胎鼠肺成纤维细胞的培养方法007
大鼠肺成纤维细胞使用说明
大鼠肺成纤维细胞编号名称规格北京派瑞金GK1006大鼠肺成纤维细胞5×105cells/瓶为能尽快开展实验，派瑞金发货的原代细胞均处于对数生长期，且每次发货为汇合率达到70%的细胞，收到细胞后即可开展实验。
派瑞金提供的大鼠肺成纤维细胞取自新鲜的组织，按照标准操作流程分离培养。
研发的大鼠肺成纤维细胞完全培养基能提供细胞最佳的生长条件，降低杂细胞污染，保证不同批次间细胞质量的稳定。
同时，派瑞金还建立了严格的细胞鉴定流程，所提供的原代细胞均需经过细胞类型特异性标记物、细胞形态学等检测，保证细胞纯度在90%以上；同时也需经过微生物检测，保证不含有HIV、HBV、HCV、支原体、真菌及其他类型的细菌。
大鼠肺成纤维细胞简介:1、名称：大鼠肺成纤维细胞（Rat Lung Fibroblasts Cells）2、组织来源：SD大鼠肺组织3、规格：5×105cells/25cm2培养瓶4、细胞简介：大鼠肺成纤维细胞分离自SD大鼠肺组织，多呈长梭形，具有突起，细胞胞体较大，胞质弱嗜碱性，胞核较大呈椭圆形，染色质疏松色浅，核仁明显。
刚分离的肺成纤维细胞呈圆形，较亮，培养40min左右贴壁，12～24h左右伸展，36～48h进入对数生长期，分离纯化3d后接近融合，并彼此连接成网状。
肺成纤维细胞在生理条件下的主要功能包括：构造和维持肺器官的正常形态，合成和释放细胞外基质，以及组织损伤后及时大量聚集修复损伤组织。
本公司生产的大鼠肺成纤维细胞采用混合酶消化而来，细胞总量约为5×105cells/瓶，Fibronectin免疫荧光鉴定细胞纯度可达90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。
5、培养基信息：1）培养基类型：DMEM高糖2）添加因子：10%FBS、Penicillin、Streptomycin等大鼠肺成纤维细胞使用方法:收到细胞后，请按照以下方法进行操作。
mTORC1
mTORC1/2双重抑制剂OSI -027抑制高氧诱导的肺成纤维细胞增殖和分化*吴黎虹， 唐坤， 党红星△， 符跃强， 刘成军， 李静， 许峰（重庆医科大学附属儿童医院重症医学科，国家儿童健康与疾病临床医学研究中心，儿童发育疾病研究教育部重点实验室，儿科学重庆市重点实验室，重庆 400014）［摘要］ 目的：分析哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin ， mTOR ）复合物1/2（mTORcomplex 1/2， mTORC1/2）双重抑制剂OSI -027对高体积分数氧（高氧）所致人胚肺成纤维细胞增殖和分化的抑制作用。
方法：高氧（95% O 2）处理人胚肺成纤维细胞MRC -5建立增殖分化模型，分为对照组、高氧组、高氧+OSI -027组和高氧+雷帕霉素组。
Western blot 检测α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin ， α-SMA ）、I 型胶原蛋白（collagen type I ， Col I ）、增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen ， PCNA ）、细胞周期蛋白D1（cyclin D1）、RhoA 、Rho 相关含卷曲螺旋蛋白激酶1（Rho -associated coiled -coil -containing protein kinase 1， ROCK1）、蛋白激酶B （protein kinase B ， PKB/AKT ）、p -AKT 和mTOR 的表达； CCK -8实验检测细胞活力；流式细胞术检测细胞周期。
结果：与对照组相比，PCNA 、cyclin D1、Col I 和α-SMA 表达随高氧处理时间增加而增加（P <0.05）。
与高氧组相比，OSI -027及雷帕霉素干预后，细胞活力下降，细胞周期被抑制在G 1期（P <0.05）。
原代细胞培养操作(鼠胎组织细胞培养为
细胞冻存方法
• 1．预先配制冻存液：含20%血清培养基，10%DMSO， DMSO液用培养液配好，避免因临时配制产热而伤害细胞； • 2．取对数生长期细胞，经胰酶消化后，加入适量冻存液,
用吸管吹打制成细胞悬液（1×106 ～ 5 ×106细胞/ml)；
• 3．加入1ml细胞于冻存管中，密封后标记冷冻细胞名称和 冷冻日期。
慢冻程序
• 标准程序：
•
• • •
当温度在-25℃以上时， 1～2℃/min
当温度达-25℃以下时， 5～10℃/min 当温度达-100℃时，可迅速放入液氮中
• 简易程序：
将冷冻管（管口要朝上）放入纱布袋内，纱布袋系以线绳，通过 线绳将纱布袋固定于液氮罐罐口，按每分钟温度下降1～2℃的速度，
在40分钟内降至液氮表面，停30分钟后，直接投人液氮中。
• 将细胞悬液吸出2ml左右，加到另一个培养瓶中并向 每个瓶中分别加3ml左右培养液，盖好瓶塞，送回二 氧化碳培养箱中，继续进行培养
细胞计数： 1、将血球计数板及盖片擦拭干净，并将盖片盖在计数板上。 2、将细胞悬液吸出少许，滴加在盖片边缘，使悬液充满盖片和计
数板之间。
3、静置3分钟。 4、镜下观察，计算计数板四大格细胞总数，压线细胞只计左侧和
•
压力蒸汽消毒器：湿热消毒，用途广
•
•
电热干燥箱：干热消毒（160 ℃ ，2小时）。主要用干玻璃
器皿消毒
•
•
滤器：过滤除菌：大多数培养用液，如人工合成培养基、血清、
酶液等均采用滤过法除菌
• •
4）容积、深度、表面面积：培养液体积与表面面
积的比例为0.2-0.5ml/cm2。需高浓度氧的，在浅的培 养液（ 2mm ）中生长较好；需要低浓度氧的。在深的 培养液（5mm）中生长较好。
一种制备胎鼠成纤维细胞饲养层的简易方法
一种制备胎鼠成纤维细胞饲养层的简易方法
一种制备胎鼠成纤维细胞饲养层的简易方法
采用新的传代及MMC(Mytomycin-C,MMC)处理方法,以求简化繁琐的饲养层制备过程,对MEF(Mouse embryonic fibroblast, MEF)细胞采用胰酶消化(充分去除多余消化液)后直接接种的方法传代.MEF 细胞经MMC处理后,用PBS充分洗去MMC继续培养2～3h后做饲养层.结果表明:新的传代方法对MEF细胞的增殖及细胞形态无明显影响,新方法制备的饲养层具有促进ES细胞(Embryonic stem cell, ES)增殖以及抑制ES细胞分化的作用,而且得到了典型的ES细胞样集落,AKP 呈阳性.研究结论表明,采用新的细胞传代方法及饲养层制备方法有效地简化了饲养层的制备过程,缩短了饲养层的准备时间.
