大肠杆菌基因工程
大肠杆菌基因工程菌常用类型
1、大肠杆菌DH5a菌株DH5a是世界上最常用的基因工程菌株之一。
由于DH5α是DNA酶缺陷型菌株，有利于基因克隆，保存质粒，但该菌株的蛋白酶没有缺陷，表达的蛋白容易被降解，因此通常不作为表达菌株。
E.coli DH5a在使用pUC系列质粒载体转化时，可与载体编码的β-半乳糖苷酶氨基端实现α-互补。
可用于蓝白斑筛选鉴别重组菌株。
基因型：F-，φ80dlacZΔM15，Δ(lacZYA-argF)U169，deoR，recA1，endA1，hsdR17(rk-，mk+)，phoA，supE44，λ-，thi-1，gyrA96，relA12、大肠杆菌BL21(DE3) 菌株该菌株用于高效表达克隆于含有噬菌体T7启动子的表达载体（如pET系列）的基因。
T7噬菌体RNA聚合酶位于λ噬菌体DE3区，该区整合于BL21的染色体上。
该菌适合表达非毒性蛋白。
基因型：F-，ompT，hsdS（rBB-mB－），gal，dcm（DE3）3、大肠杆菌BL21(DE3) pLysS菌株该菌株含有质粒pLysS，因此具有氯霉素抗性。
PLysS含有表达T7溶菌酶的基因，能够降低目的基因的背景表达水平，但不干扰目的蛋白的表达。
该菌适合表达毒性蛋白和非毒性蛋白。
基因型：F-，ompT hsdS（rBB-mB－），gal，dcm（DE3，pLysS ，Camr4、大肠杆菌JM109菌株该菌株在使用pUC系列质粒载体进行DNA转化或用M13 phage载体进行转染时，由于载体DNA产生的LacZa多肽和JM09编码的LacZΔM15进行α-互补，从而显示β-半乳糖苷酶活性，由此很容易鉴别重组体菌株。
基因型：recA1，endA1，gyrA96，thi－1，hsdR17，supE44，relA1，Δ（lac－proAB）/F’[traD36，proAB+，lacIq，lacZΔM15]5、大肠杆菌TOP10菌株该菌株适用于高效的DNA克隆和质粒扩增，能保证高拷贝质粒的稳定遗传。
基因工程-32大肠杆菌克隆载体课件
这样可以在转化后的大肠杆菌细胞中获得大量 的目的DNA。
第二个优点在于重组体的识别只需一步，仅仅 只要把待筛选的大肠杆菌铺板到含有氨苄青 霉素和X-gal的琼脂培养基上。
而pBR322和pBR327，重组体的筛选都需要把 菌落从一种抗生素培养基原样转移到另一种 抗生素培养基平板。
一个用pUC8做载体的克隆实验比选择pBR322
当被克隆的基因有潜在的危害性时，应优先选 择pBR327。
•基因工程-32大肠杆菌克隆载体
•12
•基因工程-32大肠杆菌克隆载体•13来自pUC8—乳糖选择质粒
pUC8也是一个源自于pBR322的质粒，
只保留了pBR322的复制起点和ampR基因。 ampR基因的核酸序列也被改变了，不再包含唯一
的限制性酶切位点。
到噬菌体M13的短序列中。产生了M13mpl， 它在含有X-gal的琼脂板上形成蓝色的噬菌斑。
M13mpl的lacZ'基因上不含有任何的限制性酶
切位点，但在靠近基因起始位置的地方有一 个GGATTC的序列。改变一个核苷酸就变成
GAATTC，这是EcoRI的识别位点。这个改变
是用体外诱变完成的，产生了M13mp2克隆 载体。
用PstI，PuvI或ScaI酶切后插入DNA会导致氨 苄青霉素抗性基因失活；用BamHI及HindⅢ
等8个限制性内切核酸酶酶切后插入DNA会 导致四环素抗性基因失活。
这意味着pBR322支持很多种不同黏性末端的 DNA片段的导入。
•基因工程-32大肠杆菌克隆载体
•6
第三个优点在于pBR322有相当高的拷贝数
EcoRI的黏性末端。 多接头被插入到M13mp2克隆载体的EcoRI位
点上，形成了一个更加复杂的载体，即 M13mp7。
基因工程3大肠杆菌表达系统
生物农药实例
利用基因工程3大肠杆菌表达系统生产Bt蛋白 （Bacillus thuringiensis），该蛋白对多种
鳞翅目害虫具有毒杀作用，可有效防治棉花、 水稻和玉米等农作物的虫害。
基因工程3大肠杆菌表达系统在生物燃料领域的应用
生物燃料
基因工程3大肠杆菌表达系统在生物燃料领域的应用主要涉及生产生物柴油、生物氢等 可再生能源。通过在大肠杆菌中表达特定的外源基因，可以获得具有催化活性的酶，用
安全性问题
针对安全性问题，应加强监管和规范操作，确保基因工程3大肠杆菌表达系统的安全性 和可靠性。
基因污染
为避免基因污染，应加强基因工程3大肠杆菌表达系统的封闭式生产，并采取有效的检 测手段，确保产品的安全性和可靠性。
基因工程3大肠杆菌表达系统在未来的应用前景
生物制药
基因工程3大肠杆菌表达系统有望在生物制 药领域发挥重要作用，用于生产重组蛋白、 抗体、疫苗等生物药物。
利用基因工程3大肠杆菌表达系统生产重组 人胰岛素、生长激素、干扰素等蛋白质药物， 这些药物在临床治疗中发挥了重要作用。
