凝剂：全⾎＝1：2的⽐例），迅速混匀。
在离⼼机中以3000转/分离⼼5分钟，⽤吸管吸去上清液和红细胞上层的⽩细胞薄膜，将沉淀的红细胞加⽣理盐⽔，慢慢混合均匀，再在离⼼机中3000转/分离⼼5分钟，弃去上清液，再加⽣理盐⽔混匀，如此反复离⼼4～5次，最后⼀次离⼼后的红细胞，弃去上清液，即为红细胞泥。
放⼊4℃冰箱中可保存2—3天。
使⽤时⽤1ml 吸管吸取0.1ml红细胞泥，然后加⼊9.9ml的⽣理盐⽔，此即1%红细胞悬液。
现⽤现配。
4.被检⾎清：每只鸡⼼脏或翼下采⾎0.5-1ml,静置或离⼼，待⾎清析出后备⽤。
5.吸管清洁液的配制：使⽤1%的稀硫酸溶液。
血凝与血凝抑制试验(附思考题及答案)
五、结果判定
• 血凝试验：根据血凝价稀释病毒悬液 • 血凝抑制试验：血凝抑制试验效价：出现完全血凝抑制时的最高
血清稀释度。
Байду номын сангаас
六、思考题
• 1、血凝价判定偏高或者偏低对血凝抑制价的判定结果有什么 影响？
• 若血凝价判定偏高，即稀释的倍数偏高，使得病毒浓度未达 到要求的4个血凝单位，则需要中和病毒的血清更少，即血清 的稀释倍数更大，因此结果会偏高。
将血浆、白细胞等充分洗去，用生理盐水配置成1%红细胞悬液备 用 • 0·85%生理盐水 • 鸡血清
四、实验步骤
• （一）血凝试验 • 1～12孔加入生理盐水 • 第一孔加入50ul病毒悬液，倍比稀释至第11孔 • 1～12孔加入1%的红细胞50ul • 震荡后置于37度恒温箱25～30min后，观察结果 • 病毒的血凝价？ • 病毒的血凝价：能使红细胞产生50%凝集的病毒最高稀释度。
血凝和血凝抑制试验
安尧o
一、实验目的
• 1、掌握病毒血凝与血凝抑制试验的原理。 • 2、掌握试验的设计、操作步骤和结果的判定。
二、实验原理
• 血凝试验（HA）：
• 血凝抑制试验（HI）：
• 某些病毒能够使动物的红细胞发 生凝集现象。
• 红细胞凝集的本质是抗原-抗体 反应，红细胞表面存在凝集原
• 在病毒悬液中加入特异性抗体
• 2、血凝和血凝抑制试验的应用？ • 血凝试验可以检测某种病毒是否具有凝集红细胞的能力，测
定病毒的血凝价、滴度，血凝抑制试验可以检测抗体是否有 效，抗体的效价。
请在此处添加标题
• （二）血凝抑制试验 • 1～11孔加入25ul生理盐水 • 第1孔加待检血清25ul，倍比稀释至第10孔 • 1～11孔加入25ul4个血凝单位的病毒悬液 • 1～12孔加入1%红细胞50ul • 震荡后置37度恒温箱25~30min观察结果。 • 红细胞凝集100%的抑制作为结果判定的终点
血凝与血凝抑制试验原理
血凝与血凝抑制试验原理
血凝与血凝抑制试验是一种常用的血液凝血功能检测方法，用于评估体内凝血系统的功能状态。
血凝试验原理：
血凝试验通常采用活化部分凝血时间（APTT）或凝血酶时间（TT）来衡量血液凝血的能力。
在血凝试验中，通过向血浆中加入一定量的凝血酶原激活体（如凝血酶），观察血浆在特定条件下形成凝块的时间。
正常血液凝固功能良好的人，凝血时间较短，血浆在凝血酶原激活体的作用下能很快形成凝块。
血凝抑制试验原理：
血凝抑制试验是为了检测某些抗凝物质（如抗凝血酶、抗凝血酶原等）对凝血系统的抑制作用。
在血凝抑制试验中，首先向血浆中加入一定量的凝血酶原激活体，观察血浆在特定条件下形成凝块的时间。
然后再加入待测的血凝抑制物质，在不同浓度下观察凝血时间的变化。
如果抗凝物质的浓度越高，凝血时间延长的程度越大，则说明该抗凝物质对凝血系统的抑制作用越强。
血凝与血凝抑制试验的原理即通过衡量血浆的凝血时间来评估凝血系统的功能状态或抑制物质的抑制能力。
血凝和血凝抑制试验
血清