作者：杨恕玲单守明董雅娟Yang Shuling Shan Shouming Dong Yajuan 作者单位：杨恕玲,单守明,Yang Shuling,Shan Shouming(宁夏大学农学院,宁夏银川,750021)
董雅娟,Dong Yajuan(青岛农业大学,山东青岛,266109)
刊名：农业科学研究英文刊名：JOURNAL OF AGRICULTURAL SCIENCES 年，卷(期)：2009 30(3) 分类号：Q343.6 关键词：小鼠 MEF ES细胞分离培养。
肺成纤维细胞原代培养基本步骤
肺成纤维细胞原代培养基本步骤一、引言肺成纤维细胞是肺组织中的主要细胞类型之一，它们在肺部的结构和功能维持中起着关键作用。
原代培养是研究肺成纤维细胞生物学特性的重要手段之一。
本文将介绍肺成纤维细胞原代培养的基本步骤。
二、实验材料1. 无菌工具：无菌操作台、无菌吸管、无菌离心管等2. 细胞培养基：DMEM/F12（含10% FBS）、Penicillin/Streptomycin3. 消化液：Trypsin/EDTA4. 细胞收获液：PBS（含1% P/S）三、实验步骤1. 准备培养皿和培养液将DMEM/F12培养液加入到6孔板中，每孔加入2ml。
然后将板放入37℃恒温箱中预热。
2. 收集组织样本从小鼠或人体组织中收集需要的肺组织样本，并迅速转移到含有PBS （含1% P/S）的离心管中。
3. 组织消化将组织样本切碎成小块，然后加入2ml的Trypsin/EDTA消化液，放置于37℃恒温箱中消化30分钟。
4. 细胞分离将消化后的组织样本转移到无菌离心管中，用DMEM/F12培养液洗涤2次。
然后加入2ml的DMEM/F12培养液，在37℃恒温箱中振荡5分钟，使细胞分散均匀。
5. 细胞计数和接种用细胞计数板计数细胞数量，并将细胞接种到预热好的6孔板中。
每孔接种1×10^4个细胞。
6. 培养和观察将6孔板放入37℃恒温箱中培养，每天更换一次DMEM/F12培养液。
观察细胞生长情况，并在需要时进行下一步实验操作。
四、实验注意事项1. 手术器械、培养皿和培养液必须严格无菌。
2. 组织样本必须迅速转移至含有PBS（含1% P/S）的离心管中。
3. 消化时间不能过长，否则会对细胞产生不良影响。
4. 细胞接种密度要适当，过高或过低都会影响细胞生长。
5. 培养液必须每天更换一次，以保证细胞正常生长。
五、总结肺成纤维细胞原代培养是研究肺部生物学特性的重要手段。
本文介绍了肺成纤维细胞原代培养的基本步骤，包括准备培养皿和培养液、收集组织样本、组织消化、细胞分离、细胞计数和接种以及培养和观察等步骤。
小鼠成纤维细胞原代培养
实验-小鼠成纤维细胞的原代培养一、实验目的1.掌握哺乳动物细胞原代培养与传代培养中的取材、消化及无菌操作等基本实验技术与操作过程。
2.熟悉在倒置相差显微镜下观察培养细胞的形态与生长状况的方法。
3.了解细胞原代培养与传代培养的原理与方法。
二、实验原理自17世纪下半叶Robert Hooke提出“细胞”概念直至20世纪中叶,细胞培养(Cell culture)才逐渐发展起来。
现代生命科学以及相关领域的研究前提就是细胞的维持与增殖,因此,细胞培养不仅就是细胞生物学的密不可分的组成部分,而且已经成为生物化学、生物物理学、遗传学、免疫学、肿瘤学、生理学、分子生物学与神经科学、甚至临床医学的重要内容。
细胞培养也就是细胞生物学延伸至相关学科的一条主要途径。
如今,细胞培养已经成为生命科学与医学研究最常用的基础技术之一。
细胞培养就是模拟机体内生理条件,将细胞从机体中取出,在人工条件下,使其生存、生长、繁殖与传代,进行细胞生命过程、细胞癌变、细胞工程等问题的研究。
细胞培养的直接目的就是维持或扩增细胞数量。
依据取材于动物组织或培养细胞,细胞培养分为原代培养与传代培养。
1.原代培养(primary culture)就是从供体取得组织或细胞后在体外进行首次培养直至成功地进行首次传代之前的培养。
但实际上通常把第一代至第十代以内的培养细胞统称为原代细胞培养。
原代培养就是建立细胞系的第一步,其最基本的方法有两种:组织块培养法与消化培养法。
组织块培养法就是指直接从机体取下组织与器官,通过组织块直接长出单层细胞,该培养法就是最常用的原代培养方法,其将刚刚离体的、生长活力旺盛的组织剪成小块接种在培养瓶中作为实验材料,一天后细胞可从贴壁的组织块四周游出并生长。
组织块培养法操作过程简便、易行,培养的细胞较易存活,适用于一些来源有限、数量较少的组织的原代培养。
消化培养法利用酶或机械方法将组织分散成单个细胞后,在不加任何粘附剂的情况下,直接移植在培养瓶壁上,加入培养基立即进行培养的方法。
大鼠肺成纤维细胞原代提取及培养实验具体步骤及方法
大鼠肺成纤维细胞原代提取及培养实验具体步骤及方法将大鼠的肺成纤维细胞从机体中取出，经胰酶、螯合剂（常用EDTA）处理，分散成单细胞，置合适的生长培养基培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖。
一、实验材料准备1. 动物出生后1-4天的Wistar乳鼠1只。
2. 试剂PBS、培养液(Hyclone的低糖DMEM，含Hyclone的10%新生牛血清、100 U/ml 青链霉素、1%明胶PBS、0.25%胰酶(含EDTA，GIBCO)，碘酒和酒精绵球。