基因工程3大肠杆菌表达系统在生物农药领域的应用
生物农药
基因工程3大肠杆菌表达系统在生物农药领 域的应用主要涉及生产具有杀虫、杀菌或除 草功能的蛋白质。通过在大肠杆菌中表达特 定的外源基因，可以获得具有生物活性的蛋 白质，用于防治农作物病虫害和杂草。
工业生产
基因工程3大肠杆菌表达系统在工业生产领域具有 广泛的应用前景，可用于生产酶、生物材料、生物 燃料等产品。
农业领域
基因工程3大肠杆菌表达系统在农业领域的 应用前景广阔，可用于改良作物品种、提高 抗逆性、增加产量等方面。
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第三章大肠杆菌基因工程-1
Plac -lacI 调控模式的问题与策略
问题1： 葡萄糖是宿主最适碳源，而启动子受葡萄糖阻遏， 不便于发酵培养基设计 对策： 采用突变型Plac UV5（不受葡萄糖阻遏）
突变型乳糖启动子Plac UV5
CAP正调控
野生型的Plac上游附近拥有
代谢激活蛋白（CAP）结合 区，cAMP激活CAP，CAP 结合启动子控制区，进而促 Plac O cAMP 高效转录
目的基因
cI857 PL B
吲哚丙烯酸，IAA）。
T7启动子 ——来自T7噬菌体的异源启动子
T7启动子——最成功的启动子
*只有T7 RNA 聚合酶才能识别 T7 启动子 * T7 RNA 聚合酶合成 mRNA 的速度比大肠杆菌RNA 聚合
酶的快 5 倍
*由于大肠杆菌本身不含 T7 RNA 聚合酶 ，需要将外源的 T7 RNA 聚 合酶引入宿主菌。 *通过调控T7 RNA 聚合酶 的表达间接调控外源基因的表达 *以 Novagen 公司的 pET 系统为杰出代表。
P
O
乳糖启动子Plac
转录受 CAP 正调控和 lacI 负调控 lacI 负调控
野生型的Plac与其控制区Olac 偶联在一起，在没有诱导物 存在时，整个操纵子处于基 底水平表达；诱导物可以使 启动子Plac介导的转录大幅 提高 高效转录 P 乳糖 异丙基-b-D-硫 代半乳糖苷（IPTG） 诱导 O 基底水平转录 阻遏蛋白
Ptac = 3 Ptrp = 11 Plac
启动子的筛选
采用鸟枪法策略，将合适大小的DNA片段 克隆到启动子探针质粒pKO1上 宿主细胞染色体DNA上的galE、galT与质
Apr pKO1 galK
粒上报告基因galk的表达产物联合作用，
简述大肠杆菌转化法的原理
简述大肠杆菌转化法的原理
大肠杆菌转化法是一种重要的基因工程技术，用于将外源DNA片段引导入大肠杆菌细胞中。
其原理如下：
1. 准备质粒DNA：外源DNA片段被克隆到一个环状DNA分子上，称为质粒。
质粒中通常包含一个选择性的抗生素抗性基因，用于筛选带有插入物的转化菌落。
2. 制备有效的感受态细胞：将大肠杆菌细胞在低温条件下处理，使其处于亚温感受夹状态。
这样可使细胞外膜孔增大，利于DNA片段进入细胞。
3. 转化：将质粒DNA与感受态细胞混合，并通过热激冷冻法或电穿孔法等方式，增加DNA片段进入细胞的效率。
这些DNA片段会进入大肠杆菌细胞的质粒或染色体。
4. 恢复和培养：将转化后的细菌在适宜条件下恢复生长，使其表达并复制质粒中的外源DNA片段。
5. 识别重组菌落：在含有相应抗生素的培养基上培养细菌，通过筛选获得带有外源DNA片段的重组菌落。
这些菌落会在培养基中形成可见的生长。
通过大肠杆菌转化法，科研人员可以将外源DNA片段导入到细胞中，从而实现基因的增加、改变或删除。
这是基因工程研究和应用中常用的手段，对于生物医
学、农业和工业领域都具有重要意义。
基因工程3大肠杆菌表达系统
• 制备用于电转化的感受态细胞相对容易。 当细菌长到对数中期，冷却、离心，然后用
冷却的去离子水反复清洗，最后用10%甘油重 悬细胞，使其浓度为31010细胞/毫升，在干冰 或液氮中速冻后置于-70 ℃贮存。
• 转化必须在0-4 ℃下进行。 如果在室温下操作，转化效率会大大降低。
四、克隆的真核基因在大肠杆菌细胞中的表达
大肠杆菌中表达体系的不足：
1. 真核基因，在结构上同原核基因之间 存在着很大的差别。
2. 真核基因的转录信号同原核的不同。
细菌的RNA聚合酶不能识别真核的启 动子；外源基因可能含有具大肠杆菌转 录终止信号功能的核苷酸序列。
3. 真核基因mRNA的分子结构同细菌的 有所差异，影响真核基因mRNA稳定性。
操作步骤： （1）将处于对数生长期的新鲜培养物（0.5-0.6OD)，于4℃, 4000转/分钟离心10分钟，回收细菌细胞； （2）将细胞用0℃的2溶液重新悬浮细胞沉淀，以诱导细胞 感受态产生； （3）加入适量的DNA后，于42 ℃热处理90秒； （4）将混合物快速转移到冰浴中，是细胞冷却1-2分钟，加 入适当的培养基在37 ℃培养45分钟，使细胞复苏，并表达 质粒所携带的转化基因； （5）选择培养基培养，选择转化体。
