2015版中国药典微生物检验

计数标准
• 例如，当标准为101cfu，不同于以往10cfu规定。以 10的指数规定标准，考虑了微生物计数结果的可变 性，即计数结果非类似化学检验结果。故要求我们需 要在结果判断时或制定内控标准时，对于结果的判断 或历史数据的分析需要用风险分析的手段进行评估。 制定标准时需要依据历史数据、工艺过程、用药人群 等进行相应分析，制定合理的内控标准，即总原则为 在内控标准的控制下产品无任何质量风险。
总结：检验程序
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1、培养基适用性检查； 2、方法适用试验前评估； 3、通过评估，采用规定的稀释液制备样品 4、试验组、菌液对照组、供试品对照组、中 和剂或灭活剂对照组（需要的话）制备；培养、 观察、计数；计算回收率； 5、判断回收率结果是否满足要求： ⑴是，方法适用性试验通过，进行确认； ⑵否，重新选择方法进行适用性试验。 6、按通过的方法进行样品检验。
试剂和试药
• 中和剂、灭活剂和表面活性剂均应对微生物无 毒性其相互间具有相容性，有利于样品中微生 物均匀分散。 • 稀释液 1、pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液；2、pH6.8 无菌磷酸盐缓冲液、pH7.2无菌磷酸盐缓冲液 、pH7.6无菌磷酸盐缓冲液；如需要，可在上 述稀释液灭菌前或灭菌后加入表面活性剂或中 和剂等。3、0.9%无菌氯化钠溶液。
菌数报告规则
• 2、薄膜过滤法：计数方法同平皿计数法，每 张滤膜上的菌落数应不超过100cfu。菌数报告 规则以相当于 1g、1ml或10cm供试品的菌落数 报告菌数；若滤膜上无菌落生长，以﹤1报告 菌数（每张滤膜过滤1g、1ml或10cm 供试品 ），或﹤1乘以最低稀释倍数的值报告菌数。 • 3、MPN法：记录每一稀释级微生物生长的管 数，从表3查对每1g或1ml供试品中需氧菌总数 的最可能数。
肉眼可见并有一定形态构
造的子细胞集团。
真核微生物形态
• 真核微生物：是细胞核具有核膜、核仁， 能进行有丝分裂，细胞质中存在线粒体或 同时存在叶绿体等多种细胞器的一类微生 物。
酵母菌特性
①个体一般以单细胞状态存在 ②多数为出芽繁殖，也有裂殖； ③能发酵糖类产能； ④细胞壁常含甘露聚糖； ⑤喜在含糖量较高、偏酸性环境生长。
检测环境变化
• 微生物计数试验环境要求 微生物计数试验环境应符合微生物限度检 查的要求。检验全过程必须严格遵守无菌操作 ，防止再污染，防治污染的措施不得影响供试 品中微生物的检出。单向流区域、工作台面及 环境应定期进行监测。 • 9203：药品微生物实验室质量管理指导原则 “微生物限度检查应在不低于D级背景下的B级 单向流空气区域内进行”。
非无菌产品微生物限度检查：微生 物计数法(通则1105)解析
• 格式变化 • 内容变化 • 通用要求变化 —适用范围 —检测环境变化 —培养基 — 计数的方法 — 菌种及菌液制备 — 培养基适用性检查 — 计数方法适用性试验 — 供试品检查
格式变化
• 2010版附录ⅩⅢ C/附录 XI J：微生物限度检查法 • 2015版 非无菌产品微生物限度检查：微生物计数 法（通则1105） • 非无菌产品微生物限度检查： 控制菌检查法（通 则1106） • 非无菌药品微生物限度标准（通则1107）
培养基
• 对照培养基 按标准物质管理，由中检院负责研制 分发。 • 计数用培养基 a.需氧菌总数：胰酪大豆胨琼脂培养基（TSA） b.霉菌和酵母菌总数：沙氏葡萄糖琼脂培养基（SDA ） 玫瑰红钠琼脂培养基或含抗生素的SDA。
计数的方法
• 1. 平皿法：包括倾注法和涂布法。该项下明确可使用直 径较大平皿，且培养基的用量应相应增加。 • 2. 薄膜过滤法。 • 3. 最可能数法(Most-Probable-Number Method，简称 MPN。 MPN法用于微生物计数时精确度较差，但对于 某些微生物污染量很小的供试品，MPN法可能是更适合 的方法。
检验量
