变性蛋白的复性

2、含有二硫键的蛋白的复性
复性时涉及正确二硫键（分子内或 者分子间）的重建。
①空气氧化法②加入氧化剂-还原转 换试剂 ③加入氧化型谷胱甘肽④使用 还原剂保护巯基⑤加入二硫苏糖醇。
3、封闭蛋白的疏水簇促进复性
对蛋白质结构和序列的分析，确定 出在蛋白中可能引起分子间相互作用的 疏水簇。用特异性结合疏水簇的单克隆 抗体来封闭疏水簇，减少分子间结合引 起的聚集。
包含体的组成与特性： 一般含有50%以上的重组蛋白，其余为
核糖体元件、RNA聚合酶、外膜蛋白 ompC、ompF和ompA等，环状或缺口的 质粒DNA，以及脂体、脂多糖等，大小为 0.5-1um，无定形，难溶与水，只溶于变 性剂如尿素、盐酸胍等。
二、包含体的分离和溶解
1、包含体的分离 收集重组菌，破碎细胞；离心除上清；使
⒈ 液态保存 （1）低温保存：液态蛋白质样品在-10到-20°C
以下冰冻保存。
（2）在稳定pH条件下保存：蛋白质较稳定的pH 一般在等电点，且多数蛋白质只有在很窄的pH 范围 内才稳定。因此对保存液态蛋白质样品时小心调到 其稳定的pH 范围内。
⒈ 液态保存
（3）高浓度保存：一般蛋白质在高浓度时 比较稳定，因为液态蛋白质容易受水化作用 的影响，浓度太低易引起亚基解离和表面变 性。
在重复生产发酵中，工程菌表达稳定； 始终能排除外源微生物污染。
生产用细胞库：生产基因工程产品应有种子批系 统，并证明种子批不含有致癌因子，无细菌、病 毒、真菌和支原体等污染，并由原始种子批建立 生产用工作细胞库。
原始种子批须确证克隆基因DNA序列，详细叙 述种子批来源、方式、保存及预计使用期，保存 与复苏时宿主载体表达系统的稳定性。
复性缓冲液的pH要远离等电点； 离子强度不易过高，10-50mmol/L， 离子强度太高蛋白质易发生沉淀，也不 利于离子交换层析的分离；复性液温度 不易过高在4℃-10℃较合适，对于耐热 蛋白也可以室温复性；复性时间，以天 然表达的重组蛋白复性应在6hr以上。
蛋白质的复性是重组蛋白纯化中最 关键和最复杂的问题。蛋白质的性质不 同，所处的环境不同，使其复性条件大 不相同。任何一个蛋白质都有一个最佳 的复性条件，只有选择到了合适的复性 缓冲液，使蛋白得以正确折叠，才能使 进一步的层析分离得以顺利完成。
宿主细胞蛋白
免疫分析、SD-PAGE、CE
其他蛋白杂质（如培养基）
SDS-PAGE、HPLC、CE、免疫分析
残余DNA
DNA杂交、紫外光谱、蛋白结合
蛋白变异
肽谱、HPLC、IEF、CE
甲酰基甲硫氨酸
肽谱、HPLC、IEF、CE
甲硫氨酸氧化
肽谱、氨基酸分析、HPLC、质谱、Edman分析
产物变性或聚合脱氨基
ELISA,Immunoblotting • 受体结合实验（ Receptor Binding） • 各种高效液相分析法（HPLC） • 肽图分析法 • Edman N 末端序列分析法 • 圆二色谱（CD） • NMR
1.生物活性测定：需要动物体内实验和通过细 胞培养进行体外效价测定。 体内生物学活性的测定要根据目的产物的生 物学特性建立适合的生物学模型，体外生物 活性测定有细胞计数法等。 重组蛋白质是一种抗原，可用放射免疫分析 法或酶标法测定其免疫学活性。
重组蛋白质的浓度测定：凯氏定氮法、双缩脲 法、染料结合比色法、福林-酚法和紫外光 谱法。
相对分子量测定：凝பைடு நூலகம்过滤法（完整）和 SDS-PAGE法（亚基）。
杂质检验：包括蛋白质和非蛋白质杂质。 蛋白类：宿主细胞蛋白，采用免疫方法和 电泳相结合； 非蛋白类：病毒、细菌等微生物、热源质、 内毒素、致敏原及DNA。利用微生物学方 法检测无菌。热源质检测用家兔注射。
对生产种子，应详细叙述细胞生长与 产品生成的方法和材料，并控制微生物 污染；提供培养生产浓度与产量恒定性 数据，依据宿主细胞-载体系统稳定性， 确定最高允许传种代数；
培养过程：在培养过程中，应测定被表达基因分 子的完整性及宿主细胞长期培养后的基因型特征； 宿主细胞-载体稳定性与产品恒定性，规定持续培 养时间，并定期评价细胞系统和产品。
稳定性考察：是评价药品有效性和安全性的 重要指标，也是确定药品储藏条件和使用期 限的主要依据。对温度、氧化、光照、离子 浓度和机械剪切等环境因素都很敏感。
产品一致性保证：生产周期长，影响因素多， 必须对每一步都进行严格的控制。
基因工程产物中常见杂质和污染物及其检测方法
杂质和污染物
检测方法
内毒素
鲎试剂、家兔热源法
６．加20％PEG4000至终浓度为0.2％，加50mM的 氧化型谷胱甘肽至终浓度为１mM,加100mM的还原 型谷胱甘肽至终浓度为２mM,静置30min至２h（亦 可４℃复性过夜）。 ７. 以PBS（pH8.0)或TE（pH8.0)透析，取出-20℃保 存备用。
8 .检验复性是否成功。 Buffer A配方：