生理盐水 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 50
被检血清 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 弃 25μl / /
病毒悬液 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 /
1%RBC 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50
实验八 血凝和血凝抑制试验
（Hemagglutination and Hemagglutination Inhibition, HA and HI）
2013.12.11
能凝集红细胞的病原
禽流感病毒 新城疫病毒 传传染性支气管炎病毒（胰酶，磷脂酶C） EDS76 副鸡嗜血杆菌 鸡毒支原体
＝1:23为可疑
六、思考题
血凝和血凝抑制试验在兽医学中的应用。
细胞对照
HA HI
孔号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 RBC RBC
稀释倍数 1:21 1:22 1:23 1:24 1:25 1:26 1:27 1:28 1:29 1:210
生理盐水 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 病毒悬液 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 弃 5/0μl / 1%红细胞 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50
3. 0.85%生理盐水。 4. 被检血清，采自被检鸡的健康血清。
四、实验步骤
（一）血凝试验（HA）
1. 1~12孔加入50μl生理盐水; 2. 第1孔加50μl病毒悬液，倍比稀释到第10孔； 3. 1~12孔中加入1%的红细胞50μl； 4. 震荡后置37℃25~30min观察结果。 5. 病毒液的血凝价是1:2？。
血凝实验和血凝抑制实验报告
血凝实验和血凝抑制实验报告一、引言血液凝固是维持人体生命活动的重要生理过程之一。
当人体受到损伤时，血液会迅速凝固形成血块，以阻止出血。
然而，血液凝固过程的异常可能导致血栓形成，进而引发心脑血管疾病。
因此，准确评估血液凝固功能对于疾病预防和治疗至关重要。
二、血凝实验血凝实验是一种常用的临床实验方法，用于评估血液的凝固功能。
该实验主要通过测量血液在一定时间内凝固的程度来获得结果。
常见的血凝实验包括凝血酶原时间（PT）、活化部分凝血活酶时间（APTT）、血小板计数和纤维蛋白原测定等。
1. 凝血酶原时间（PT）凝血酶原时间是评估外源凝血系统的功能的指标。
该实验通过观察血浆中凝血酶原转化为凝血酶所需的时间来测定。
正常情况下，PT 的时间范围为11-13秒。
若PT延长，则可能存在凝血因子活性降低或凝血因子缺乏的情况。
2. 活化部分凝血活酶时间（APTT）活化部分凝血活酶时间是评估内源凝血系统的功能的指标。
该实验通过观察血浆中凝血酶形成所需的时间来测定。
正常情况下，APTT 的时间范围为25-35秒。
若APTT延长，则可能存在凝血因子活性降低或凝血因子缺乏的情况。
3. 血小板计数血小板计数是评估血小板功能的指标。
血小板是血液中的细小细胞片段，主要参与血液凝固过程。
正常情况下，血小板计数在150-450×10^9/L之间。
若血小板计数过低，则可能导致出血倾向。
4. 纤维蛋白原测定纤维蛋白原是血液凝固过程中的重要物质，参与形成纤维蛋白凝块。