§ 重组操作时， N-端增加一个增加稳定性的氨基酸
（3）表达天然的蛋白质
以形成融合蛋白的形式在大肠杆菌细胞中 表达外源真核基因具有许多方面的优越性。 例如，产物比较稳定，可以免受胞内蛋白酶 的降解作用，可以获得较高的产率。
Tacon等人在80年代初期，使用大肠杆菌的 trp启动子和与之相连的SD序列，构建了两种 有利于表达天然蛋白质的质粒载体。pWT551 和pWT571
（2）结构决定因子与蛋白质的稳定性
基因工程大肠杆菌发酵生产重组人胰岛素的研究
参考内容
引言
人胰岛素是一种重要的生物药物，对于治疗糖尿病具有显著效果。传统上，人 胰岛素的生产主要通过从人身体中提取胰岛素原，然后进行化学合成和结构改 造。然而，这种方法不仅成本高昂，而且生产周期长，难以满足市场需求。近 年来，随着生物技术的发展，利用重组大肠杆菌生产人胰岛素的方法逐渐得到 广泛应用。本次演示将详细介绍利用重组大肠杆菌生产人胰岛素的方法和相关 技术。
展望未来，基因工程大肠杆菌发酵生产重组人胰岛素的研究有望为糖尿病治疗 提供更加安全、有效的药物。随着科学技术的不断进步和研究的深入，我们相 信未来能够在提高产量、降低成本、优化质量等方面取得更大的突破。加强与 其他领域（如纳米技术、生物信息学等）的跨学科合作，将为该领域的研究和 应用提供更为广阔的前景。
生产流程
利用重组大肠杆菌生产人胰岛素的生产流程包括以下几个步骤：
1、细胞悬浮：将大肠杆菌接种到发酵罐中的无菌培养基中，在适宜的温度和 湿度条件下进行培养。培养过程中需监测细菌生长情况，以确保细菌处于最佳 生长状态。
2、发酵：当细菌生长到一定密度时，向发酵罐中加入适量的诱导剂，以诱导 细菌表达人胰岛素基因。发酵过程中需控制温度、湿度、氧气浓度等参数，以 确保细菌正常表达胰岛素基因。
一、背景介绍
基因工程技术是一种利用微生物或细胞体系生产人类所需蛋白质的技术。在过 去几十年中，基因工程技术得到了广泛应用，并在制药、生物能源、环境保护 等领域发挥了重要作用。重组人胰岛素是一种利用基因工程技术生产的胰岛素， 它与人体产生的胰岛素具有相似的结构和功能。然而，重组人胰岛素的生产过 程比较复杂，需要经过多个步骤，因此生产成本较高。
3、收集：发酵结束后，收集细菌培养液并进行过滤，以去除其中的杂质和细 胞残骸。
第十四章：大肠杆菌基因工程资料
突变碱基对，其活性比野生型Plac启动子更强，而 且对葡萄糖及分解代谢产物的阻遏作用不敏感，但 仍为受体细胞中的Lac阻遏蛋白阻遏，因此可以用
乳糖或IPTG进行有效诱导。人工构建的Ptac启动子
由于含有lac操作子区域，所以其阻遏诱导性质与
PlacUV5相同。
cI857 控制 PλL ， cI857 阻遏蛋白在 42℃时失
活脱落， PL 便可介导目的基因的表达，但
在大型细菌培养罐中迅速升温很难，故常
使用双质粒的控制系统，用色氨酸间接控
制目的基因表达。
当培养基中缺少色氨酸时，Ptrp启动子打开，CI 阻遏蛋白合成，由Pl启动子介导的外源基因转录 关闭；相反，当色氨酸大量存在时，Ptrp启动子 关闭，CI阻遏蛋白不再合成，Pl启动子开放并激 活外源基因表达。从整体上来看，外源基因虽然 处于Pl启动子控制之下，但却可用色氨酸取代温 度进行诱导表达。
第十四章
大肠杆菌基因工程
第一节、大肠杆菌作为受体菌的特征
一．大肠杆菌表达外源基因的优势 1.全基因组测序，遗传背景清楚 ， 共有4405个开放阅读框架。 2.基因克隆表达系统成熟完善。
3.繁殖迅速，培养简单，操作方便， 遗传稳定。 4.被美国FDA批准为安全的基因工程 受体生物。
5.成本低
二．大肠杆菌表达外源基因的劣势 1.缺乏对真核生物蛋白质的加工系统。 2.内源性蛋白酶易降解空间构象不正 确的异源蛋白。 3.不具备真核生物的蛋白质复性系统。 4.其细胞膜间隙含有大量的内毒素，
构。将这个区域的DNA片段次级克隆在启动子探针
质粒上，测定其所含有启动子的转录活性。
③滤膜结合法分离
原理是双链 DNA 不能与硝酸纤维素薄膜有效结合，而 DNA-
基因工程大肠杆菌发酵生产重组人胰岛素的研究
基因工程大肠杆菌发酵生产重组人胰岛素的
研究
基因工程大肠杆菌发酵生产重组人胰岛素的研究是利用基因工程
技术将人类胰岛素基因导入大肠杆菌细胞中，并使其表达和分泌人类
胰岛素。
研究的具体步骤如下：
1. 克隆：将人类胰岛素基因插入到大肠杆菌中的表达载体上，构建重
组胰岛素的基因工程菌株。
2. 表达：将重组胰岛素基因工程菌株进行培养和诱导表达，启动胰岛
素基因的转录和翻译，使其合成胰岛素多肽链。
3. 折叠：由于胰岛素中存在多肽链的结构，其需要正确折叠形成活性
结构。
通过培养条件的调控和辅助分泌蛋白的表达帮助胰岛素多肽链
正确折叠。
4. 分泌：经过折叠的胰岛素多肽链进入细胞分泌途径，通过胞外酶切，胰岛素分泌至外部培养液中。