3. 器械眼科直剪2把、眼科弯剪2把、眼科直镊2把、眼科弯镊2把、玻璃平皿3套，25 cm2塑料培养瓶(Costar)。
二、具体操作1. 明胶包被培养瓶过夜(准备2-3个)，取出明胶，用2 ml培养液冲洗培养瓶一遍，置于超净台中。
2. 解剖取肺：将乳鼠在酒精中浸泡后取出，转移至超净台上的玻璃培养皿中，用碘酒消毒胸部皮肤，再用酒精棉球脱碘。
左手捏紧乳鼠颈背部皮肤以充分展露胸部，右手以眼科直剪剪开皮肤，充分撕拉开，再用酒精棉球消毒，继而以另一把眼科弯剪沿胸骨柄左下缘向上剪开肋骨，然后在切口中间横剪胸骨。
用眼科镊取出肺，置于盛有PBS(含有200U/ml青链霉素)的玻璃平皿中，冲洗去血。
3. 用眼科剪将肺分成几个肺叶，用镊子去除周边的血凝块及纤维组织，用眼科剪剪去肺门处的支气管和血管，再用含有双抗的PBS冲洗1遍。
4. 用眼科弯剪将肺组织剪碎成1 mm3大小，加入含有双抗的PBS，将肺组织块吹打开，静置15 min后，更换新的PBS。
5. 用200 ul微量加样器(最好是超净台中专用的，临用时用酒精绵球好好擦拭枪柄)取200 ul加样枪头一个，剪去尖，在酒精灯上用火焰烧弯。
用枪头吸取组织块接种于培养瓶中，每瓶20-25块左右，每小块间距0.5 cm左右。
组织块放置好后，轻轻将培养瓶翻转，让瓶底朝上，向瓶内加入2 ml左右的培养液，盖好瓶盖，将培养瓶倾斜放置在温箱中，干贴壁2-4 h后，将培养瓶慢慢翻转平放，继续静置培养。
原代细胞培养操作(鼠胎组织细胞培养为课件
–一种弱酸，中文名字是羟乙基哌秦乙硫磺酸，对细胞无毒 性
–主要作用:防止培养基pH迅速变动。在开放式培养条件下， 观察细胞时培养基脱离了5%CO2的环境， CO2气体迅速逸出， pH迅速升高，若加了HEPES，此时可以维持pH7.0左右。一 般在进行克隆化培养时要添加HEPES
. 活细胞不被染色，死细胞染成蓝色； . 用活细胞占细胞中的百分比表示细胞活力；
. 方法：
1、将细胞悬液以0.5ml加入试管中； 2、加入0.5ml 0.4%台盼兰染液，染色2一3分钟； 3、吸取少许悬液涂于载玻片上，加上盖片； 4、镜下取几个任意视野分别计死细胞和活细胞数，计细胞活力；
死细胞能被台盼兰染上色，镜下可见深兰色的细胞，活细胞不被染色， 镜下呈无色透明状。
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胶塞的清洗
• 新购置的瓶塞带有大量滑石粉及杂质，应先用 自来水冲洗，再做常规处理
• 常规清洗方法
–每次用后立即置入水中浸泡，用2% NaOH 或洗衣粉 煮沸10-20 分钟 (以除掉培养中的蛋白质) ， 自来 水冲洗，蒸馏水冲洗2-3次，晾干备用
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塑料制品的清洗
• 塑料制品现多是采用无毒并已经特殊处理的 包装，打开包装即可用，多为一次性物品
• 消化、接种培养：加入0.25％胰蛋白酶消化液 (5-10倍量) ，
与组织块混匀。置37℃水浴，观察消化情况 (每隔几分钟摇
动一下试管) ，静止，吸去上清，加入5~10ml细胞培养液，
用吸管吹打混匀，移入二个培养瓶中，置于二氧化碳培养箱
中培养
1
2
细胞培养中应注意的几个问题
1)培养液和培养物的比例： 一定浓度的培养液
• 常用工作液浓度为0.02%。 注意：使用EDTA 处理细胞后，要用平衡盐液冲洗 干净，因残留的EDTA 会影响细胞生长
ICR小鼠胚胎成纤维细胞的培养及饲养层的制作
环节是在增殖的同时保持其未分化状态。"#;" 年
［ ?］ ［ +］ VZ0/8 等 和 20.95/ 等 分别利用成纤维细胞饲养
层的培养系统，首次成功建立了小鼠胚胎干细胞
［ \， ;］ 系。成纤维细胞可以合成分泌多种因子 ， 其中
白血病抑制因子 （ &3-]3C50 5/F5U59%.R 1069%.，E<W ）和 成纤维细胞生长因子 （ 15U.%U&089 :.%X9F 1069%.，WQW ）
$%&’ "#! (%’ " ,0/’ )**+
!"# 小鼠胚胎成纤维细胞的培养及饲养层的制作
招! 霞， ! 孙海翔， ! 胡娅莉， ! 张宁媛， ! 徐志鹏
（ 南京大学医学院附属鼓楼医院生殖医学中心， 江苏南京 )"***; ）
摘要： ! 目的： 建立 <=> 小鼠胚胎成纤维细胞饲养层培养体系， 用于胚胎干细胞建系及研究。 ! 方法： 选取不同胎 以细胞形态、 生长曲线、 囊胚种植 龄的鼠胚原代细胞分离成纤维细胞， 制作饲养层， 使用不同浓度丝裂霉素 = 处理， 情况为饲养层评价指标。! 结果： <=> 小鼠胚胎成纤维细胞可在胎龄 ")’ ? @ "A’ ? 4 进行原代细胞分离； ")’ ? 4 为最 "B’ ? 和 "A’ ? 4 分离的细胞需在 B 代以后使用； + 代以前细胞可用于饲养层制作；)* C: D E 丝裂霉素 = 佳分离时间； 作用 )’ ? F 可达到较好的处理效果。! 结论： <=> 小鼠可用来分离、 培养胚胎成纤维细胞， 用于胚胎干细胞饲养层 的制作。 ! 胚胎成纤维细胞； ! <=> 小鼠； ! 饲养层； ! 胚胎干细胞 关键词： ! >GBB)! ! ! 文献标识码： ! H! ! ! 文章编号： ! "**;G;"## （ )**+ ） *"G**B+G*A ! 中图分类号：
小鼠胚胎成纤维细胞MEF培养相关知识总结
