菌种划种LB琼脂平板检查标准操作规程
琼脂平板测定法
琼脂平板测定法1. 简介琼脂平板测定法是一种常用的微生物检测方法，用于定量测定液体中微生物的数量。
其原理是将待测样品与含有琼脂的培养基混合，然后将混合液倒入琼脂平板中，在适当条件下培养微生物，通过观察生长的菌落数量来估计样品中的微生物数目。
琼脂平板测定法广泛应用于食品、饮料、药品等领域，以及环境监测和医疗卫生等领域。
它具有操作简便、结果可靠、灵敏度高等优点，并且可以同时检测多种不同类型的微生物。
2. 实验步骤2.1 准备工作•清洁实验台面和仪器设备，消毒操作区域。
•准备所需材料：琼脂平板、待测样品、无菌移液器、无菌试管、无菌培养皿等。
•配制适当的琼脂培养基，并进行无菌处理。
2.2 样品处理•将待测样品进行适当的预处理，如稀释、均匀搅拌等。
•取适量的样品，使用无菌移液器将其滴入无菌试管中。
2.3 倒平板•将琼脂培养基加热至液态状态，并保持在适宜的温度。
•将琼脂培养基倒入无菌培养皿中，约15-20ml左右。
•等待琼脂培养基凝固。
2.4 涂布样品•将待测样品与琼脂培养基混合均匀。
•将混合液倒入凝固的琼脂平板中。
•使用无菌棉签或针头，在平板表面上均匀地涂布样品。
•注意避免压力过大，以防止伤害琼脂平板表面。
2.5 培养•将涂布好的琼脂平板倒置放置于恰当的培养条件下（如适宜的温度、湿度等）。
•根据需要选择不同的培养时间和环境条件。
2.6 菌落计数•在适当的时间后，观察琼脂平板上的菌落生长情况。
•使用无菌计数器或放大镜进行菌落计数。
•记录菌落数量并进行统计分析。
3. 实验注意事项•操作过程中要保持严格的无菌操作，避免样品受到外界污染。
•遵守实验室安全规范，使用个人防护装备。
•注意培养条件的控制，如温度、湿度等。
•注意样品的合适稀释，以确保在合适范围内进行菌落计数。
•记录实验过程中的操作细节和结果，以备后续分析和验证。
4. 实验结果分析通过琼脂平板测定法得到的结果可以用于估计待测样品中微生物的数量。
根据菌落数量和相应的标准曲线或经验值，可以确定样品中微生物的含量是否符合相关标准要求。
菌种划种LB琼脂平板检查标准操作规程
菌种划种LB琼脂平板检查标准操作规程菌种划种LB琼脂平板检查标准操作规程依据：《中华人民共和国药典》2005年版第三部。
范围：适用于大肠杆菌表达的重组人基因工程产品。
目的：检查该菌种的菌落形态是否与标准大肠杆菌菌落形态一致，并检查是否染有杂菌。
原理：将该菌种在LB琼脂平板上划线分离培养，以检查菌落形态以及是否染有杂菌。
内容：1 材料1．1 材料1．1．1 菌种：PBV888/DH5α，来源于主种子批或工作种子批。
1．1．2 注射用水：符合《中华人民共和国药典》2005年版的要求。
1．1．3 药品氯化钠 NaCl 分析纯琼脂粉分析纯酵母粉蛋白胨无水乙醇 CH3CH2OH 分析纯1．1．4 器皿平皿、三角烧瓶（3L）、量筒（1L）、玻棒、试剂瓶。
1．1．5 其它材料线绳、牛皮纸、硫酸纸、剪刀、接种环、煤气灯。
1．2 仪器设备生物安全台Ⅱ级A型安徽蚌埠净化设备厂恒温培养箱 HG303-5B型湖北省黄石市医疗器械厂扭力天平 TN-100B型上海第二天平厂2 方法2．1 准备工作2．1．1 生产环境：在十万级洁净间进行。
场地摘下“清场合格”标志牌，挂“使用中”标志牌。
2．1．2 器皿的洁净要求玻璃器皿经洗刷组处理完毕后，用硫酸纸及牛皮纸包好，用线绳系紧，送高压灭菌（121.3℃60分钟）。
脱脂棉用硫酸纸、牛皮纸包好，高压灭菌121.3℃60分钟。
2．1．3 调试仪器设备2．1．3．1确认扭力天平运行状态良好，已挂有“备用”标志牌。
2．1．3．2确认恒温培养箱运行状态良好已挂有“运行”标志牌。
2．1．3．3确认生物安全台运行状态良好已挂有“备用”标志牌。
2．2 溶液的配制2．2．1 LB琼脂培养基的配制1000ml摘下扭力天平“备用”标志牌，挂上“运行”标志牌。
用扭力天平称取酵母粉5克，蛋白胨10克，NaCl 10克，琼脂粉20克，倒入三角烧瓶中，加注射用水1000ml，用玻棒搅匀，分别用硫酸纸、牛皮纸包口，用线绳扎紧，标明名称、配制时间， 115.6℃30分高压灭菌。
平板菌落计数法的步骤
平板菌落计数法是一种常用的微生物计数方法，通过稀释液体样品、平铺在琼脂平板上、培养和计数菌落数量，可以确定原液中微生物的浓度。