5. 纯化：将培养液中的胰岛素进行纯化，去除其他杂质，得到纯度较
高的重组人胰岛素。
这种方法相比其他表达系统有以下优势：
1. 大肠杆菌生长快速且易于培养，并且具有可高效表达外源基因的能力。
2. 人类胰岛素的基因序列已经大量研究，其表达也相对成熟和稳定。
3. 大肠杆菌发酵工艺相对简单，易于工业化生产。
4. 经过纯化的重组胰岛素具有较高的活性和纯度，适用于临床应用。
大肠杆菌基因工程 (2)
大肠杆菌基因工程引言大肠杆菌(Escherichia coli)是一种广泛存在于自然界中的革兰氏阴性菌，它可以在动植物肠道中找到。
由于其生长快速、易于培养和转化，大肠杆菌成为了基因工程研究中最重要的模式生物之一。
大肠杆菌基因工程是通过改变大肠杆菌的遗传特征，实现对其功能的改造和优化，从而达到生产特定产物或解决特定问题的目的。
大肠杆菌基因工程的原理基因传递与插入大肠杆菌基因工程的核心在于将目标基因导入到大肠杆菌中。
目前常用的方法有以下几种：1.转化(transformation)：通过将外源DNA直接导入大肠杆菌细胞内，使其在细胞内复制和表达。
2.电转化(electroporation)：利用强电场将质粒DNA引入细胞内，使其与大肠杆菌细胞内的DNA重组。
3.病毒介导的转染(viral-mediated transduction)：使用病毒载体将目标基因导入大肠杆菌细胞内。
4.转座子介导的DNA转移(transposon-mediated DNAtransfer)：利用转座子将目标基因插入到大肠杆菌染色体的特定位点上。
基因表达与调控在大肠杆菌基因工程中，外源基因导入之后需要进行表达和调控，以产生所需的受体蛋白或产物。
常用的表达系统包括启动子-启动子区域-编码序列-终止子的结构。
其中，启动子可以选择适当的促进剂或抑制剂进行调节，以控制基因的表达水平和时机。
应用案例生物医药领域在生物医药领域，大肠杆菌基因工程被广泛应用于生产重组蛋白药物。
通过引入外源基因，大肠杆菌可以高效地合成重组蛋白，并通过分离和纯化得到高纯度的药物。
例如，利用大肠杆菌表达系统，可以生产出重组人胰岛素、生长激素等重要药物。
环境治理领域大肠杆菌基因工程还可以应用于环境治理领域。
例如，通过改造大肠杆菌的基因组，使其具有降解有机污染物的能力，可以用于处理工业废水和土壤污染。
此外，大肠杆菌的工程还可以用于制造生物能源，例如利用大肠杆菌产生生物柴油或生物氢。
大肠杆菌在生物工程中的应用研究
大肠杆菌在生物工程中的应用研究大肠杆菌是一种常见的细菌，属于革兰氏阴性菌，可以在大肠内生长繁殖。
它是一种典型的模式微生物，也是生物工程中的重要研究对象。
在生物工程中，大肠杆菌不仅可以用作基因工程载体，还可作为研究重要蛋白质的工具。
今天，我们就来探讨大肠杆菌在生物工程中的应用研究。
大肠杆菌在基因工程中的应用研究在生物工程研究中，大肠杆菌作为载体在基因克隆、表达和突变等方面被广泛应用。
其中，基因克隆是指将感兴趣的基因从其它生物中分离出来并插入大肠杆菌染色体中，使它们具有在大肠杆菌中表达的能力。
基因表达指利用大肠杆菌表达人类或其它生物的重要蛋白质，例如生长因子、免疫球蛋白等等。
基因突变指在大肠杆杆菌中引入人为突变，以研究这些基因对细胞机制、代谢调节等方面的影响。
基因克隆是利用大肠杆菌的DNA重组技术实现的。
当染色体DNA遭受化学或物理作用而断裂时，通常会出现两种不同的DNA断裂形式：端断和内切。
大肠杆菌中，当外源DNA准备进入宿主细胞时，这些DNA可以直接与大肠杆菌染色体DNA发生重组，从而允许特定基因的插入和删除。
这充分说明了大肠杆菌在基因工程中的应用优势。
大肠杆菌在重要蛋白质的表达中的应用研究大肠杆菌一直被用作研究生物技术和药物开发的重要工具。
它具有高效表达目的基因和纯化重要蛋白质的功能，特别是在产生重要的生物医药品方面，大肠杆菌有着较为显著的优势。
例如，大肠杆菌用于表达疫苗和生物制品、裂解蛋白和其他生物大分子材料，这些产品通过利用大肠杆菌的表达系统生产。
这个系统专门用于生产疫苗和生物制品，并为生物药物产业提供可靠和高效的货源。
另外，大肠杆菌的生物合成能力在蛋白生产和制定新型蛋白的过程中得到了广泛应用。
一些蛋白本身的结构和物理化学特性就能够在大肠杆菌进行生产。
目前，大肠杆菌在表达酶类和仅含小分子的特殊蛋白方面已经有了较好的基础。
通过使用基因工程方法构建不同的蛋白表达平台，在基因表达、突变物的制成和纯化方面，具有很大的应用潜力。
大肠杆菌在基因工程中的应用
大肠杆菌在基因工程中的应用
大肠杆菌是微生物中最为普遍的种类之一，其在生物工程研究中也扮演着重要角色。
大肠杆菌不仅因关系到人类营养和生态环境而广泛应用，而且由于其生长繁殖迅速，具有
良好的遗传性状以及可调控性强等特点，在基因工程中的应用也得到了越来越多的关注。
首先，大肠杆菌可以用于制备新型微生物色素。
由于大肠杆菌的膜蛋白性状和抗病毒