小鼠胚胎成纤维细胞MEF培养相关知识总结2009-08-19 18:39:07 来源:未知【大中小】评论: 条摘要：小鼠胚胎成纤维细胞的富集1、给13-14天的孕鼠注射大约0.5ml阿佛小鼠胚胎成纤维细胞的富集1、给13-14天的孕鼠注射大约0.5ml阿佛丁。
当鼠麻醉后，实施断颈法处死小鼠。
2、用70％乙醇擦拭腹部，把皮肤向后拉，暴露出腹膜。
用消毒过的工具，剪开腹壁以暴露出子宫角。
将子宫角移到10cm的皿里。
用10ml不含钙镁离子的PBS洗三遍。
3、用剪刀剪开每一测的胚囊,并将胚胎移到培养皿中。
4、用两副钟表镊子将胎盘和膜与胚胎分离开，分离后切除内脏（所有深色的东西）。
将胚胎转移到(有盖)培养皿中，用10ml不含钙镁离子的PBS洗三遍。
5、用带有弯钩的眼科剪将组织剪碎，当你剪的很累以致于不能再剪的时候，加入2ml 胰蛋白酶/EDTA继续剪。
再加入另外5ml胰蛋白酶/EDTA，并在37℃孵育大约20分钟。
此时，返回至第一步，对下一只鼠进行操作。
6、执行1－4步，到将胚胎置于胰蛋白酶/EDTA中这一步。
7、吹打胰蛋白酶/EDTA中的胚胎，直到有很少的组织物残留。
将皿放回培养箱再孵育10分钟。
8、用20ml培养基以终止胰蛋白酶/EDTA的消化，将皿中的物质转移至50ml锥形管中。
9、混匀管内的物质，加入到含有20ml培养基的T75培养瓶中。
每个培养瓶中装大约3个胚胎。
10、将这些培养瓶放在培养箱中37℃培养过夜。
11、将胚胎置于PBS中，并重复第5步。
12、第二天更换培养基，以去除碎片和中毒的细胞及其分泌的物质。
13、当培养瓶中的细胞长到80-90%汇合时并仍处于指数生长期时，是冻存细胞的最佳时期。
一般说来，这发生在准备胚胎的第二天。
这可能或早或晚发生，所以请注意观察你的培养瓶。
注释：我们已用CF－1品系的鼠制备了成纤维细胞。
培养基成分：88％DMEM10％FBS1％NEAA1% 双抗对于新建立的细胞系，要对样本进行支原体检测。
小鼠胚胎成纤维细胞的分离和培养
小鼠胚胎成纤维细胞的分离和培养一、实验材料1.主要仪器设备(1)倒置显微镜（Olympus，Japan）(2)CO2培养箱（BB16HF，上海力申科学仪器有限公司）(3)100ml的玻璃培养瓶（江苏海门市大路塑料实验仪器厂）(4)6孔培养板（COSTAR，每孔直径为3.5cm）(5)Eppendroff管(6)1ml,2ml,5ml的玻璃滴管各30支；10ml尖底离心管和直径为8cm的平皿(7)离心机(8)5ml冻存管(9)两套小鼠用解剖器械（包括眼科剪和眼科镊）2.主要试剂配制(1)MEF(mouse embryo fibroblast，小鼠胚胎成纤维细胞)培养液——低糖DMEM母液1)用一个1000ml的大烧杯加入1000ml无菌无内毒素的超纯水（购自福州新北生化工业有限公司）；2)将一小袋低糖DMEM(GIBCO/BRL,Cat.No.31600-034)全部加入上述水中，同时轻轻搅拌，并冲洗包装袋的内面以洗下所有的粉未。
3)每升培养基中添加3.7gNaHCO3。
4)搅拌直至完全溶解。
5)用1NHCl或1NNaOH调培养基的pH至比最终的工作液的PH低0.2-0.3，调好PH后，将容器密封（在该实验中用1NHCl调PH至7.3）。
6)立即用0.22um的滤器过滤除菌，装入高压过的盐水瓶中, 4℃保存(1个月内用完)。
——MEF培养液取100ml上述配好的低糖DMEM液体，加入10000IU青霉素钠（6.25mg）和10mg链霉素，溶解后再次调节PH至7.3，经0.22um的滤器过滤至高压过的血清瓶中，再添加10ml分装好的新生牛血清（Newborn Calf Serum, GIBCO/BRL,需56℃，30min灭活过），4℃保存至使用。
(2)PBS在500ml超纯水中依次溶入NaCl 4.0gKCl 0.1gNa2HPO4.12HO2 1.445gKH2PO40.1g于121℃高压灭菌30min或经0.22um的滤器过滤除菌再分装入100ml洁净灭菌的盐水瓶中，再放入4℃冰箱中保存备用。
小鼠成纤维细胞原代培养
实验—小鼠成纤维细胞得原代培养一、实验目得１.掌握哺乳动物细胞原代培养与传代培养中得取材、消化及无菌操作等基本实验技术与操作过程。
2。
熟悉在倒置相差显微镜下观察培养细胞得形态与生长状况得方法．3。
了解细胞原代培养与传代培养得原理与方法。
二、实验原理自１７世纪下半叶Robｅrt Hooｋｅ提出“细胞"概念直至2０世纪中叶，细胞培养(Cell culture)才逐渐发展起来.现代生命科学以及相关领域得研究前提就是细胞得维持与增殖，因此,细胞培养不仅就是细胞生物学得密不可分得组成部分,而且已经成为生物化学、生物物理学、遗传学、免疫学、肿瘤学、生理学、分子生物学与神经科学、甚至临床医学得重要内容。
细胞培养也就是细胞生物学延伸至相关学科得一条主要途径。
如今,细胞培养已经成为生命科学与医学研究最常用得基础技术之一。
细胞培养就是模拟机体内生理条件,将细胞从机体中取出,在人工条件下,使其生存、生长、繁殖与传代，进行细胞生命过程、细胞癌变、细胞工程等问题得研究。
细胞培养得直接目得就是维持或扩增细胞数量。
依据取材于动物组织或培养细胞,细胞培养分为原代培养与传代培养．1.原代培养(pｒimary culture)就是从供体取得组织或细胞后在体外进行首次培养直至成功地进行首次传代之前得培养。