这种方法可以应用于食品、环境和医药等领域的微生物数量测定，为微生物研究和质量控制提供了重要的手段。
平板菌落计数法的基本步骤如下：
1、准备无菌的培养基、试管、吸管、平皿、酒精灯等器材，以及待测的样品和适合的稀释液（如无菌水或盐水）。
2、将样品制成一系列的稀释液，通常采用10倍递增的稀释法，即每次取1mL的上一级稀释液加入9mL的稀释液中，充分混匀，得到下一级稀释液。
3、从每个稀释液中分别取出一定量（如0.1mL或1mL）置于灭菌平皿中，与已熔化并冷却至45℃左右的琼脂培养基混合，或者涂抹在已凝固的琼脂培养基上，使菌液均匀分布于培养基内。
4、在一定的温度下，培养一定的时间（通常为24至48小时），使菌液中的单个细胞生长繁殖成可见的菌落。
5、从每个平皿中计数菌落数量，选择菌落数在30至300之间的平皿，用计数器或计数板辅助计数，避免重复或遗漏。
6、根据计数结果和稀释倍数，计算原液中的菌落数量和浓度，通常用每毫升或每克的活菌数（CFU/mL或CFU/g）表示。
菌种检定操作规程
菌种检定操作规程
《菌种检定操作规程》
一、目的
菌种检定操作规程旨在规范菌种检定过程，确保检定结果准确可靠，保障实验室菌种质量。
二、适用范围
本规程适用于各类实验室对菌种进行检定的操作。
三、设备和试剂
1. 必备设备：无菌工作台、培养箱、平板计数器等。
2. 必备试剂：琼脂培养基、生理盐水、甘油等。
四、菌种检定操作流程
1. 取样准备：将待检菌种进行悬浮液制备或直接取样，保证单一菌种在接种时的质量。
2. 培养基接种：将取样溶液均匀涂敷于琼脂培养基表面，将琼脂培养基放入培养箱进行培养。
3. 孵化：将接种后的琼脂培养基置于培养箱中，进行相应的温度和时间的培养。
4. 菌落计数：使用平板计数器对菌落进行计数，记录结果。
5. 结果分析：根据计数结果，对菌种进行鉴别和鉴定。
五、结果确认与报告
1. 只有经过两名以上实验人员的确认，结果方可出具。
2. 将检定结果填写在检定记录表上，并进行备份存储。
六、质量控制
1. 定期对实验室设备和试剂进行检验、校正。
2. 定期进行内部质量控制，对检定结果进行复核和比对。
七、附则
1. 对于异常情况的处理：出现异常结果时，要及时进行排查并记录处理过程。
2. 本规程未尽事宜，由实验室主管负责进行详细规定。
以上即为《菌种检定操作规程》的内容，希望各实验室严格按照此规程进行菌种检定工作，确保实验室菌种质量及检定结果的准确性。
平板保存菌种的方法
平板保存菌种的方法引言在微生物学研究中，保存菌种是非常重要的一项工作。
菌种的保存能够确保菌种的长期保持活性和纯度，为后续的实验提供可靠的菌种来源。
平板保存是一种常见且有效的保存菌种的方法，本文将介绍平板保存菌种的具体步骤和注意事项。
方法准备培养基平板保存菌种需要使用适合菌种生长的培养基。
常用的培养基包括琼脂糖平板、LB平板等。
首先，准备培养基的原材料，并按照相应比例配制培养基。
然后，在适当的温度下煮沸培养基，使其溶解均匀。
最后，将培养基倒入培养皿中，待其凝固。
菌种分离从原始菌株中分离需要保存的菌种。
首先，将菌株转移到液体培养基中进行扩增培养。
然后，将液体培养物均匀涂布在已经凝固的平板上。
使用火焰灭菌的铁环将液体培养物均匀涂布在平板表面。
最后，用无菌的铁环在平板上划出菌落并进行标记。
培养菌种将涂有菌落的平板置于适宜的温度下进行培养。
根据菌种的要求设置合适的培养条件，如温度、湿度和光照等。
一般来说，大部分菌种需要在25-37摄氏度下培养。
在培养过程中要注意观察菌落的生长情况，包括颜色、形态和大小等。
菌种保存当菌落生长到合适的大小时，可以开始进行菌种的保存。
首先，用无菌的微量吸管将菌落挑取到保存管中，并加入适量的保存液。
保存液的选择根据菌种的特性而定，可以选择生理盐水、液体培养基或甘油等。
然后，将保存管进行封闭，以防止空气和外界细菌的污染。
最后，将保存管标记清楚，包括菌种名称、保存日期和保存条件等。
保存条件菌种的保存条件对于保持菌种的活力和纯度非常重要。
常用的保存条件有两种：冰箱保存和低温冻存。
冰箱保存一般在4摄氏度下进行，适合于较短时间的保存，一般保存3个月以内。
低温冻存一般在-80摄氏度下进行，适合于长期保存，可以保存数年甚至数十年不变异。