纤维蛋白原测定可以评估纤维蛋白原的含量。
正常情况下，纤维蛋白原的浓度在2-4 g/L之间。
若纤维蛋白原浓度过低，则可能导致凝血功能异常。
三、血凝抑制实验血凝抑制实验是一种检测血液凝固抑制功能的方法。
该实验主要评估抗凝血酶、抗纤维蛋白聚合酶等物质对血液凝固过程的抑制作用。
1. 抗凝血酶实验抗凝血酶是一种重要的抗凝物质，可以抑制凝血酶的活性。
抗凝血酶实验通过测定血浆中抗凝血酶的活性来评估抗凝血酶功能。
血凝和血凝抑制实验
实验三血凝和血凝抑制实验一、实验目的与要求掌握血凝和血凝抑制实验操作及应用二、实验内容H5亚型猪流感抗体检测与分析三、实验步骤（一）血凝（HA）试验1、用微量移液枪在微量反应板的第一排1-12孔均加入50μLPBS，换枪头；2、吸取50μL抗原，加入第一孔，反复吹打5次混匀；3、从第一孔吸取50μL加入第二孔，吹打混匀吸取50μL加入第三孔，如此稀释至第11孔，从第11孔吸取50μL丢弃，第12孔作为红细胞对照；4、各孔均加入50μL0.5%鸡红细胞悬液（已充分摇匀）；5、轻轻混匀，室温25℃静置20min观察结果；（二）血凝抑制（HI）试验1、血清样品处理：先加150μL胰酶溶液于300μL血清中，56℃水浴灭活30min 后冷却至室温；加900μL高碘酸钾，混合，室温孵育15min；加900μL丙三醇盐溶液，混合，室温孵育15min；加750μL生理盐水混合，4℃保存；2、根据HA试验中测定的HI抗原效价配制4单位抗原；3、在微量反应板第5-8排的2-11孔加入25μLPBS，第12孔加入50μLPBS；4、吸取50μL血清（编号为2-4血清、阳性血清、编号为1-4血清、阴性血清）加入第1孔，混匀后吸取25μL于第二孔，混匀后吸25μL于第三孔，依次稀释至第11孔，第11孔混匀后弃去25μL；5、各排前11孔均加入4单位抗原25μL，第12孔作为红细胞对照，室温下25℃静置30min；6、各孔均加入50μL0.5%的鸡红细胞悬液混匀，轻轻摇匀，室温下25℃静置30min。
四、实验结果及分析血凝（HA）试验，从第三个孔开始显示“滴泪”第一排为阳性对照第二排为阴性对照第三排，血清5-6第四排，血清6-6参考文献[1]GB/T 27535-2011，猪流感HI抗体检测方法[S].。
血凝和血凝抑制试验
3. 4.
பைடு நூலகம்
0.85%生理盐水。 生理盐水。 生理盐水 被检血清，采自被检鸡的健康血清。 被检血清，采自被检鸡的健康血清。
四、操作步骤
（一）血凝试验（HA） 血凝试验（ ）
1. 在血凝板第一排的 在血凝板第一排的1~12孔加入 孔加入50µl生理盐水。 生理盐水。 孔加入 生理盐水 2. 在第1孔中加入 病毒抗原， 在第 孔中加入50µl病毒抗原，反复吸取混匀 孔中加入 病毒抗原 后吸50µl到第 孔，如此倍比稀释直到第 孔， 到第2孔 如此倍比稀释直到第10孔 倍比稀释直到第 后吸 到第 混匀后弃50µl； 最后两孔 （ 11、 12） 为红细 ； 最后两孔（ 、 ） 混匀后弃 胞对照。 胞对照。
25 25 25 50
25 25 25 50
25 25 25 50
25 25 25 50
25
弃 50µl /
50 / / 50
25 50
注： 11孔为病毒对照 应该完全凝集， 12孔为细胞对照 孔为病毒对照， 孔为细胞对照， 1) 第 11 孔为病毒对照 ， 应该完全凝集 ， 第 12 孔为细胞对照 ， 应该完全沉积到孔底，只有当对照成立时试验结果方有效。 应该完全沉积到孔底 ， 只有当对照成立时试验结果方有效。 以红细胞100 凝集的稀释度为判定终点。 100% 2) 以红细胞 100% 凝集的稀释度为判定终点 。 血凝抑制滴度大 于等于1 为阳性，小于1 为阴性，等于2 为可疑。 于等于1：24为阳性，小于1：22为阴性，等于23为可疑。