但实际上通常把第一代至第十代以内得培养细胞统称为原代细胞培养.原代培养就是建立细胞系得第一步,其最基本得方法有两种：组织块培养法与消化培养法.组织块培养法就是指直接从机体取下组织与器官,通过组织块直接长出单层细胞,该培养法就是最常用得原代培养方法，其将刚刚离体得、生长活力旺盛得组织剪成小块接种在培养瓶中作为实验材料，一天后细胞可从贴壁得组织块四周游出并生长。
组织块培养法操作过程简便、易行,培养得细胞较易存活，适用于一些来源有限、数量较少得组织得原代培养。
消化培养法利用酶或机械方法将组织分散成单个细胞后，在不加任何粘附剂得情况下，直接移植在培养瓶壁上,加入培养基立即进行培养得方法。
胎鼠成纤维细胞制备
胎鼠成纤维细胞：原代MEF制备在下午4点至5点将性成熟小鼠按雌雄比1：1合笼，次日检栓，有拴雌鼠记为0．5天，取妊娠14．5天孕鼠，○1颈椎脱臼处死孕鼠，无菌取出子宫，PBS清洗血迹。
（处死孕鼠，置于75%酒精里全身浸泡，若有可能，置紫外灯下照射5min.然后在超净台中用一把剪刀和一把镊子把孕鼠外皮剪开，用另外一把剪刀和一把镊子把内皮剪开，露出子宫，最后用第三把剪刀和镊子将子宫小心取出放在盛有PBS的玻璃平皿中，冲洗去血。
）②取无菌镊子撕开子宫和胎膜，撕断脐带，游离出胎鼠，PBS液清洗胎鼠表面的血迹。
○3用镊子去除鼠尾、四肢、头及内脏，仅留背部皮肤，PBS清洗背部皮肤血迹。
（留少许PBS将胚胎转移到另一装有PBS的平皿中，用手术刀片将其细细切碎。
）④用无菌眼科剪剪碎背部皮肤至1mm3碎块，用200ul的移液枪反复快速吹打平皿中的液体，放在15ML离心管中，4℃1500rpm(离心力？)离心5分钟，倒掉上清⑤向离心管内加入消化液，以略微没过组织块为宜，用滴管反复吹打使之混合均匀，室温静止约3—5min，可见试管内液体类似毛玻璃状。
⑥加入3ml培养液终止消化，用移液枪反复吹打混匀，室温静止取上清，加入15ml离心管内，在向有组织块内离心管加入3ml培养液，用移液枪反复吹打混匀，室温静止取上清加入离心管内，这个过程应重复3次⑦将收集来的细胞悬液以1000rpm，离心5min，弃上清，加6ml含有双抗的培养液重悬细胞，接种于两个25cm2 的培养瓶中。
○824小时后更换新鲜的MEF生长培养基，以去除碎片和中毒的细胞及其分泌的物质。
成纤维细胞：原代MEF制备MEF传代1）选择长到80%左右的细胞进行传代。
将长满细胞的培养瓶中原来的培养液弃去。
加入PBS 洗一遍。
（不要待细胞长得太满的时候才传代，如果老是这样，细胞由于接触抑制和堆积的代谢产物的毒副作用，会慢慢的老化）2)加入0.5-1ml 0.25％胰酶溶液，使瓶底细胞都浸入溶液中。
小鼠胎儿成纤维细胞饲养层的制备
下， 能迅速 增长繁殖 ， 并在 生长 过程 中分泌 ＬＦ和 Ｉ Ｆ Ｆ等生长 因子 ， Ｇ 具有 同化培养 液 ， 改善接 种细胞 生 长环 境和 抑 制 细 胞 分 化 的 作 用 ， 以常 用 来 制 作 所 饲养层 。饲养 层主要用 于对一些特 殊细胞 如胚胎 干细胞 、 原干细胞 、 精 哺乳 动物 各种组织 的干细胞 的 培 养 。 但有 时实验室研究所 需要 的饲养层细胞有 限， 不适 于大量 的培养 、 冷冻保存 。这种情况下 ， 需要 找到 一种更有效 的方法来 解决这 一 问题 。本 实验
ｔ ｅｅ ｐ ｒｍｅ ｔ ｐ ｒ ｔ ｎ ｂ ｔ ｌｏｒ ｄ ｃ ｅｅ ｐ ｒｍｅ ｔ ｘ ｅ ｓ ｓ Ｔ ｅ Ｓ Ｃ ｕ ｔ ｒ ｄｏ ａ ｕ ｖ ｖ ｎ ｒ ｌ ｅ ａ ｅ ｈ ｘ ｅ ｉ ｎ ｅ ａ ｉ ｕ ｓ ｅ ｕ ｅｔ ｘ ｅ ｉ ｎ ｐ ｎ ｅ ． ｈ Ｓ ｃ ｌ ｅ ｎ ｉ ｃ ｎ ｓ ｒ ｉ ｅａ ｄｐ ｏ ｉ ｒ ｔ ． ｏ ｏ ａ ｈ ｅ ｕ ｔ ｆ
娠 ｌ ～ １ 的母 鼠进行胎儿 成纤维细胞饲 养层的 ３ ５ ｄ 制 各 。另 外 推 算 分 娩 日期 ， 娩 当 日记 为 ０ ， 取 分 选 ｄ ７ ８日龄 的小 鼠进行 精原细胞 的制备 。 ～
１ 实验 方法 ． ２
１ ． 成 纤 维 细 胞 的 制 备 ．１ ２
（ ｒ ｅｓ ａｒ ｕ ｕａ ｕ ｉｅｓ ｙＨ ｅｂｎ Ｈ ｉ ｎ ｉ ｎ ，ｈｎ ５ ０ ０ Ｎｏｔ ａｔｇｉ ｌ ｒｌｎｖｒｉ ａｒｉ ｅ ｏ ｇｉ ｇＣ ｉａ１０ ３ ） ｈ ｃｔ ｔ ｌ ａ
［ ｓ ａｔ Ｗ ｈｎ ｕ ｙｈ ｐ ｃ ｌｅｌｏ Ｅ ｌ ｎ Ｓ ｔｔａｕｕ ｌ ｅｄ ｏ ｕｔｒ ｅｅ ｅ ｓ ｎｔｅ ｅｄｒａｅ Ａｂｔ ｃ］ ｅ ｓ ｄ ｅ ｅｉ ｌ ｆ Ｓ ｅｌ ｄ Ｃｅ ｔ ｓａｌ ｎｅ ｌ ｅｈ ｓ ｌ ｅｅ ｙｒ ｒ ｗｅ ｔ ｔ Ｓ ａｃ ｓ ｃ Ｓ ａ ｃｈ ｙ ｔｃ ｕ ｔ ｃ ｌｏ ｈ ｆ ｌ
气道和肺泡部位成纤维细胞的原代分离和培养
气道和肺泡部位成纤维细胞的原代分离和培养*曾莹莹胡蔚萍左依慧张静**(复旦大学附属中山医院呼吸与危重症医学科上海 200032)摘要 目的：建立小鼠气道和肺泡部位原代成纤维细胞的分离、培养方法，为研究肺内成纤维细胞的区域性差异提供技术平台。
方法：将小鼠双肺取出并固定后，在体视显微镜视野内分别分离气道和肺泡组织块，并应用组织块培养法分别进行细胞的体外原代和传代培养。
通过细胞形态观察以及细胞表面标志物的免疫荧光检测对培养的成纤维细胞进行鉴定。