为了确保菌种的保存质量，应定期检查保存菌种的生长情况，并定期更换保存液。
注意事项1. 严格遵守无菌操作规范，防止外界细菌的污染。
2. 选择合适的培养基和保存液，根据菌种的特性进行选择。
双歧杆菌实验操作
双歧杆菌实验操作双歧杆菌是一种对人体有益的细菌，它能帮助消化、增强免疫系统以及维持身体健康。
为了了解双歧杆菌的生长和培养条件，进行了以下实验操作。
实验名称：双歧杆菌的培养和生长条件研究实验目的：探究双歧杆菌的最佳生长和培养条件，为后续研究提供基础。
实验材料：1.LB琼脂平板和培养基2.双歧杆菌培养液3.双歧杆菌菌株4.灭菌剂5.培养皿6.培养瓶7.石棉网8.无菌吸管9.无菌培养箱实验步骤：1.准备工作a.所有实验器材要进行高温高压灭菌处理，确保无菌条件。
b.双歧杆菌菌株从冻存物中取出，置于LB琼脂平板上，37℃恒温培养箱中培养过夜。
c.同时准备LB琼脂平板，在培养箱中恒温保持。
2.建立原始菌种a.从培养过夜的LB琼脂平板上选取一个单独的菌落，用无菌吸管轻轻吸取，均匀涂布于另一个LB琼脂平板表面。
b.将新的LB琼脂平板颠倒放置于培养箱中，37℃恒温培养24小时。
c.检查平板上是否有单独的菌落，若有则进行后续实验。
3.建立培养液a.准备LB培养基，加入适量的琼脂，煮沸溶解后静置至37℃。
b.预测双歧杆菌菌株的生长曲线，选择合适的培养液和培养时间。
c.将适量的培养液倒入无菌培养瓶中，盖上无菌瓶盖，并用石棉网覆盖。
4.培养和生长a.在培养液中加入适量的双歧杆菌菌株，以达到适合培养的细菌浓度。
b.将培养瓶置于37℃恒温培养箱中。
c.每天监测双歧杆菌的生长情况，记录菌株的数量和培养液的浑浊度。
5.结果分析a.观察双歧杆菌的生长情况，包括生长速度、最适生长温度和最适培养液pH值。
b.对实验数据进行统计分析，绘制生长曲线和生长速率图。
c.比较不同因素对双歧杆菌生长的影响，并得出结论。
实验注意事项：1.所有实验用具和培养基要进行高温高压灭菌处理。
2.在操作过程中要保持无菌环境，避免外界细菌的污染。
3.严格遵守实验室安全规范，避免接触到有害物质。
4.在实验过程中要定期检查和记录双歧杆菌的生长情况，以便后续分析和对比。
菌种鉴定标准操作规程
菌种鉴定标准操作规程目的：建立菌种鉴定标准操作规程范围：适用于******鉴定标准操作职责：内容：1整体操作步骤1.1纯化、分离待鉴定菌用接种环挑取待鉴定菌落或少许含菌溶液到相应的培养基上（如TSA），划线分离，以出现微生物单菌落为止。
1.2挑取纯化后的单菌落，进行革兰染色、镜检，以确定待鉴定菌的革兰属性。
1.3如镜检结果为革兰阴性杆菌，则先进行发酵实验。
如发酵实验结果为阴性，则选用API20NE试剂条进行鉴定；如发酵实验结果为阳性，则在经过细胞色素氧化酶实验后选用API20E试剂条进行鉴定。
1.4如镜检结果为革兰阳性球菌，则先进行过氧化氢酶实验。
如实验结果为阴性则选用API Strep试剂条进行鉴定，如实验结果为阳性则选用API Staph试剂条进行鉴定。
1.5假如镜检结果为革兰阳性杆菌并且有内生芽胞，则选用API 50CHB试剂条进行鉴定；否则，根据运动性实验和过氧化氢酶实验结果选用API Coryne或其他试剂条进行鉴定。
1.6选定正确的试剂条以后，根据不同的API试剂条的标准操作规程准备接种物，进行接种、培养等操作并将结果形成数码，用API鉴定软件鉴定或查询待检菌的名称均可。
鉴定结果应记录，必要时，给出相应解释。
2革兰氏染色2.1染色剂的配制2.1.1结晶紫染色液：甲液：结晶紫 1.0g95%的酒精20ml乙液：草酸铵0.8g水80ml将甲液和乙液混合均匀，静置48h使用，置密闭棕色瓶中储存。
2.1.2碘液：碘 1.0g碘化钾 2.0g水300ml配制时先用3～5ml水将碘化钾溶解，再加入碘，用力摇匀，使之全部溶解后，再加水稀释至300ml，摇匀，分装在棕色瓶中储存。
2.1.3稀石碳酸红溶液:碱性品红 1.0g石碳酸 5.0ml95%乙醇10.0ml配制时用乙醇溶解碱性品红，然后加入石碳酸溶液，使用时加水稀释至100ml，摇匀。
2.2操作:2.2.1涂片：用接种环挑取液体培养物中菌体在载玻片上涂成薄层，固体培养物则先在载玻片上滴一滴蒸馏水或生理盐水，用接种环挑取少量菌体在载玻片上涂成薄层。
琼脂检验操作规程