的质量，它们能够用于制造出自然结构完整的大肠杆菌色素。
这些色素能够用于抗肿瘤药
物的开发。
大肠杆菌色素可以被用来改变多种抗病毒活力，使它们更有效地抑制肿瘤细胞
的生长。
此外，大肠杆菌还可以用作基因表达系统。
它可以被用来做基因组挖掘和表达分析，这些工作为药物研发提供有价值的信息，例如新型药物的发现和开发，重组蛋白的制造和
功能的研究。
此外，大肠杆菌也可以被用作能够识别细菌毒素的选择性培养介质，从而检
测特定的病原体。
最后，大肠杆菌可以作为能够大量合成药物以及相关产品的“小工厂”，如重组植物
激素、抗生素和其他生物活性物质。
大肠杆菌是一种极具潜力的生物反应器，可以稳定生
产大量重要化学物质，并长期保持较高的性能质量。
此外，它还可以用作研究新颖的化学
过程的实验室，不仅可以证明一种化学反应是可行的，还可以利用实现它们的生物工程技
术来建立化学工厂，产生更大规模的产品。
综上，大肠杆菌具有良好的基因组可调控性，能够快速繁殖，形成色素，稳定表达，
能产生多种活性物质，检测病原体以及应用于研究新型化学过程等特性，这些特性都使得
大肠杆菌在基因工程中有着巨大的应用价值,使之成为一种普遍意义上重要的微生物细胞。
基因工程实验方案实验
基因工程实验方案实验一、实验目的本实验旨在利用基因工程技术对大肠杆菌进行基因改造，使其能够表达外源蛋白。
具体来说，我们将利用质粒载体将感兴趣的外源基因导入大肠杆菌，并通过PCR、酶切、连接、转染等技术，构建表达载体，使其能够在大肠杆菌中表达外源蛋白。
通过本实验，我们希望能够探究基因工程技术在微生物工程中的应用，并为后续的基因改造研究提供实验基础。
二、实验材料1. 大肠杆菌菌种2. 质粒载体3. PCR试剂盒4. 酶切试剂盒5. 连接试剂盒6. DNA电泳仪7. 热循环仪8. 紫外可见分光光度计9. 转染试剂三、实验步骤1. 质粒载体提取首先，从实验室常用菌株中提取质粒载体。
我们选择一株质粒带有多克隆位点的大肠杆菌附着菌株，通过菌株复苏、培养、质粒提取等步骤，从中提取目标质粒载体。
2. PCR扩增外源基因根据我们感兴趣的外源基因序列，设计相应的引物，利用PCR技术扩增目标基因。
在PCR反应过程中，我们需要控制PCR反应的条件和时间，确保外源基因能够被充分扩增。
3. 酶切及连接将目标基因和质粒载体分别进行酶切处理，然后进行连接。
酶切及连接过程中需要保证实验操作无菌、操作准确，以确保目标基因能够成功插入质粒载体中。
4. 构建表达载体通过连接实验，成功将外源基因插入质粒载体中，构建表达载体。
之后，通过DNA电泳、酶切鉴定等技术手段，对构建的表达载体进行验证和鉴定。
5. 大肠杆菌转染将构建的表达载体转染至大肠杆菌，使其内源化。
转染过程中需要严格控制转染条件，保证外源基因能够成功表达。
6. 蛋白表达检测经过转染后，我们将进行蛋白表达检测。
通过蛋白印迹、Western blot、质谱等技术手段，对外源蛋白的表达情况进行检测和分析。
7. 结果分析最后，对实验结果进行分析，包括目标基因的扩增情况、质粒构建情况、大肠杆菌转染情况以及蛋白表达情况等，总结实验结果。
四、实验注意事项1. 实验操作需严格遵守无菌操作规范，确保操作台面、设备、试剂均处于无菌状态。
基因工程-32大肠杆菌克隆载体
技术创新
随着技术的不断进步，基因工程32大肠杆菌克隆载体的效率和安全性将得到提高。法规完善
随着基因工程-32大肠杆菌克隆载 体的应用范围扩大，相关法规和 监管体系也将逐步完善，为技术 的健康发展提供保障。
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利用基因工程手段改造微生物，提高微生物对污染物的降解能力，实现对环境污染的生 物修复。
生物监测
通过基因工程技术构建具有特定功能的微生物，实现对环境污染物的实时监测和预警。
05
基因工程-32大肠杆菌克 隆载体的挑战与前景
安全性问题
潜在的健康风险
基因工程-32大肠杆菌克隆载体可能含有对人体有害的基因或基因 片段，导致基因突变或产生新的疾病。
环境影响
基因工程-32大肠杆菌克隆载体可能对环境造成破坏，如基因污染、 生态失衡等。
长期影响未知
由于基因工程-32大肠杆菌克隆载体的应用时间较短，其长期对人 体和环境的影响尚未完全明确。
伦理问题
01
02
03
人类基因干预
基因工程-32大肠杆菌克 隆载体涉及到对人类基因 的干预，可能引发伦理争 议。
基因歧视
1990年代
人类基因组计划启动，推动了基因组学和功能基因组学的研究。
21世纪
基因编辑技术的发展，如CRISPR-Cas9系统，使得对DNA的精确编辑成为可能。
基因工程的应用
医药领域
用于药物研发、疾病诊断和治疗，如胰岛素、 生长激素和肿瘤免疫治疗等。
工业领域
用于生物燃料、生物塑料和生物酶的生产， 以及环境污染的生物治理等。
基因工程-32大肠杆菌克 隆载体的应用可能导致基 因歧视现象的出现，对某 些人群造成不公平待遇。