此外，采用阿尔玛蓝法分别检测气道和肺泡部位成纤维细胞的增殖情况并进行比较。
结果：12 h内可见分离的原代细胞贴壁生长，7 d可进行传代。
在倒置显微镜下观察，细胞呈长梭状，胞体丰满，胞质均匀，符合成纤维细胞的特点，并且细胞在5代以内可保持良好的生长状态和稳定的性状。
免疫荧光检测结果显示，抗波形蛋白染色和抗α-平滑肌肌动蛋白染色呈阳性，抗细胞角蛋白染色、抗血管性假血友病因子染色、抗结蛋白染色均呈阴性，由此表明该分离培养的细胞为成纤维细胞，且纯度高达99%。
此外，气道部位的成纤维细胞增殖能力显著高于肺泡部位。
结论：应用显微解剖加组织块法可成功分离培养小鼠气道和肺泡部位成纤维细胞，并且使细胞在5代以内生长状态良好，从而为探索小气道壁和肺泡成纤维细胞功能差异提供必要的细胞工具。
关键词成纤维细胞气道组织肺泡小鼠显微分离原代培养中图分类号：Q813.11 文献标志码：A 文章编号：1006-1533(2021)03-0068-05Isolation and culture of primary fibroblasts derived from airway and alveolar tissues*ZENG Yingying, HU Weiping, ZUO Yihui, ZHANG Jing**(Department of Pulmonary and Critical Care Medicine, Zhongshan Hospital, Fudan University, Shanghai 200032, China)ABSTRACT Objective: To establish mice fibroblasts of airway and alveolar tissues isolation method for primary culture and research use and to provide the platform for the research of regional differences between fibroblasts from the airway and alveolar tissues. Methods: The 6-8 month old mice were sacrificed and the lung were got totally together with trachea. Then the airway tissues and the alveolar tissues were isolated under the stereomicroscope respectively. Primary fibroblasts were cultured by tissue block culture method and were identified by cell morphology and immunofluorescence staining. The proliferative ability of fibroblasts derived from airway and alveolar tissues was analyzed by Alamar blue assay. Results: The fibroblasts derived from airway and alveolar tissues were generally elongated and spindle shaped and were in line with the classic fibroblasts form. Moreover, the primary fibroblasts maintained the steady growing condition within the 5 passages. Further analysis using immunofluorescence revealed that the fibroblasts markers vimentin and α-SMA were positive, cytokeratin staining, desmin staining, and von Willebrand factor staining were negative, which showed that the primary fibroblasts were fibroblasts. In addition, the proliferative ability of fibroblasts derived from airway tissues was significantly higher than that from alveolar tissues.Conclusion: Primary fibroblasts derived from airway and alveolar tissues could maintain good condition within passage 5. And it provided a good cell tool to investigate the functional difference between this kind of fibroblasts.KEY WORDS fibroblasts; airway; pulmonary alveolus; mice; microisolation; primary culture慢性阻塞性肺病（慢阻肺）是一种常见的慢性进行性疾病，最新研究结果提示40岁以上人群中发病率达到11.7%，构成了重大疾病负担[1-5]。