琼脂检验操作规程琼脂检验是一种常用的微生物检测方法，用于确定食品、水源、药物等样品中的细菌和真菌的存在及其数量。
下面是琼脂检验的操作规程，请参考。
一、实验前的准备工作1.检验琼脂的质量：检查琼脂的生产日期、有效期等信息，确保琼脂的质量符合要求。
2.器皿准备：将所需的琼脂培养基倒入试管或培养皿中，覆盖好，灭菌处理。
二、样品处理1.选取样品：根据要检测的目标细菌或真菌的特点，选择适当的样品。
如食品样品应选取有疑似污染的部分。
2.样品处理：对于液体样品，按照一定比例将样品加入琼脂培养基中，并均匀摇匀。
将固体样品加入适量的无菌蒸馏水，用均匀器均匀悬浮。
如有必要，可进行稀释。
三、平板接种法1.器皿准备：将培养基恢复至饱和状态，加热至55~60℃，然后均匀倒入培养皿中，覆盖好，使其凝固。
2.接种：取少量处理好的样品，在无菌工作台上，用无菌（或经过消毒处理的）铁钻，分次刺入琼脂中，在琼脂表面扩散。
3.培养：即刻培养接种好的琼脂培养皿，依样品不同分别在适当的温度和时间下培养。
四、管内接种法1.器皿准备：将培养基恢复至饱和状态，并倒入试管中，一定量，高度不超过试管的1/32.接种：取少量处理好的样品，通过无菌长管（或乳针）将样品加入琼脂中，然后迅速倒置，使培养基液体均匀悬浮。
3.培养：接种完毕后，将试管紧闭，放入适当的温度和时间下培养。
五、菌落计数及结果判定1.计数：培养结束后，将琼脂培养皿或试管放在反照镜下观察，记录生长的菌落的数量。
如需要，可以通过放大镜观察。
2.结果判定：根据琼脂培养基上生长的菌落形态、颜色、大小等特征，结合相关文献资料，对菌落进行鉴定，并判定样品是否合格。
六、结果记录和处理1.记录：将菌落数量和相关信息记录在实验记录表格中。
2.处理：根据结果，对菌落数量和污染程度进行评估，如果样品被检测出细菌或真菌，应及时采取相应措施，消除污染。
琼脂检验是一项重要的微生物检测方法，操作规程的严谨与准确性直接关系到检测结果的可靠性。
琼脂检验操作规程
琼脂检验操作规程琼脂是一种常用的实验室试剂，主要用于细菌感受性试验和其他生物学实验。
以下是琼脂检验的操作规程。
1.准备试剂和设备:a.准备所需的琼脂培养基和琼脂悬浮液。
b.准备所需的细菌培养物和生物样品。
c.检查琼脂培养基和琼脂悬浮液的有效日期和存储条件。
d.准备所需的培养皿和培养棒等操作设备。
2.准备琼脂培养基:a.将琼脂培养基按照说明书中的配方制备，确保所有成分均匀溶解。
b.加热琼脂培养基至沸腾，搅拌以防止结块。
c.将琼脂培养基倒入无菌培养皿中，每个培养皿大约倒入2-3毫升。
d.确保琼脂培养基充分凝固。
3.准备琼脂悬浮液:a.按照说明书中的配方制备琼脂悬浮液。
b.筛选悬浮液以去除可能存在的固体颗粒。
c.将悬浮液倒入无菌试管中，每个试管大约倒入1-2毫升。
4.接种细菌培养物:a.取一小部分细菌培养物，并用无菌环或无菌棉签尽可能均匀地涂抹在琼脂培养基上。
b.用无菌深培养棒将琼脂悬浮液刺入琼脂培养基中，以培养真菌或厌氧生物。
5.孵育:a.将培养皿和试管标记好，并放置在适当的温度下，通常为37摄氏度。
b.根据需要，可以选择不同的培养时间，一般为24-48小时。
6.观察和分析:a.检查琼脂培养基上的细菌菌落的形态、大小、颜色等特征。
b.根据琼脂培养基上的菌落特征，进行初步鉴定和分类。
c.根据需要，可以进行进一步的生物学检验，如抗生素敏感试验、溶血试验等。
7.结果记录和分析:a.记录每个培养皿和试管上的菌落特征和观察结果。
b.分析不同样品或不同条件下的菌落形成数量和特点的差异。
c.根据结果进行数据分析和统计，得出结论。
8.实验废物处理:a.将使用过的培养皿和试管经过高温高压灭菌处理，以防止病原菌传播。
b.负责处理琼脂实验废物的人员应遵循实验室的废物处理规定。
9.清洁和消毒:a.完成实验后，要及时清洗和消毒使用过的器具和实验台面。
b.使用合适的清洁剂和消毒剂进行清洁和消毒，并按照实验室的规定进行处理。
以上是琼脂检验的操作规程，合理、规范地进行琼脂检验，有助于确保实验结果的准确性和可靠性。
保健食品原料用菌种安全性检验与评价技术指导原则(2020年版)
保健食品原料用菌种安全性检验与评价技术指导原则（2020年版）1 范围本指导原则规定了保健食品原料用细菌、丝状真菌（子实体除外）和酵母的安全性评价中的致病性（毒力）检验与评价程序和方法。