病毒血凝素与完整成熟的病毒颗粒易于分开， 2 ） 病毒血凝素与完整成熟的病毒颗粒易于分开 ， 血凝素呈游离状态，例如天花 牛痘、 天花、 血凝素呈游离状态，例如天花、牛痘、鼠痘等 病毒，它们的凝集现象是可逆的。 病毒，它们的凝集现象是可逆的。 3 ） 脑炎病毒 、 口蹄疫病毒等 ， 凝集红细胞的条 脑炎病毒、 口蹄疫病毒等， 件很严格，对红细胞的种类有很严格的选择， 件很严格，对红细胞的种类有很严格的选择， 同时还要掌握反应的pH和温度等。 同时还要掌握反应的pH和温度等。 pH和温度等
血凝与血凝抑制试验
动物生产 632023.1出栏的时间一般在24月龄左右，体重达到600公斤以上就要及时出栏进行屠宰。
屠宰过程中要放血完全，胴体要在0～4℃室温条件下进行排酸，然后进行分割。
高档牛肉要严格按照程序进行分割，胴体能分割出规定的数量与高质量的高档牛肉块。
一般分为高档的红肉和高档的大理石花纹肉，它们的市场价格比较高，使养殖户的经济效益有很大的提高。
作者简介:李晓辉(1983-)，男，硕士，兽医师。
研究方向：畜牧生产技术。
尚丽娟(1982-),女,硕士,高级畜牧师。
研究方向：畜牧生产技术。
血凝与血凝抑制试验高 波（瓦房店市动物疫病预防控制中心，辽宁 瓦房店 116300）HA是血凝试验，HI是血凝抑制试验。
HI试验广泛应用于各大养殖禽基地检测禽流感病毒各亚型抗体。
做好此试验对提高养殖业生产、增加经济效益有决定性的作用。
2022年7月20日，接到盲样比对任务，共6份样品，试验具体操作步骤如下。
1 PPS的制作PPS磷酸盐缓冲剂一袋加入两升的纯化水，之后制好待用，pH7.2。
2 红细胞的配制采集单位内4只无禽流感和新城疫等抗体的健康公鸡血液与等体积阿氏液混合均匀，用pH7.2，0.01摩尔/升的PPS洗涤，每次用2000转离心5分钟，取出后用吸管吸出上清液弃去，再加入工作用PPS，这样洗涤3次，最后一次吸出上清液后要把红细胞表面的少量白细胞吸出弃掉。
洗涤后用一毫升的红细胞配99毫升的PPS配制成工作用的红细胞悬液，4℃保存备用。
3 血凝HA试验操作方法 在90℃微量反应板中，每孔加入0.025毫升PPS。
第一孔加入0.025毫升抗原依次做0.025毫升的对被稀释至第11孔。
每孔加入0.025毫升PPS。
每孔加入0.025毫升红细胞悬液。
将反应板在振荡器上振荡1～2分钟，混合反应物在室温23℃静置30分钟后，观察结果。
将反应板倾斜60°观察红细胞流淌状态，完全无眼泪样流淌的最高稀释倍数为血凝效价。
血凝(HA)和血凝抑制试验(HI)
B
11
2、HI试验可用于发病禽群的诊断
鸡、鸭、鹅规模化养殖中虽进行相关疫病疫苗的免疫，但往往有部分家 禽由于各种原因免疫力水平达不到要求，因而造成某些传染病的流行。 由于免疫禽群发病时临床症状和病变不典型，给确诊带来困难。采用HI 试验对鸡群中禽流感、新城疫等抗体进行测定，依据抗体滴度的高低和 离散性有助于诊断。 例如：经新城疫活苗加灭活苗免疫过的鸡群，新城疫抗体水平平均为 7Log2～8Log2，最高为10Log2。而新城疫感染鸡群中HI抗体部分高 达11Log2～13Log2；就抗体分布而言，鸡新城疫免疫鸡群抗体水平呈 正态分布，HI抗体在10Log2以上者仅占10％以下，4Log2以下者在1 ％以下。而感染了新城疫强毒并出现发病的鸡群，HI抗体中10Log2以 上者占25％以上，而4oLg2以下者在10％～30％之间。因此，依据禽 群的抗体水平高低和分布，结合临床症状和病、死鸡的剖检变化，可诊 断禽群是否患有新城疫或禽流感等。