将目的基因导入大肠杆菌的方法
将目的基因导入大肠杆菌的方法
将目的基因导入大肠杆菌的方法
将目的基因导入大肠杆菌是载体制备和基因工程技术中最重要的一步。
目前，有几种方法可以将目的基因导入大肠杆菌。
首先，可以使用质粒载体系统。
大肠杆菌质粒是一种携带较大DNA片
段的可进行遗传学分析的载体。
可以将目的基因克隆到质粒中，然后
将质粒转化到大肠杆菌中，使其具有目的基因的表达功能。
其次，可以使用质粒载体系统搭配高效的基因转化系统。
这种方法通
过使用自制的质粒载体和高效的基因转化系统，将目的基因直接转化
到大肠杆菌中。
最后，可以使用高效的噬菌体转化系统。
噬菌体是一种非常精细的质粒，可以直接转化到大肠杆菌中，并将目的基因携带进去。
总之，将目的基因导入大肠杆菌有许多方法，最常用的方法包括质粒
载体系统、高效的基因转化系统和高效的噬菌体转化系统。
这些方法
都可以有效地将目的基因导入大肠杆菌中，从而实现基因工程技术的
发展。
大肠杆菌在基因工程中的应用
大肠杆菌在基因工程中的应用大肠杆菌是一种常见的细菌，因为其易于培养和遗传学特性而成为了基因工程的重要模型生物之一。
基因工程是人类利用分子遗传学、细胞生物学等技术手段对生物体进行基因改造的过程，使其实现某些人类所需的生物学功能。
本文将深入介绍大肠杆菌在基因工程中的应用。
一、大肠杆菌在DNA重组中的应用DNA重组是指将不同来源的DNA进行拼接、克隆或删除等操作来改变基因的结构和功能。
大肠杆菌是一种真正的工程菌，在DNA重组中有着重要的作用。
因为大肠杆菌的染色体只有一根，而且细胞的分裂时期只有30分钟左右，这就为大肠杆菌的DNA重组提供了非常便利的条件。
利用基因工程技术，可以将人类需要的目的基因克隆到大肠杆菌中，并利用大肠杆菌代谢途径的生物反应来合成所需要的特定蛋白。
此外，大肠杆菌也可以通过作为载体来传播适当的DNA。
大肠杆菌的细胞质中有着非常多的质粒，这些质粒可以独立于染色体进行复制和表达。
这意味着我们可以把重要的基因克隆到质粒上，利用大肠杆菌作为载体携带质粒将其引入真核细胞中。
这样，大肠杆菌及其质粒成为了一种高效的基因转移方法，为生命科学和生物技术中的基因治疗、基因诊断和疫苗等的研究带来了无限的可能性。
二、大肠杆菌在蛋白质表达中的应用大肠杆菌非常适合用于蛋白质表达，因为大肠杆菌具有快速繁殖、生长周期短和容易生长等优点。
在常规的重组蛋白制备过程中，研究人员常常使用大肠杆菌作为表达主机，将重组蛋白基因导入到大肠杆菌中，然后通过不同的表达条件来诱导基因表达，最终得到高含量且纯度较高的重组蛋白。
这项基因工程技术具有质量稳定、生产过程简单和成本低等优点，因此在医药生物领域的蛋白质药物和医用耗材领域受到广泛应用。
三、大肠杆菌在基因敲除中的应用基因敲除是一种通过人工手段消除某些基因表达功能的方法。
大肠杆菌是一种常见的基因敲除菌种。
利用基因敲除技术，研究人员可以选择性地删除大肠杆菌的某些基因，以了解这些基因在生物体代谢和生理过程中的功能，同时也能够根据需要对基因进行改造，以达到预期的效果。
基因工程大肠杆菌发酵生产重组人胰岛素的研究
基因工程大肠杆菌发酵生产重组人胰岛素的研究一、概述基因工程是一种革命性的生物技术，它允许科学家在分子水平上对生物体进行精确的操控和改造。
自从20世纪70年代基因工程技术诞生以来，它已广泛应用于医药、农业、工业等领域，为解决人类面临的诸多挑战提供了新的途径。
利用基因工程大肠杆菌发酵生产重组人胰岛素是基因工程在医药领域的一个重要应用。
重组人胰岛素是一种通过基因工程技术生产的人胰岛素类似物，具有与天然人胰岛素相似的生物活性。
它主要用于治疗糖尿病等代谢性疾病，具有广阔的市场前景和重要的社会价值。
与传统的动物源胰岛素相比，重组人胰岛素具有纯度高、稳定性好、免疫原性低等优点，因此备受关注。
在大肠杆菌中发酵生产重组人胰岛素的过程涉及多个关键步骤，包括基因克隆、表达载体的构建、宿主细胞的选择、发酵条件的优化等。
通过这些步骤，可以实现重组人胰岛素的高效表达和分泌，从而生产出符合治疗要求的胰岛素产品。
本文旨在探讨基因工程大肠杆菌发酵生产重组人胰岛素的研究进展、技术原理、工艺优化以及未来的发展趋势。
通过深入了解这一领域的研究现状，可以为重组人胰岛素的生产提供理论支持和实践指导，进一步推动基因工程技术在医药领域的应用和发展。
1. 重组人胰岛素的重要性和应用背景重组人胰岛素，作为一种生物技术产品，在医学领域具有极其重要的地位。
它是通过基因工程技术，将人类胰岛素基因插入到大肠杆菌等微生物体内，使其能够生产与人体胰岛素功能相似的胰岛素。
这种胰岛素在治疗糖尿病方面发挥着至关重要的作用。
糖尿病是一种全球性的健康问题，影响着数以亿计的人口。
根据国际糖尿病联盟（IDF）的数据，全球约有62亿成年人患有糖尿病，预计到2045年这一数字将增至7亿。