本指导原则适用于保健食品原料用菌种（包括保健食品配方用及原料生产用菌种）的致病性检验与评价。
本指导原则不适用于基因改造微生物菌种和在我国无使用习惯的菌种致病性检验与评价。
2 术语和定义2.1 致病性，Pathogenicity微生物感染宿主造成健康损害引起疾病的能力。
2.2 产毒能力，Toxigenicity微生物产生对人和动物有毒作用的活性代谢产物的能力。
2.3 毒性，Toxicity微生物及其代谢产物对机体可能造成的潜在伤害（不良反应）。
3 对拟评价微生物菌种需提交的基本资料要求在进行致病性评价试验前，菌种送检单位需提供以下资料供评价单位审核。
3.1 基本信息拟评价菌种名称（包括学名、俗名、曾用名、拉丁名等）、来源及用途。
3.2 菌种分类学资料提供由有菌种鉴定资质的机构出具的对拟评价菌种的规范、科学的分类学（属、种名称及株）资料。
细菌的分类和命名应遵循原核生物分类学国际委员会（International Committee on Systematics of Prokaryotes）的规定，并符合原核生物国际命名法规（International Code of Nomenclature of Prokaryotes）要求。
真菌的分类和命名应按国际藻类、真菌和植物命名法规（International Code of Nomenclature for algae, fungi, and plants）进行。
3.3 菌种鉴定资料根据目前已有的知识，提供基于表型及基因测序技术鉴定到种水平的资料。
作为保健食品的功效成分（活菌），还应提供鉴定到株水平的资料。
3.4 菌种生长环境条件资料提供拟评价菌种生长最适培养基及培养条件（培养时间、培养温度和湿度、光照等），以及菌种保藏及复壮方法等相关资料。
琼脂检验操作规程
目的：建立琼脂检验操作规程,使检验操作规范化。
范围：琼脂的检验。
责任人：QC员、QC主管。
内容：1性状1.1线形琼脂呈细长条状，类白色或淡黄色；半透明，面表面皱缩，微有光泽，质轻软而韧，不易折断；完全干燥后，则脆而易碎；无，味淡。
1.2粉状琼脂为鳞片状粉末，无色或淡色；用冷水装置，在显微镜下观察，为无色的不规则多角形黏液质碎片；无，味淡。
1.3本品在沸水中溶解，在冷水中有溶，但能膨胀成胶块状；水溶液显中性反应。
2鉴别2.1取本品约1g加水65ml煮沸，不断搅拌使溶解，用热水补足蒸散的水分，放冷至32~39℃即凝结成半透明有弹性的凝胶状物，热至85℃时复融化。
2.2取本品的碎片，浸入0.02mol/L碘溶液中，数分钟后，染成棕黑色，取出，加水浸渍后渐变紫色。
2.3取本品约0.1g，加水20ml，加热使溶解；取出4ml，加盐酸0.5ml，置水浴上加热30分钟，加入氢氧化钠试液3ml及碱性酒石酸铜试液6ml，置水浴中加热，即生成红色沉淀。
3检查3.1淀粉取本品0.10g，加水100ml，煮沸溶解后，放冷，加碘试液2滴，不得显蓝色。
3.2干燥失重取本品（如为条状，应剪碎），在105干燥5小时，减失重量不得过22%。
琼脂检验操作规程编号ZL-C-302版次：01第 2 页共 2 页3.3灰分取本品约1g，置炽灼至恒重的坩锅中，精密称定，缓缓炽灼至完全炭化时，逐渐升高温度至600~700℃，使完全灰化并恒重，遗留灰分不得过5.0%3.4水中不溶物取本品1.5g，置烧杯中，加水使成200ml，煮沸使溶解，趁热用105℃恒重的3号垂溶玻璃坩锅滤过，烧杯用热水分数次洗涤，滤过，滤渣在105℃干燥至恒重，遗留残渣不得过15mg（1.0%）。
3.5吸水力取本品5.0g，置100ml量筒中，加水使成100ml，搅匀，在25℃静置24小时，经湿润的玻璃棉滤入另一量筒中，滤液的总量不得过75ml。
噬菌体双层平板法操作规程
噬菌体双层平板法操作规程1. 引言噬菌体双层平板法是一种常用的微生物实验方法，用于检测和计数环境中的细菌数量。
该方法利用噬菌体对细菌的寄生作用，形成双层平板，通过观察菌落的形成来进行计数和鉴定。
本文将介绍噬菌体双层平板法的操作规程。
2. 实验所需材料和试剂•LB琼脂培养基•LB液体培养基•目标细菌菌种•噬菌体溶液•加热灭菌器•平板培养皿•称量器具3. 实验步骤3.1 准备工作1.准备好所需材料和试剂，检查其完整性和有效期。
2.将LB琼脂培养基按照规定配制好，并加热至完全溶解。