2.1采血 用注射器吸取阿氏液约1mL，取至少2只SPF鸡（如果没有SPF鸡， 可用常规试验证明体内无禽流感和新城疫抗体的鸡），采血约2～4mL，与 阿氏液混合，放入装10mL阿氏液的离心管中混匀。 2.2 洗涤鸡红细胞 将离心管中的血液经1500～1800 r/min 离心8分钟，弃 上清液，沉淀物加入阿氏液，轻轻混合，再经1500～1800 r/min离心8分 钟，用吸管移去上清液及沉淀红细胞上层的白细胞薄膜，再重复2次以上过 程后，加入阿氏液20 mL，轻轻混合成红细胞悬液，4℃保存备用，不超过 5天。 2.3 10%鸡红细胞悬液 取阿氏液保存不超过5天的红细胞，在锥形刻度离 心管中离心1500～1800 r/min 8分钟，弃去上清液，准确观察刻度离心管 中红细胞体积(mL)，加入9倍体积(mL)的PBS，用吸管反复吹吸使PBS与红 细胞混合均匀。 2.4 1%鸡红细胞液 取混合均匀的10%鸡红细胞悬液1 mL，加入9 mLPBS， 混合均匀即可。
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实验原理
血凝及血凝抑制实验
流感病毒结构模式图
血凝素（HA） 柱状
血凝及血凝抑制实验
刺突：亚型特异性抗原，易变异
血凝素（HA，从H1—H15):呈柱状 功能：
①吸附细胞：与细胞上受体结合,使病毒 侵入细胞
②凝集多种动物的红细胞（血凝试验） ③具抗原性：其抗体能中和病毒---中和抗体
• 测定孔 RBC沉于孔底中心，呈纽扣状。(+)
凝集
（-）
• 病毒对照孔：凝集
• RBC对照孔：无自凝
• 血凝抑制试验效价：呈完全血凝抑制使的最高血
清稀释度。
血凝及血凝抑制实验
血凝及血凝抑制实验
• 思考题 1、病毒凝集红细胞是不是一种特异的抗原体反
应？为什么？ 2、血凝抑制实验是不是特异的抗原抗体反应?
25 25 25 25 25 25
25 25 25 25 25 25
++ +
-
-
++++ _
孔号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 HI 11(+) 12（-)
稀释度 2 4 8
16 32 64 128 256 、、 、、 弃
生理盐 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 X
血凝及血凝抑制实验
血凝及血凝抑制实验
• 3.在1-12孔内均加入“四价”血凝素25ul，震荡 后，室温静止作用5min。
• 4.在1-12 孔内均加入1%的鸡红细胞悬液25ul，震 荡，室温感作15-30min，每5min观察一次结果。
• 5.观测结果，记录实验数据．
血凝及血凝抑制实验
血凝抑制试验结果判定
血凝及血凝抑制实验
血凝及血凝抑制实验
• 3.在1-12孔均加入25ul的生理盐水。 • 4.在每孔内加入25ul1%的鸡红细胞悬液，震荡，
室温静止感作15-30min，每5min观察一次结果。 • 5.计算血凝效价，稀释使成为四价备用．
血凝及血凝抑制实验
血凝试验结果判定
• 效价判定： 凝集特别显著：“＋＋＋＋” 凝集现象次之：“＋＋＋” 凝集清楚可见：“＋＋” 稍显凝集者：“＋”
血凝及血凝抑制实验
实验步骤
1.取96孔V型反应板1块置于水平实验台上，在第1排 1-10孔内加入25ul生理盐水，第11孔不加。第12孔加 25ul生理盐水 2.在第1孔内加入血凝素25ul，混匀后吸出25ul加入第 2孔内，再混匀后吸出25ul加入第3孔内，依次类推至 第10孔时弃掉25ul。第12孔不加作阴性对照孔。
血凝抑制