糖尿病的治疗需要长期使用胰岛素，而重组人胰岛素因其与人体胰岛素的高度相似性，成为糖尿病治疗的首选药物。
重组人胰岛素的应用背景源于对胰岛素需求的不断增长。
在重组人胰岛素出现之前，糖尿病患者主要依赖从猪或牛体内提取的胰岛素进行治疗。
大肠杆菌在细胞工程中的作业
大肠杆菌在细胞工程中的作业大肠杆菌是单细胞微生物，寄生在人和动物的肠道中。
由于它分布广泛，繁殖迅速，每25分钟就繁殖一代，因而大肠杆菌就成了在基因工程中常用的一种微生物，并在基因工程中显示了神奇的功能，被人们誉为制造生物新品种的“细菌工厂”。
19XX年，瑞士科学家观察到大肠杆菌内有一种限制性的核酸内切酶，后来被美国科学家进一步证实并应用于遗传学的研究。
结果表明，大肠杆菌的限制性核酸内切酶可以成为切割DNA分子的一把锐利的“剪刀”。
19XX年，美国科学家把大肠杆菌的两个不同的DNA分子重新组合在一起，然后把这个组合的DNA 引进大肠杆菌中，结果重组的DNA表现出了双亲的遗传特性。
次年，科恩等人又成功地将金黄色葡萄球菌的DNA 和大肠杆菌的DNA重组在一起。
接着，他们又将高等动物青蛙的DNA 与大肠杆菌的DNA重组在一起。
这些试验的成功，表明各种生物在亿万年间所形成的种类之间的天然屏障，开始在微小的大肠杆菌面前崩溃了。
人类向合成生命的自由王国迈进了一大步。
大肠杆菌在人工合成基因方面也担当着重要角色。
19XX年XX 月，美国一些著名科学家合作，首次用人工合成基因移植到大肠杆菌内，使大肠杆菌分泌出了极为珍贵的人脑激素——生长素的抑制素（简称SS）。
这是基因工程取得的第一项引起世界轰动的重大成果。
此后不久，美国另一研究组织宣布，他们把人工合成的人体胰岛素基因转移到大肠杆菌内，也获得成功，并且生产出少量的胰岛素。
这是大肠杆菌为基因工程创造的又一奇迹。
现在科学家已经使用基因工程技术，通过大肠杆菌来制造人的生长激素（HGH）、干T扰素、尿激酶和镇痛化学物质β—内腓酞等。
最近，遗传学家又把大肠杆菌分解的半乳糖基因切割下来，装在一种噬菌体上，放进病人的纤维细胞中，借大肠杆菌的基因来治疗半乳糖血症（一种先天性的代谢缺陷症）获得成功，从而使临床上采用基因疗法来根治遗传病的设想正在成为现实。
预计应用基因工程技术来产生阻止癌细胞繁殖的基因，以便彻底根治癌症的设想，在不久的将来一定能够实现。
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法
大肠杆菌作为受体的特征
• 优点 遗传背景清楚，生长迅速，培养简单， 重组子稳定，载体受体系统完整
• 缺点 结构复杂、长生多种种类的内毒素
谢谢观看
05
目的基因的表达 与筛选
04
受体细胞的增值
目的基因获取
通过dna合成仪用 化学方法合成
表达载体的构建
• • • • •
外源基因在大肠杆菌中高效表达原理 启动子 终止子 核糖体结合位点 密码子 质粒拷贝数
将目的基因导入受体细胞
重组人胰岛素的大肠杆菌工程菌的构 建（人胰岛素原表达法）
基因工程菌的构建战略：
ta c Me t b-
转 化
Ap
r
Gal Me
B t Cpeptide Apeptide peptide
分离纯
M N M
ori
化
C
人胰岛素原的
cDNA
重组人胰岛素
原
重组人胰岛素的大肠杆菌工程菌的构 人胰岛素原表达 建
核糖体结合位点
• 大肠杆菌核糖体结合位点包括下列四个特征结构要素：
• 位于翻译起始密码子上游的6-8个核苷酸序列5’ UAAGGAGG 3’， 即 Shine-Dalgarno （SD）序列，它通过识别大肠杆菌核糖体小亚基
中的16S rRNA 3’端区域3’ AUUCCUCC 5’并与之专一性结合，
大肠杆菌基因工程菌构建
• 包涵体型异源蛋白的表达
• • • • • 分泌型异源蛋白的表达 融合型异源蛋白的表达 寡聚型异源蛋白的表达 整合型异源蛋白的表达 蛋白酶抗性或缺陷型表达系统的构建
大肠杆菌工程菌构建
这些构建大肠杆菌工程菌的方法，都是利 用大肠杆菌本身特性，来达到目的基因高效、 稳定、快速表达。
P
终止子
• 终止子选择与使用
目前外源基因表达质粒中常用的终止子是来自大肠杆菌rRNA操纵 子上的rrnT1T2以及T7噬菌体DNA上的Tf。对于一些终止作用较弱的终
止子，通常可以采用二聚体终止子串联的特殊结构，以增强其转录终止
作用 终止子也可以象启动子那样，通过特殊的探针质粒从细菌或噬菌体
基因组DNA中克隆筛选
生产技术的评价： 在人胰岛素原表达工艺中，由于C肽的存在，胰岛素原 能形成 良好的空间构象，三对二硫键的正确配对率也相应提高，折 叠率高 达80%以上。虽然这条工艺路线并不比AB链分别表达法更 为简捷， 而且还要使用两种高纯度的酶制剂，但理想的折叠率在很 大程度上 弥补了工艺繁琐的缺陷，使得每克最终产品的成本仅50美 元。目前美国Ely LiLi公司采用此工艺年产十几吨的重组人胰 岛素。