3.将LB液体培养基按照规定配制好。
3.2 制备平板培养基1.取一定量的配制好的LB琼脂培养基，倒入平板培养皿中，待琼脂凝固。
3.3 细菌接种1.随机选取一支功能良好的细菌培养基，用无菌胶头棉签沾取一小块菌落。
2.在平板培养基的表面连续均匀涂抹菌落，使用一般的“来回”涂抹法。
3.重复上述步骤，将要检测的不同细菌菌种在不同的平板培养基上涂抹。
3.4 噬菌体接种1.取一支已知浓度的噬菌体溶液，用无菌加头棉签沾取一小滴。
2.在相应的细菌涂抹平板上滴加噬菌体溶液，待其完全吸收。
3.5 双层平板培养1.将已接种噬菌体的平板培养皿在室温下倒置放置，并标记。
2.将未接种噬菌体的平板培养皿在室温下正常放置，并标记。
3.6 培养和观察1.将已接种噬菌体的平板培养皿和未接种噬菌体的平板培养皿分别放入37° C恒温培养箱中培养。
2.每过一段时间（如24小时）拿出平板培养皿观察，并记录菌落的数量和形态特征。
4. 结果和分析根据观察到的菌落数量和形态特征，可以进行细菌计数和鉴定。
未接种噬菌体的平板培养皿上菌落数量代表细菌的总数，已接种噬菌体的平板培养皿上菌落数量代表剩余可感染的细菌数量。
通过比较两者的差异，可以估算噬菌体的感染效果。
5. 注意事项1.所有操作必须在无菌条件下进行，避免细菌的污染。
2.使用无菌胶头棉签时，每次接种前必须在无菌火焰中消毒。
微生物培养及保藏标准操作规程
1. 目的规范微生物使用及保藏的相关操作，避免二次污染。
2. 范围适用于企业内所有微生物的使用及保藏3. 职责微生物保管人员负责保藏，质量监督员监督执行情况。
4. 内容4.1培养基需经验证合格后准许使用，使用前需灭菌。
4.2质检菌种的培养及菌种保藏4.2.1大肠埃希菌，金黄色葡萄球菌，枯草芽孢杆菌，白色念珠菌的活化及培养固体平板法：选用适用细菌培养的培养基（如：LB培养基；营养琼脂培养基等）灭菌。
酒精灯旁打开融化的无菌培养基瓶口，在酒精灯火焰上通过2~3次后，打开无菌平皿上盖，在酒精灯火焰上在开口处灼烧2~3次，将培养基到入平皿中，盖上平皿上盖，水平放在超净台上冷却完全凝固后使用。
每次倒平板尽量将培养基到完，并及时放回冰箱4℃保存。
点燃酒精灯，酒精灯外焰灼烧接种针（环），烧至通红，冷却后，在酒精灯旁用接种针（环）轻轻挑取待活化的菌种，进行划线培养。
待长出单菌落，挑取单菌落进行液体振荡培养过夜。
平板制备示意图菌种划线培养示意图4.2.2黑曲霉的培养黑曲霉的培养选择马铃薯葡萄糖培养基，将土豆洗净去皮，切成小块，加入水煮沸20min 后，纱布过滤，清液中加入琼脂粉加热溶解后加入葡萄糖。
待葡萄糖溶解后，分装在试管中，塞上管塞，高压蒸汽灭菌后，将试管摆斜面等凝固后接种使用。
接种时用接种环挑沾取黑曲霉孢子，并在试管斜面上由内向外划波浪线。
接种完毕后塞回试管塞并在霉菌培养箱中进行培养，一般5-7天长出孢子。
孢子长出后，放置在4℃冰箱中保藏。
斜面固体培养基的制备接种环的灼烧示意图试管斜面的接种示意图4.2.3菌种的保藏菌种保藏可分为液体甘油保藏及试管斜面保藏。
大肠埃希菌，金黄色葡萄球菌，枯草芽孢杆菌，白色念珠菌都采用甘油菌保藏法。
黑曲霉孢子悬液可做甘油保藏。
甘油保藏：接种环灼烧冷却后，挑取单菌落进行过夜增值培养16-18h。
移液器吸取1ml 新鲜培养物于1.5ml离心管中，4500r/min常温离心5min，弃上清。
挑选可疑菌落的操作方法
挑选可疑菌落的操作方法挑选可疑菌落是微生物学实验中的一项重要操作，通常是为了鉴定和鉴别某种微生物。
下面我将详细介绍挑选可疑菌落的操作方法。
1. 实验器材准备：- 培养基：根据实验需要选择合适的富营养培养基，例如营养琼脂平板、LB 平板等。
- 培养皿：选择生物无菌培养皿或塑料培养皿。
- 锥状棉签：用于采集菌落样品。
- 火焰消毒设备：如酒精灯或微生物灭菌器，用于消毒棉签。
- 显微镜：用于观察菌落形态。
- 无菌移液枪或无菌移液管：用于接种培养基。
2. 实验操作步骤：(1) 准备工作台和实验器材：清洁工作台并将所需的实验器材消毒，保持无菌环境。
(2) 选取可疑菌落：使用无菌的锥状棉签从培养皿中点取可疑菌落，突破菌落表面薄膜，避免将周围无关菌落一同拔起。
(3) 感染棉签：将挑取的菌落接触到无菌液体培养基上，便于后续的菌落鉴定和鉴别。
(4) 感染培养基：将感染的棉签均匀涂抹在培养基上，可以选择平板法、涂布法等方法。