培养周期结束时，应监测宿主细胞-载体系统的特 性，如质粒拷贝数、宿主细胞中表达载体存留程度， 含插入基因载体的酶切图谱等。
四、纯化过程的质量控制
产品要有足够的生理和生物学试验数据， 确证提纯物分子批间保持一致性；外源蛋白 质、DNA与热源质控制在规定限度以下。
在精制过程中能清除宿主细胞蛋白质、核 酸、糖类、病毒、培养基成分及精制工序本 身引入的化学物质，并有检测方法。
用变性剂洗涤沉淀。 2、包含体的溶解
打断包含体蛋白分子内和分子间的各种化 学键，使多肽链伸展。
溶解采用强的变性剂，如脲、盐酸胍 或硫氰酸盐，SDS，各种溶解方法都各 有利弊。
含有半胱氨酸的蛋白质，需要加入还 原剂巯基乙醇、二硫苏糖醇等。
加入金属螯合剂EDTA去除金属离子。
三、包含体蛋白复性方法
几个 要求： ➢活性蛋白的回收率高 ➢正确的复性的产物易于与错误的折叠
1．PBS或生理盐水洗涤菌体，Buffer A重悬菌体， 超声波破碎至清亮。 ２．4℃ ，10000rpm离心10min，弃上清。 ３．用PBS或生理盐水洗涤沉淀2-3次。 ４．往沉淀中加 Buffer A及20％的SKL（十二烷基 肌氨酸钠）贮存液，剧烈搅动，使其缓慢溶解，室 温静置30min至２h。 ５．4℃，10000rpm离心10min，取上清。
3、对宿主毒性小：生产那些处于天然 构象对宿主细胞有毒害的蛋白有优势。
一、包含体形成的原因
➢主要是高水平表达的结果。 ➢在高水平表达时，新生肽链的聚集速率超过
蛋白的正确折叠的速率就会导致包含体的形 成。 ➢重组蛋白在大肠杆菌中表达时，缺乏一些蛋 白折叠过程中需要的酶和辅助因子，如折叠 酶和分子伴侣等。
一、医药生物技术产品质量保证的 一般性要点
1、产品安全性评价 2、产品本身的结构 3、严格控制条件
二、生物材料的质量控制
原材料的质量控制是确保编码药品的 DNA序列的正确性，重组微生物来自单一 克隆，所用质粒纯而稳定，以保证产品质 量的安全性和一致性。包括对目的基因、 表达载体、宿主细胞的检查。
主要内容： ➢ 基因工程制药的基本过程。 ➢ 目的基因的获得及基因的表达。 ➢ 基因工程菌的生长代谢特点，其质粒不稳定产生的
原因及提高质粒稳定性的方法。 ➢ 基因工程菌的培养方式，发酵工艺及培养设备。 ➢ 高密度发酵 ➢ 基因工程药物的分离纯化。 ➢ 变性蛋白的复性 ➢ 基因工程药物的质量控制。
五、目标产品的质量控制
基因工程药物的质量控制主要包括以下几 项要求:产品的鉴别、纯度、活性、安全性、 稳定性和一致性。
它需要利用生物化学、免疫学、微生物学、 细胞生物学和分子生物学等多学科的理论与技 术所建立的鉴定方法。
• • 重组蛋白质药物产品常用的鉴别方法 • 电泳方法： SDS-PAGE,等电聚焦， 免疫电泳 • 免疫学方法：RIA, RID，
• 效价测定必须采用国际上通用的方法，测 定结果须用国际或国家标准品进行校正， 以国际单位表示或折算成国际单位标准。
• 蛋白的比活性是每毫克蛋白质的生物学活 性，是重组蛋白质的一项重要指标，不仅 是含量指标，也是纯度指标。
2.理化性质鉴定
肽图分析：用酶法和化学方法降解目的蛋白， 对生成的肽段进行分离分析，是检测蛋白质 一级结构中细微变化的最有效方法。灵敏、 高效。高效液相色谱和毛细管电泳。 氨基酸成分分析：小于50个氨基酸分析结果 较可靠。 部分氨基酸序列分析：氨基端15个氨基酸。
SDS-PAGE、凝胶排阻色谱、IEF、HPLC、CE
Edman分析、CE
单克隆抗体（亲和配基脱落） SDS-PAGE、免疫分析
氨基酸取代
氨基酸分析、肽谱、CE、Edman分析、质谱
微生物（细菌、酵母、真菌） 微生物学检查
支原体
微生物学检查
病毒
微生物学检查
六、产品的保存
防止变性，降解，保护其活性中心。
⒋须阐明载体引入宿主细胞的方法及载体在 宿主细胞与载体结合后的遗传稳定性；
⒌提供插入基因与表达载体两侧端控制区内 的核苷酸序列，详细叙述在生产过程中启 动与控制基因在宿主细胞中表达的方法及 水平等。
三、培养过程的质量控制
在工程菌的贮存中，要求种子克隆纯而稳 定；
在培养过程中，要求工程菌所含的质粒稳 定，始终无突变；
Tris-base 50mM,EDTA 0.5mM,NaCl 50mM, 甘油5% ,DTT 5mM
第十二节 基因工程药物的质量控制
是利用活细胞作为表达系统，产 物的分子量较大，并有复杂的结构， 还参与生理功能的调节，用量极微， 任何质和量的偏差都可贻误病情造成 严重危害。
宿主细胞中表达的外源基因，在转 录翻译精制工艺放大过程中都可能发 生变化，故从原料以及制备全过程都 必须严格控制条件和鉴定质量。
根据质量控制要求应了解以下特性:
⒈目的基因：明确目的基因的来源、克 隆经过，并以限制性内切酶酶切图谱 和核苷酸序列予以确证；