1.取96孔V型反应板1块置于水平实验台上，在第1排110孔内加入25ul生理盐水，第11孔不加。第12孔加25ul 生理盐水。 2.在第1孔内加入被检血清25ul，混匀后吸出25ul加入 第2孔内，再混匀后吸出25ul加入第3孔内，依次类推至 第10孔时弃掉25ul。第12孔不加作阴性对照孔。
生理盐水 25 25 25 25 25 25 1%鸡红 25 25 25 25 25 25
细胞 结果预测 ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ +++
7 8 9 10 H 11(+) 12（-)
128 256 、、 、、 弃
A
25 25 25 25 x
25
25 25 25 25 25血 x 凝素
25
待检血 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 x 清
4HA血凝 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25
素
1%鸡红 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25
细胞
血凝及血凝抑制实验
结果预测 -
--
-
-
++ +++ +++ +++ +++ -
为什么？ 3、血凝试验中为什么要加补充液？ 4、为什么加病毒液和红细胞悬液时要反向加？ 5、血凝试验和血凝抑制试验中空白对照的意义？
血凝及血凝抑制实验
孔号 1 2 3 4 5 6
稀释度 2 4 8
16 32 64
生理盐 25 25 25 25 25 25 血凝素 25 25 25 25 25 25
• 血凝效价：呈“＋＋”凝集时的最高稀释 度。此时的稀释度即为1个血凝单位。
血凝及血凝抑制实验
结果判定
1.在各组对照均正确的情况下，按下列标准判定
血凝反应强度示意图 “4＋” 红细胞呈片状凝集，均匀布满孔底，边缘有时不整齐或皱 缩。 “3＋” 红细胞呈片状凝集，但面积略小于“4+”。 “2＋” 红细胞呈片状凝集，但有少许沉积孔底中部呈小圆点状。 “＋” 红细胞大部分沉于孔底中央，周围有少量散在凝集颗粒。 “－” 红细胞均沉于孔底呈小圆点状，边缘整齐。 2.对照孔正常的情况下，红细胞凝集100%的稀释度为判定血凝价的 终点。凡能使鸡红细胞完全血凝凝集及血的凝抑病制实毒验最高稀释倍数为病毒的凝集 价。
血凝原理
血凝抑制原理
血凝及血凝抑制实验
血凝抑制试验原理
病毒引起的血凝现象能被相应的抗血凝素抗体所 抑制，即抗体与病毒结合后，血凝素无法吸附于 红细胞表面的受体上，用免疫血清阻止红细胞凝 集的现象，称为血凝抑制．
血凝及血凝抑制实验
实验材料
器材：U型或V型微量反应板、微量移液器、枪头 试剂：1%鸡红细胞、NDIV血凝素、NDIV抗血清、生 理盐水
实验二 血凝血凝试验：滴定病毒的血凝效价(病毒的凝集价)， 采用一定的病毒量，通常采用4个血凝单位。
２血凝抑制试验： 应用标准病毒液测定血清中的相应抗体或应用特 异性抗体鉴定新分离的血凝性病毒．
３检测实验用鸡群有无病毒感染和监测鸡的免疫状 态。
４ 掌握基本操作技术,了解其实用价值 ．
抑制血凝（血凝抑制试验）
血凝及血凝抑制实验
血凝试验原理
• 血凝素（hemagglutinin HA）：由病毒基因 编码的糖蛋白刺突。
• 与病毒吸附和传入宿主细胞有关。 • HA能与人或其它动物多种红细胞表面N－
乙酰神经氨酸酶受体结合引起红细胞凝集。 • 为病毒的 红细胞凝集反应或血凝反应。
血凝及血凝抑制实验
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