(5) 重复操作：如果实验需要，可以重复步骤2至步骤4，以提高采样的准确性和可靠性。
(6) 孵育培养基：将培养皿盖好，以适当的温度和湿度条件孵育，通常为37C，孵育时间根据菌种而定。
(7) 观察菌落：经过适当的培养时间后，用肉眼或显微镜观察菌落的形态特征，如形状、色素、大小等。
(8) 挑选可疑菌落：根据预先设定的鉴定标准，挑选出与正常菌落不同或有可疑特征的菌落。
(9) 复菌：将挑选的可疑菌落挑取到新的培养基上进行复菌，以确保纯培养。
(10) 鉴定和鉴别：根据可疑菌落的形态特征、生理生化反应、遗传特征等进行鉴定和鉴别。
3. 实验注意事项：(1) 保持无菌操作：实验过程中要保持无菌操作，避免外界微生物污染。
(2) 鉴定标准制定：根据实验目的和需要，制定明确的鉴定标准，以便准确挑选可疑菌落。
(3) 观察时间和培养条件：菌落的形态特征受到培养时间和培养条件的影响，一般需要经过一定的孵育时间才能进行准确观察和挑选。
标准菌种确认标准操作规程完整
一目的建立标准菌种确认标准操作规程，以减少菌种污染和生长特性的改变，保证实验结果的可靠性和准确性。
二围本规程适用于质量控制实验室所用标准储藏菌株。
三容1.1 试验菌株大肠埃希菌〔Escherichia coli〕[CMCC(B)44102]金黄色葡萄球菌〔Staphylococcus aureus〕[CMCC(B)26003]枯草芽孢杆菌〔Bacillus subtilis〕[CMCC(B)63501]白色念珠菌〔Candida albicans〕[CMCC(F)64941]黑曲霉〔Aspergillus niger〕[CMCC(F)98003]铜绿假单胞菌〔Pseudomonas aeruginosa〕[CMCC(B)10104]生孢梭菌〔Clostridium sporogenes〕[CMCC(F)98001]标准菌株.1 标准菌株应来自认可的国或国外菌种收藏机构。
.2 标准菌株经过复活并在适宜的培养基中生长后，即为标准储藏菌株。
.3 标准储藏菌株应进展纯度和特性确认。
工作菌株.1 标准储藏菌株可用于制备每两个月或定期转种的工作菌株。
.2 工作菌株的传代次数应严格控制，不得超过5 代〔从菌种收藏机构获得的标准菌株为第0代〕，以防止过度的传代增加表型变化的风险。
因此必要时，应对工作菌株的纯度和特性进展确认。
1.2 菌种确认试验的主要容菌种的纯度确认.1 纯度检测：是指通过适当的方法检测菌种是否为纯培养物。
.2 试验容①菌落形态：在特定的培养基上，将待检测培养物稀释涂布或平板划线，适宜培养后，同一平板上的单菌落的大小、形状、颜色、质地、光泽等是否相似；对于两种或以上形态的出发菌株，应再分别挑取单菌落划线或稀释涂布培养，检测是否重复出现一样特征。
②镜检特征：对数生长期的培养物革兰氏染色反响应呈现一致性；细胞形状、大小、荚膜、芽孢等特征应相似。
菌种的特性确认.1 生化试验：各种微生物具有各自的独特的酶系统，因而在代过程中所参与的物质分解和合成代的产物也不同，这些代产物又具有不同的生化特征。
菌种划线平板标准操作规程
菌种划线平板标准操作规程菌种划线平板是一种常用的微生物学实验方法，主要用于菌种的分离和纯化。
为了保证实验的准确性和结果的可靠性，需要按照一定的操作规程进行操作。
如果存在多个菌种，则需准备相应数量的平板。
2. 准备培养基：根据菌种的生长特性选择合适的培养基，并按照菌种需求配制。
常用的培养基包括营养琼脂、肉汤葡萄糖琼脂平板等。
3. 准备培养器具：清洁培养皿、培养管、移液器、吸球等，并对其进行高温高压灭菌处理，确保无菌。
4. 暴露培养器具：开盖的培养皿、培养管等暴露在空气中易被细菌污染，使用前需进行烧烤消毒。
5. 准备菌种：选择需要划线的菌种，将其提取到无菌环境下，用吸液器或移液器进行分装，分装至不同的培养皿中。
二、实验操作步骤1. 消毒操作台：将操作台表面擦拭，用75%酒精喷洒，待酒精挥发后进行紫外线照射消毒，照射时间约15-30分钟。
2. 划线操作：将已经配制好的培养基倒入无菌平板中，使其均匀分布，待其固化后（约15-30分钟），开始划线。
(1) 布置待划线的培养平板：将待划线的培养平板放在炉盘或搁板上，不要弄湿培养平板。
(2) 取菌种：取一支已分装好的菌种，用吸球或移液器吸取适量的菌液，然后轻轻地均匀涂抹于培养平板上。
