生物化学实验报告

生物化学实验报告

动物营养研究所

张树润

2015.10.12

猪血中超氧化物歧化酶（SOD）的分离纯化及活性测定一．实验目地

1.通过实验了解活性物质的分离提取。

2.了解超氧化物歧化酶的基本功能与应用。

二．实验原理

超氧化物歧化酶是一种酸性蛋白，是唯一以自由基为底物

的酶，具有清除自由基的功能酶，在酶分子上共价连接金属辅

基，因此它对热、PH、以及某些理化性质表现出异常的稳定性。

该酶首次从牛红细胞中分离得到，是一种蓝色含铜蛋白，之后，

研究发现该蛋白酶具有催化氧发生歧化反应的能力，因此将其

命名为超氧化物歧化酶1-2。超氧化物歧化酶是一种能专一地清

除超氧离子自由基（O2-）的金属酶，它具有抗衰老、抗辐射、

抗炎抗癌等作用，因而在医药（如关节炎、红斑狼疮等疾病的

治疗3）、化妆品(有防晒抗炎效果4)、食品工业（SOD灵芝菌5

等）等方面具有了广泛的应用前景。

超氧化物歧化酶是广泛存在于生物体内的一种金属酶, 可

催化超氧阴离子自由基(O2-)与H+发生歧化反应, 生成H2O2和

O2。SOD催化下述反应：2H++2O2-→H2O2+O2。

超氧化物歧化酶按照它所含金属离子的不同，可分为

Cu-Zn-SOD、Mn-SOD、Fe-SOD等三种。Cu-Zn-SOD为二聚体，

呈蓝绿色；Mn-SOD呈紫红色；Fe-SOD呈黄褐色。

SOD提取、纯化制备方法各异, 常用方法有经典的溶剂沉淀法、盐析法、超滤法和层析法等6-7。本实验采用有机溶剂沉淀法8以新鲜猪血为原料，从中提取SOD并进行纯化。酶活力测定可用以下方法：邻苯三酚自氧化法9、黄嘌呤氧化酶法、NBT光还原法、化学发光法、肾上腺素自氧化法、亚硝酸法等。

该实验SOD酶活性采用邻苯三酚自氧化法测定，酶活性单

位定义为：每毫升反应液中，每分钟抑制邻苯三酚自氧化速率

达50%的酶量定义为一个酶单位。

样品中蛋白质含量用考马斯亮蓝G-250法测定。考马斯亮

蓝G-250在游离状态下呈红色，与蛋白质结合呈现蓝色。在一

定范围内，溶液在595nm波长下的光密度与蛋白质含量成正比，

可用比色法测定，测定范围1-1000μg。

三．实验试剂与器材

1.实验试剂

ACD抗凝剂、0.9%Nacl、丙酮、95%乙醇、氯仿、考马斯亮蓝

G-250、50mmol/L pH8.3磷酸缓冲液、10mmol/L EDTA钠盐溶

液、3mmol/L邻苯三酚溶液等

2.实验器材

紫外光分光光度计、可见光分光光度计、分析天平、具塞试管、刻度吸管、离心机、烧杯、移液枪、试管架、EP管等。四．实验方法

1.SOD的提取

[1]取新鲜猪血20ml于50ml离心管，4000r/min，10min离心，去上层血浆，取下层红血球粘稠液量其体积，然后加入2倍体积的0.9%NaCl溶液清洗，4000r/min，10min离心，弃上层清液，再加入2倍体积的0.9%NaCl溶液重复清洗一次，4000r/min，10min离心，得洗净的红血球粘稠液。

[2]向洗净的红血球中加入等体积的蒸馏水，剧烈搅拌30min，使其充分溶血。再向溶血液中缓慢加入预冷的0.35倍体积的95%乙醇溶液和0.15倍体积的氯仿，匀浆呈暗红色，再继续搅拌15min，4000r/min，10min离心，去变性蛋白沉淀物，得上层液，量其体积即为除血蛋白上清体积，留样500ul（样1）。将上层液用2层纱布进行过滤除去脂肪物质，然后将清液在65-70℃恒温水浴中进行热处理，15min后取出迅速冷却到室温，4000r/min，5min离心除去沉淀，得浅黄色粗酶液，量其体积即为热变性后上清体积，留样200ul（样2）。

[3]向粗酶液中加入等体积的丙酮溶液，冰箱静置4小时，4000r/min，10min，弃上清液，得沉淀。将沉淀物用等体积预冷的丙酮溶液清洗两次，离心收集沉淀，自然干燥即得淡绿色成品，按1mg/ml溶于蒸馏水，为丙酮沉淀后体积，备用（样3）。

2.SOD活力测定

[1] 邻苯三酚自氧化率的测定

取4.5 ml 50 mmol/L pH8.3的磷酸缓冲液，4.2 ml蒸馏水和1 ml 10 mmol/LEDTA-Na2溶液，混匀后在25℃水浴保温20 min，取出后立即加入25℃预热过的邻苯三酚溶液0.3 ml，迅速摇匀，倒入光径1 cm的比色杯内，用10 mmol/L HCl作空白，325 nm 波长下每隔30 s记录光吸收值一次，整个操作在4 min内完成，计算出每分钟A325的增值，此即为邻苯三酚自氧化率。要求自氧化速率引起的吸光值变化控制在0.070/min左右。

[2] 酶活力测定

样1、样2及样3中SOD酶活力测定操作与[1]基本一致，加入邻苯三酚前，先加入20µl SOD样液，蒸馏水则减少相应的体积，同理测其光吸收值，计算加酶后邻苯三酚自氧化率。[3]酶活性单位计算

根据酶活性单位的定义，按下列公式计算酶活性：

单位活性（U/ml）= ×反应液总体积数×

其中，A o为邻苯三酚自氧化率；A m加酶后邻苯三酚自氧化率。

总活性(U)＝单位活性×酶原液总体积

[4]蛋白质含量测定（考马斯亮蓝G-250法）

⑴标准曲线的制作：取6支具塞试管，编号，按下表加入试剂：

试剂管号

1 2 3 4 5 6 蛋白质标准液（ml）0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 蒸馏水（ml） 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 考马斯亮蓝G-250(ml) 5 5 5 5 5 5 蛋白质含量(µg) 0 20 40 60 80 100

盖上塞子，摇匀。注意各管振荡程度尽量一致。在595nm波长

下比色测定光吸收值，比色应在1小时内完成。以牛血清白蛋白含量（ug）为横座标，光吸收值为纵坐标，绘出标准曲线。

⑵样品中蛋白含量的测定

将待测的SOD溶解并稀释到一定浓度，取3支试管，分别加入20μl、50μl、100μl的样1、样2和样3，再分别加入980μl、950μl和900μl蒸馏水，3支试管中都加入5ml考马斯亮蓝G-250试剂，其余操作与标准曲线制作相同。

⑶蛋白质含量计算

根据所测样品提取液的光吸收值，在标准曲线上查得相应

的蛋白质含量(µg)，计算其浓度。

[5] 结果处理

利用考马斯亮蓝G-250法测定每毫升酶原液蛋白质毫克数。比活力（U/mg）=单位活力（U/ml）/单位蛋白质浓度（mg/ml）=总活力（U）/总蛋白质（mg）

将测得的数据或计算结果填入下表：