胎鼠肺成纤维细胞的培养方法007
胎鼠肺成纤维细胞原代培养摘要：目的改良胎鼠肺成纤维细胞的培养方法方法：取19 d胎龄129孕鼠,开胸取出胎肺,用胰酶稍微消化,再进行组织悬液贴壁培养。
传代的肺成纤维细胞用免疫组化检测其vimentin和laminin的表达.结果24 h后镜下可见组织块周边有长梭型细胞爬出，48 h后生长迅速，3 d接近融合。
传代后杂细胞基本去除，5代后细胞的增殖能力逐渐下降。
结论：胰酶轻度消化后组织悬液贴壁法是一种可靠快速的肺成纤维细胞分离纯化培养方法.肺成纤维细胞的体外培养（Lung fibroblasti，LF）的体外培养为研究肺的发育，肺纤维化的发病机制以及其他肺部疾病的研究提供了重要的细胞模型。
而胎肺成纤维细胞的培养，对于早产儿肺部疾病、肺发育以及成纤维细胞的异质性研究均有重要意义。
为此，本文改良了以前我们所学过的小鼠肺原代培养技术，建立了一种胎鼠肺成纤维细胞分离纯化、培养的可靠简便方法。
一、材料与方法用超纯水溶解的H-DMEM的培养基（Gibo），补加NaHCO3 2g/L 及HEPES 2g/L,过滤除菌。
在-20℃以下保存备用，使用前添加15％新生牛血清（NBS）、青霉素100IU/ml、链霉素100ug/ml。
消化液：0.25％胰蛋白酶，抗vimentin(波形但蛋白)和laminin(层粘蛋白)。
二、实验动物年龄为7-8周的性成熟129小鼠，雌雄鼠按3:1同笼过夜，次日晨检查见雌鼠阴道阴栓针为孕0.5d。
孕期满18d(足月为22天)时，进行剖宫产术取出胎鼠。
三、肺成纤维细胞分离培养方法孕鼠断头处死小鼠，无菌术开胸，取出胎鼠，置于放有PBS的无菌培养皿中，取出胎肺，反复用PBS冲洗至肺组织发白，用手术剪将肺组织剪碎（小于1mm3）,移至10mL离心管中，静置5分钟后，尽量把PBS吸出，然后按1:1比例加入0.25％胰蛋白酶（37℃预温），用吸管反复吹打1分钟，加入含15％新生牛血清（NBS）的H-DMEM 的培养液终止消化，用吸管吹打均匀，1000r/min离心3min,弃上清，再加入少量15％新生牛血清（NBS）的H-DMEM的培养液悬浮组织块，加入培养液不飘起组织块为宜。
大鼠肺成纤维细胞原代提取及培养实验具体步骤及方法
大鼠肺成纤维细胞原代提取及培养实验具体步骤及方法大鼠肺成纤维细胞原代提取及培养实验具体步骤及方法将大鼠的肺成纤维细胞从机体中取出，经胰酶、螯合剂（常用EDTA）处理，分散成单细胞，置合适的生长培养基培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖。
一、实验材料准备1. 动物出生后1-4天的Wistar乳鼠1只。
2. 试剂PBS、培养液(Hyclone的低糖DMEM，含Hyclone的10%新生牛血清、100 U/ml 青链霉素、1%明胶PBS、0.25%胰酶(含EDTA，GIBCO)，碘酒和酒精绵球。
3. 器械眼科直剪2把、眼科弯剪2把、眼科直镊2把、眼科弯镊2把、玻璃平皿3套，25 cm2塑料培养瓶(Costar)。
二、具体操作1. 明胶包被培养瓶过夜(准备2-3个)，取出明胶，用2 ml培养液冲洗培养瓶一遍，置于超净台中。
2. 解剖取肺：将乳鼠在酒精中浸泡后取出，转移至超净台上的玻璃培养皿中，用碘酒消毒胸部皮肤，再用酒精棉球脱碘。
左手捏紧乳鼠颈背部皮肤以充分展露胸部，右手以眼科直剪剪开皮肤，充分撕拉开，再用酒精棉球消毒，继而以另一把眼科弯剪沿胸骨柄左下缘向上剪开肋骨，然后在切口中间横剪胸骨。
用眼科镊取出肺，置于盛有PBS(含有200U/ml青链霉素)的玻璃平皿中，冲洗去血。
3. 用眼科剪将肺分成几个肺叶，用镊子去除周边的血凝块及纤维组织，用眼科剪剪去肺门处的支气管和血管，再用含有双抗的PBS冲洗1遍。
4. 用眼科弯剪将肺组织剪碎成1 mm3大小，加入含有双抗的PBS，将肺组织块吹打开，静置15 min后，更换新的PBS。
5. 用200 ul微量加样器(最好是超净台中专用的，临用时用酒精绵球好好擦拭枪柄)取200 ul加样枪头一个，剪去尖，在酒精灯上用火焰烧弯。
用枪头吸取组织块接种于培养瓶中，每瓶20-25块左右，每小块间距0.5 cm左右。
组织块放置好后，轻轻将培养瓶翻转，让瓶底朝上，向瓶内加入2 ml左右的培养液，盖好瓶盖，将培养瓶倾斜放置在温箱中，干贴壁2-4 h后，将培养瓶慢慢翻转平放，继续静置培养。
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胎鼠肺成纤维细胞原代培养
摘要：目的改良胎鼠肺成纤维细胞的培养方法
方法：取19 d胎龄129孕鼠,开胸取出胎肺,用胰酶稍微消化,再进行组织悬液贴壁培养。
传代的肺成纤维细胞用免疫组化检测其vimentin和laminin的表达.结果24 h后镜下可见组织块周边有长梭型细胞爬出，48 h后生长迅速，3 d接近融合。
传代后杂细胞基本去除，5代后细胞的增殖能力逐渐下降。
结论：胰酶轻度消化后组织悬液贴壁法是一种可靠快速的肺成纤维细胞分离纯化培养方法.