表达与筛选
• 对于标定的目的基因的大肠杆菌进行培养 扩增，诱导表达，进而采用多种方法鉴定 筛选 • 一 营养缺陷型筛选 • 二 抗药性筛选 • 三 显色筛选
对于微生物常用蓝白斑法鉴定
大肠杆菌
挑选出转入目的基因的大肠杆菌进行培 养，送到相应部门进行DNA扩增，获取更多 基因。也可以对大肠杆菌进行低温保存处理。
M
化
C
CNBr 处
ori
peptide 化学合成AB链编码序
列 重组人胰岛 素 体外折 叠
理
特异性裂 解
重组人胰岛素的大肠杆菌工程菌的构
A链B链同时表达法
建
生产技术的评价： 由于A链和B链上共存在六个半胱氨酸残基，体外二硫 键的正 确配对率较低，通常只有10% - 20%，因此采用这条工 艺路线生 产的重组人胰岛素每克成本高达100美元以上。 为了进一步降低生产成本，美国Ely LiLi公司随后又建 立了第 二条生产重组人胰岛素的工艺路线。
大肠杆菌的基因工程
大肠杆菌基因工程
201220131271 韩武 生物技术一班
一 大肠杆菌表达的优缺点
二 大肠杆菌工程菌的构建策略 三 大肠杆菌工程菌构建，分析，筛选 四 大肠杆菌生产实用重组蛋白
基因工程步骤 01
目的基因的 获取
02
基因表达 载体的构 建
03
将目的基因导入 受体细胞
06
菌种贮存与保护
大肠杆菌基因工程实例
• 胰岛素的合成 • 早期人类从动物体内直接提取，生产效率 低。 • 化学合成 用化学方法合成，成本高 • 基因工程 以大肠杆菌为受体生产胰岛素
重组人胰岛素的大肠杆菌工程菌的构 A链和B链同时表 达法
Ap
r
建
转
化
M
N
ta c
Me
t bGal Me t B Apeptide
分离纯
•
•
第三位上含有G或C的简并密码子占90%以上的绝对优势
密码子与反密码子相互作用的自由能
•
细胞内tRNA的含量
•
按照大肠杆菌密码子的偏爱性规律，设计更换外源基因中不适宜的相应简并 密码子，重组人胰岛素、干扰素以及生长激素在大肠杆菌中的高效表达均采 用了这种方法
质粒拷贝数
• 将质粒导入大肠杆菌中，在大肠杆菌生长 达到对数期时，质粒会大量拷贝增殖，进 而对大肠杆菌生长以及目的基因表达产生 阻碍。故应将重组质粒控制在可控范围内。
对于大肠杆菌微生物来讲可以用ca+2处理 大肠杆菌，再将目的基因的载体转移到大肠 杆菌中。
启动子
启动子最佳距离的探测
A
E
E
目的基因
A 酶切 E
E 启动 子
开
Bal31酶 解
1
启动子
启动子的筛选
采用鸟枪法战略，将合适大小的DNA 片段克隆到启动子探针pko上。 受体细胞染色体DNA上的galE、galT
Prec
A Ptra A Ptrp
T A T G A T
T A A G A C T T G A C A T A T T A C T A T G A C
T A T A A
T A A T G T T A A C T A T A A T A T A A T
Plac Ptac
Ptac = 3 Ptrp A = 11
核糖体结合位点
• 外源基因在大肠杆菌细胞中的高效表达不仅取决于转录启动的频率， 而且在很大程度上还与mRNA的翻译起始效率密切相关。大肠杆菌细 胞中结构不同的mRNA分子具有不同的翻译效率，它们之间的差别有 时可高达数百倍。mRNA翻译的起始效率主要由其5‘ 端的结构序列 所决定，称为核糖体结合位点（RBS）
目的基因导入受体细胞
对于微生物大肠杆菌，可以用ca+2处理， 使其达到感受态，感受态细胞可以吸收周围 DNA,进而可将含有目的基因的载体吸附。
目的基因的检测与测定
• 这样得到的大肠杆菌会有四种 • 一 没有转入质粒的大肠杆菌 • 二转入质粒，但质粒上没有外来基因（转 化子） • 三转入进质粒，质粒上有基因但没有目的 基因（重组子） • 四转入质粒，质粒上有目的基因(目的重组 子）
Ap
r
终止密码 子 pKO 1 galK
与质粒上报告基因galk的表达产物联
作用。可将培养基中的半乳糖酵解成 红色素物质 转化galE+、galT+、galK-的大肠杆 菌受体菌株 含有外源启动子活性的 重组克隆
ori
启动子构建
启动子构建
启动子
PlL
-35区序列
T T G A C
-10 区序
G列 A T A C
将mRNA定位于核糖体上，从而启动翻译； • 翻译起始密码子，大肠杆菌绝大部分基因以AUG作为阅读框架的起始 位点，但有些基因也使用GUG或UUG作为翻译起始密码子； • SD序列与翻译起始密码子之间的距离及碱基组成； • 基因编码区5’ 端若干密码子的碱基序列
密码子
• • • • 不同的生物，甚至同种生物不同的蛋白质编码基因，对简并密码子使用频率 并不相同，具有一定的偏爱性，其决定因素是 生物基因组中的碱基含量 在富含AT的生物（如单链DNA噬菌体fX174）基因组中， 密码子第三位上的U和A出现的频率较高；而在GC丰富的生如链霉菌）基因组中，