单胺氧化酶酶活测试

单胺氧化酶酶活的测试

作者：陈志坚

1 准备工作

0.2M pH=7.6的缓冲液的制备：A：B=87：13（抽滤冰箱后使用）

0.2M Na2HPO4：35.82g Na2HPO4于500mL蒸馏水溶解（A）

0.2M NaH2PO4：15.605g NaH2PO4于500mL蒸馏水溶解（B）

0.3M蔗糖：10.268g蔗糖，加入100mL缓冲液

2 酶液制备

将1只雄性wista大鼠脱颈椎处死，取出其肝脏，用预冷的磷酸缓冲液冲洗肝脏表面。将肝脏剪碎，用磷酸缓冲液(pH=7．6)洗涤数次以冲洗去血水，待洗涤干净后，加入20 mL，0．3 M蔗糖缓冲液进行匀浆，充分匀浆后，各取10 mL倒入两个50 mL离心管中。用20 mL，o．3 M蔗糖缓冲液洗涤匀浆器后，各取10 mL倒入前面所述的离心管中。经托盘天平配平(误差不能超过0．01 g)后进行低温差速离，在-4℃下，1000×g离心10 min。吸取上清液，将上清液配平，1200×g离心15 min，吸取上清液，将上清液配平，10000Xg离心30 min，弃去上清液，沉淀加4 mL的磷酸缓冲液混匀，得到Wistar大鼠肝脏线粒体浓缩物，即为实验用单胺氧化酶。

3 酶活性抑制测试

所提取的酶液按照1:3倍稀释（体积比），并进行超滤。（2只小鼠肝脏，最后我们拿到4mL 酶原液，那我们就稀释到12mL使用）

3.1 配药液

配药液（浓度为100μmol/L）= (Mw *10-7 g/ml）：x/(10-7*M)=Y 【X】克晶体，用【X*107/MW】ml溶剂溶解x为晶体质量，M为晶体的相对分子质量，Y为溶剂的体积。

例如：称出晶体质量为0.0010g，M=341，则溶解它的溶剂（DMSO:水=1:1）Y就为

Y=0.0010/（10-7*341）=29ml，用29ml的（DMSO:水=1:1）溶剂溶解0.0010g的晶体。

3.2 底物、显色液

底物：2.5mM酪胺，0.2M pH=7.6的PBS配制；

显色液：1Mm香草酸，0.5mM 4-氨基安替吡啉，4U/mL辣根过氧化物酶，0.2M pH=7.6的磷酸缓冲液配制。

3.3 酶活测试

3.3.1 空白时间测定

在96孔酶标板中加入25uL酶液，25uL缓冲液，37℃孵育1h，后加入160uL底物，再加入40uL显色液，开始计时，37℃孵育30-60min后，用酶标仪在490nm波长下测定其吸光度值，重复该过程直至吸光度值保持不变（或者溶液变为红色），记录时间为T空白。

3.3.2 样品测试

在96孔酶标板中依次加入25uL待测样品药液，25uL酶液，37℃孵育1h，后加入160uL底物，再加入40uL显色液，开始计时，37℃孵育30-60min，用酶标仪在490nm波长下测定其吸光度值，看其到达空白对照吸光度值时所用的时间为T样品。实验时加一组阴性对照：把25uL药液换成25UlDMSO:H2O=1:1。据下式计算抑制率：

抑制率=（T样品-T空白）/T样品*100%

注：空白组用25uL磷酸缓冲液(pH=7.6)代替25uL样品溶液。当样品组的吸光度值达到跟空白组一致时即为样品终点。