• 一般随机抽取不少于2个最小包装的供试品 ，混合，取规定量供试品进行检验。 • 除另有规定外，一般供试品的检验量为10g 或10ml；膜剂为100cm2；贵重或微量包装 药品的检验量可以酌减。 • 检验时，应从2个以上最小包装单位中抽取 供试品，大蜜丸还不得少于4丸，膜剂还不 得少于4片。
• 耐胆盐革兰阴性菌为一群无严格定义的微生物 ，通常它们被定义为能够在紫红胆盐葡萄糖琼 脂培养基上生长的微生物。它们包括无乳糖发 酵但能够利用葡萄糖，能够在胆盐中生长的革 兰阴性菌，例如，肠杆菌科、假单胞菌和气单 胞菌属的一些胆盐耐受的革兰阴性菌。
控制菌检查方法适用性 结果判断方式
• Ch.P2015：如果经过试验确证供试品对试验 菌的抗菌作用无法消除，可认为受抑制的 微生物不易存在于该供试品中，选择抑菌 成份消除相对彻底的方法进行供试品的检 查。（阳性对照可以不生长）
微生物基本知识
• 定义：微生物（micBiblioteka Baiduoorganism）是对所有 形体微小，单细胞或结构较为简单的多细 胞甚至无细胞结构的低等生物的统称。
微生物的分类
• 原核微生物：细菌、放线菌、立克次氏体 支原体、衣原体、蓝细菌和古细菌
• 真核微生物：酵母菌、霉菌、粘菌、原生 动物和藻类 • 非细胞型生物：病毒、噬菌体、类病毒、 拟病毒和朊病毒
2015版限度标准的制定特点 及总体结构
• 增订检查制剂类型：基于药品的给药途径 及对患者的潜在危 害划分风险等级来制定 标准。
齿龈、皮肤制剂、呼吸道制剂； 增加原辅料、中药提取物、中药饮片的控制
• 兼顾国产药品的特点，保留中国药典对中 药制剂分类特点：
是否含药材原粉，是否含豆豉、神曲； 是否接触完整皮肤黏膜。
• 注：方法选择原则：根据供试品理化特性和微生物限度 标准等因素选择。
培养基适用性检查
• 胰酪大豆胨琼脂：金黄色葡萄球菌、 枯草芽孢杆菌、铜 绿假单胞菌、白色 念珠菌、黑曲霉 • 胰酪大豆胨肉汤：金黄色葡萄球菌、 铜绿假单胞菌、枯草 芽孢杆菌 • 沙氏葡萄糖琼脂、玫瑰红钠琼脂 、白色念珠菌、黑曲霉。
2015控制菌检查主要变化—培养体系
• 增菌培养基（广谱增菌培养基替代选择性 增菌培养基）、预增菌、选择性增菌、分 离用培养基种类变化；培养时间与温度变 化。 • 培养基的适用性发生变化。 • 方法适用性发生变化（方法适用性）。 • 强抑菌性样品的处理方式发生变化。
耐胆盐革兰阴性菌
• 耐胆盐革兰阴性菌(Bile-Tolerant Gram-Negative Bacteria)替代2010年版大肠菌群Coliform）
非无菌化学药品制剂、生物制品 制剂、不含药材原粉的中药制剂
• 1.口服给药制剂（固体、液体） • 2.口腔黏膜给药制剂、齿龈给药制剂、鼻用 制剂 • 3.耳用、皮肤给药制剂 • 4.呼吸道吸入给药制剂 • 5.阴道、尿道给药制剂 • 6.直肠给药制剂（固体、液体） • 7.其他局部给药制剂
酵母菌菌落特征
与细菌相似，较细菌大而厚，圆形，光滑湿润， 粘性，易用针挑起，颜色单调，多为乳白色、少 数红色、常有酒香味
霉菌特性
丝状真菌的一个通俗名称，意即“ 发霉的真菌”。霉菌的营养体由菌丝构 成，菌丝无限生长并产生分枝，分枝的 菌丝相互交错在一起，形成菌丝体。
霉菌菌落特征
• 霉菌细胞呈丝状，在固体培养基上形成营 养菌丝和气生菌丝。霉菌菌落较酵母菌大 质地疏松，外观干燥，不透明，呈现或蛛 网状、绒毛状或棉絮状。菌落与培养基连 接紧密，不易挑取，常有霉味。
格式变化
中国药典2010年版微生物计数法编排方式
中国药典2015年版微生物计数法编排方式
内容变化
适用范围
• 微生物计数法系用于能在有氧条件下生长 的嗜温细菌和真菌的计数。 • 明确规定本法不适用于活菌制剂的检查。 • 增加了检测产品的范围。
2010版：系检查非规定灭菌制剂及其原料辅料受 微生物污染程度的方法
计数标准
• 参考欧、美药典，增加菌落计数标准规定结果以 10ncfu表示时，限度标准解释如下： “101CFU：最大可接受限值=20； 102CFU：最大可接受限值=200； 103CFU：最大可接受限值=2000。