肺成纤维细胞的体外培养（Lung fibroblasti，LF）的体外培养为研究肺的发育，肺纤维化的发病机制以及其他肺部疾病的研究提供了重要的细胞模型。
而胎肺成纤维细胞的培养，对于早产儿肺部疾病、肺发育以及成纤维细胞的异质性研究均有重要意义。
为此，本文改良了以前我们所学过的小鼠肺原代培养技术，建立了一种胎鼠肺成纤维细胞分离纯化、培养的可靠简便方法。
一、材料与方法
用超纯水溶解的H-DMEM的培养基（Gibo），补加NaHCO3 2g/L 及HEPES 2g/L,过滤除菌。
在-20℃以下保存备用，使用前添加15％新生牛血清（NBS）、青霉素100IU/ml、链霉素100ug/ml。
消化液：0.25％胰蛋白酶，抗vimentin(波形但蛋白)和laminin(层粘蛋白)。
二、实验动物
年龄为7-8周的性成熟129小鼠，雌雄鼠按3:1同笼过夜，次日晨检查见雌鼠阴道阴栓针为孕0.5d。
孕期满18d(足月为22天)时，进行剖宫产术取出胎鼠。
三、肺成纤维细胞分离培养方法
孕鼠断头处死小鼠，无菌术开胸，取出胎鼠，置于放有PBS的无菌培养皿中，取出胎肺，反复用PBS冲洗至肺组织发白，用手术剪将肺组织剪碎（小于1mm3）,移至10mL离心管中，静置5分钟后，尽量把PBS吸出，然后按1:1比例加入0.25％胰蛋白酶（37℃预温），用吸管反复吹打1分钟，加入含15％新生牛血清（NBS）的H-DMEM 的培养液终止消化，用吸管吹打均匀，1000r/min离心3min,弃上清，再加入少量15％新生牛血清（NBS）的H-DMEM的培养液悬浮组织块，加入培养液不飘起组织块为宜。
每四个小鼠肺可接种在一个50mL的培养瓶中。
37℃、5％co2培养箱培养，24h补加培养液后继续培养，48h换液，3d细胞接近融合时，弃去培养液，PBS清洗3次，加入0.25％胰蛋白酶消化1分钟，加入含15％新生牛血清（NBS）的H-DMEM的培养液终止消化，用吸管吹打均匀，1000r/min离心3min,弃上清，再加入少量15％新生牛血清（NBS）的H-DMEM的培养液，按1:2传种接代。
四、免疫组化鉴定
将传代的LF消化制成单个细胞悬液，计数细胞，调整细胞密度为1×104／ml，接种于6孔板内(孔内有预先置有多聚赖氨酸涂布的盖玻片)，37 5％CO：培养箱常规培养，当细胞铺满盖玻片时取出盖玻片。
4％多聚甲醛固定0 rain，PBS洗3次，按免疫组化SABC 法检测LF vimentin和laminin的表达，认真完成细胞培养和检验。
五、结果
⑴LF的分离纯化和扩增
24h后显微镜下可见长梭型细胞从组织块中爬出．48 h后细胞生长迅速，3 d接近融合。
在原代培养过程中，LF还混有少量的圆形Ⅱ型肺泡上皮(AECI1)，因为AECII不能传代培养。
故传1代后，AECII已基本消失。
LF呈星状或梭形，核椭圆形，核仁明显，细胞伸出多个突起，并连接成网状。
传代后的LF几乎长满整个培养瓶。
偶见其他非纤维细胞，细胞增殖能力强，3—4 d 接近融合，连续传4～5代以后，细胞增殖能力方逐渐下降。
六、免疫组化染色
肺成纤维细胞呈vimentin和laminin阳性．呈棕黄色。
七、讨论
以往的培养法：①细胞生长缓慢，需7—10 d细胞才能长满；
②操作步骤较多，容易污染，对细胞损伤也比较大，且需时长，整个过程历时8 h。
本改良实验根据AECⅡ不能传代培养的特点，本实验采用胰酶稍微消化后的组织混合悬液进行贴壁培养。
LF贴壁生长快，24 h 后可见组织块周围有长梭形细胞长出，第 2 d换液后48 h后生长迅速，3-4 d后融合连成一片。
传代后AEC II 基本消失，获得纯度比较高的LF细胞。
有研究表明LF呈vime n和lanainin免疫反应阳性。
本实验分离培养的细胞形态与贴壁生长特性及对vimentin和laminin呈免疫反应阳性等均与以前肺成纤维细胞培养研究相一致。
本方法操作简单，大大缩短了时间，全程大约为1 h左右，减少了污染机会，保证了细胞活力。
本实验还观察到LF传代到第4～5代后．细胞的活力有所下降，做体外细胞实验的一般选用1–3代的细胞，减少污染及避免细胞活力的下降，既省时又省材料。