• 若供试品的需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数的 检查结果均符合各品种项下的规定，判供试品 符合规定；若其中任何一项不符合各品种项下 的规定，判供试品不符合规定。
• 修订菌数标准表述方式：指数形式10n，最大可接 受限度值遵守2倍规则： 101CFU：最大可接受限度为20； 102CFU：最大可接受限度为200； 依此类推。 • 修订检查项目： “需氧菌总数（TAMC）”替代“细菌数” “耐胆盐革兰阴性菌”替代“大肠菌群”
与欧洲药典8.0、美国药典36版和日本药局方 ⅩⅤ比较，修订中国药典的微生物限度标准 。
非无菌药品微生物限度标准 (通则1107)解析
• 修订思路
（1）将《中国药典》2010版一、 二、三部微生物限度标准项目进行对比、整合。 • 采用一部的限度标准项目作为合并后限度标准的 基础。 • 参考EP7.0、USP35、JPⅩⅤ标准，修订中国 药典的微生物限度标准。 • 采用清晰直观的表格形式，按给药途径、分液 体、固体性状、列出各类药品的限度标准。
培养条件
• 描述方式：按计数方法适用性试验确认计 数方法进行供试品中需氧菌总数、霉菌和 酵母菌总数测定。 • 培养条件：胰酪大豆胨琼脂平板在30～ 35℃培养3-5天，沙氏葡萄糖琼脂平板在20 ～25℃培养5~7天；MPN法和供试品接种， 所有试验管在30～35℃培养3～5天。
菌数报告规则
• 1、平皿法：需氧菌总数测定宜选取平均菌落 数小于300cfu的稀释级、霉菌和酵母菌总数测 定宜选取平均菌落数小于100cfu的稀释级，作 为菌数报告的依据。取最高的平均菌落数，计 算1g、1ml或10cm 供试品中所含的微生物数 。取两位有效数字报告。 • 如各稀释级的平皿均无菌落生长，或仅最低稀 释级的平板有菌落生长，但平均菌落数小于1 时，以﹤1乘以最低稀释倍数的值报告菌数。
微生物特点
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球菌
杆菌
• 杆菌
螺旋菌
革兰氏阳性细菌与阴性细菌细胞壁 构造图
菌落
菌落(colony)：将单一微生
物细胞或一小堆同种微生 物细胞接种到固体培养基 表面，当它占有一定空间 并给予适宜的培养条件， 该细胞就会迅速生长繁殖。 结果形成以母细胞为中心，
计数要求
• 需氧菌总数是指胰酪大豆胨琼脂培养基上生长的总 菌落数(包括真菌菌落数)；霉菌和酵母菌总数是指 沙氏葡萄糖琼脂培养基上生长的总菌落数(包括细菌 菌落数)。 • 若因沙氏葡萄糖琼脂培养基上生长的细菌使霉菌和 酵母菌的计数结果不符合微生物限度要求，可使用 含抗生素(如氯霉素、庆大霉素)的沙氏葡萄糖琼脂 培养基或选择性培养基(如玫瑰红钠琼脂培养基)进 行霉菌和酵母菌总数测定。使用选择性培养基时， 应进行培养基适用性检查。 • 若采用 MPN 法，测定结果为需氧菌总数。
2015版中国药典微生物检验
2015版微生物检验
• 实现了三部药典标准的统一
• 形成了一个比较完备的药品微生物检验标 准体系，具有以下两个显著特征 • ①全面与国际标准接轨； • ②推动了药品微生物控制由终产品检验向 过程控制转变。
2015版微生物检验
• 微生物基础知识 • 非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法( 通则1105)解析 • 非无菌产品微生物限度检查：控制菌检查法( 通则1106)解析 • 非无菌药品微生物限度标准(通则1107)解析 • 培养基的质量管理 • 工艺用水的检查 • 无菌检查法 (通则1101)解析
计数方法适用性试验
• 1. 术语变化：计数方法适用性试验 • 2.需氧菌总数测定用五种菌株试验 • 3. 菌液加入方式：菌液加入供试液中，使 每1mL供试液或每张滤膜所滤过的供试液中 含菌量不大于100cfu，且所加菌液的体积不 超过供试液体积的1％。
供试品分类及供试液制备
• • • • 1. 水溶性供试品 2. 水不溶性非油脂类供试品 3. 油脂类供试品试品： 4. 需用特殊方法制备供试液的供试品：① 膜剂、②肠溶 及结肠溶制剂、③气雾剂喷 雾剂、④贴膏剂