(3) 用划线针划线：用消毒的划线针，在培养平板上进行划线操作。
先将划线针消毒，再从菌液中取菌，然后从培养皿的一个角划至另一个角，最后将划线针消毒。
(4) 过程控制：整个划线操作应迅速、准确，并且尽量避免划重叠线。
3. 清理操作台：划线操作完成后，用75%酒精擦拭操作台表面，然后喷洒消毒液，待其挥发后，注意再次使用紫外线照射消毒。
三、实验后的处理工作1. 培养平板的封存：将培养平板进行密封，避免外界细菌的污染。
可使用透明胶带或锡纸进行包裹。
2. 培养平板的保存条件：将密封好的培养平板放入恒温培养箱中，设定适当的温度（如37℃），使其进行培养。
3. 培养结果的观察和分析：经过一定时间的培养后，观察培养平板上的菌落情况，分析并鉴定相应的菌种。
细菌培养注意
复苏平板划线培养挑单菌落中试管扩增摇瓶扩增1.复苏：根据所培养的细菌选择适宜的培养基，大部分细菌在LB培养基中在超净工作台先用1毫升左右的适宜的培养基溶解冷冻菌，然后转移到10毫升中试管（放入4毫升液体培养基）中，一般在37摄氏度摇床静止或低转速培养12小时或者过夜（温度取决于所培养的细菌适宜生长的温度）。
2.平板划线培养：在平板（琼脂+液体培养基）划线，放37摄氏度培养箱培养箱中倒置培养6小时~12小时，在平板上观察是否形成了单菌落.3. 挑单菌落：在超净台中挑选典型单菌落，置入10毫升中试管（内有5毫升液体培养基）中，在37摄氏度摇床，转速200转培养12小时或者过夜，肉眼能看到试管浑浊。
4.按照1：20的比例将中试管中的菌液移到250毫升三角瓶（放入100毫升液体培养基），，培养条件同前。
注意：所有的接种操作均需要在层流罩中，培养基应无菌。
IPTG对细胞有一定毒性，使细胞几乎不怎么复制，而是表达产生大量蛋白在公司买的菌，拿到菌液以后还要在LB液体培养基上培养目的是拿回来要先活化一下，菌类时间长了活性就差了，有时候会发生活化不了的现象，所以保存的菌种要定期活化，防止丢失。
如果是构建的载体，最好保存质粒，菌种有时候会变异。
要在LB液体培养基上培养目的或为扩大培养抽质粒。
因为氨苄青霉素是一种抗生素，可能导致大肠杆菌的代谢途径发生变化，所以产生了绿色代谢物。
IPTG虽然能诱导蛋白表达，但对菌体有一定毒性，因此最佳使用浓度在0.3~0.5mM，而且是在接种1~2小时后加入为好。
接种到含100μg/ml Amp的LB冷平板上。
将平板倒置入37℃恒温培养箱培养过夜目的是什么筛选具有抗AMP的菌株AMP—氨苄西林(Ampicillin的缩写),是一种抗生素.为广谱半合成青霉素，毒性极低。
抗菌谱与青霉素相似，对青霉素敏感的细菌效力较低，对草绿色链球菌的抗菌作用与青霉素相仿或略强。
对白喉杆菌、破伤风杆菌和放线菌其效能基本和青霉素相同。
实验室菌种管理规程
实验室菌种管理规程目的：保证菌种合理、有效地使用和保存，最大限度降低变异率，确保菌种的溯源性与稳定性，保证实验室和社会的生物安全。
职责：主管负责菌种的出入库保管、保存、分发，组员负责菌种的确认、传代、使用及销毁。
范围：本规程适用于实验室菌种的管理，包括菌种的保存、传代、使用及销毁等。
1 菌种的保存工作用菌种的保存工作用菌种采用平板低温保存法。
将菌种接种在适宜的固体培养基上，待菌生长充分以后，转移至2～8℃冰箱中保存。
此法仅用于工作用菌种的短期保存，并应随时检查其污染杂菌和变异等情况，发现异常情况，经应灭活处理后销毁。
保存时间为1周，超过该期限前挑取单菌落重新于琼脂平板划线活化，若菌落活力下降则从-80℃冰箱中取用甘油冷冻管。
传代用菌种的保存采用甘油冷冻管保藏法。
甘油冷冻管保存法用无菌接种环轻轻刮平板上的单菌落并接种至适宜的液体培养内，置于适宜的培养条件下培养，菌液充分振荡后取适宜体积加入到已灭菌的冷冻管内，再加入等体积的无菌甘油（浓度40%），即为20%甘油菌悬液，轻轻振摇，使内容物充分混合，在-80℃冷冻条件下保存，保存期限为3年。
每个菌株保存至少30个无菌冷冻管。
使用时，取出一支放至室温，接种增菌培养或接种至琼脂平板复苏，挑取纯菌落传代或工作用。
2 菌种的传代工作用菌种的传代当工作用菌种代数小于5时，在规定保存期限内，可直接用上一代工作用菌种转接下一代工作用菌种。
取在冰箱2～8℃保存的工作用菌种用普通琼脂平板传代，并将新传代的培养物替代原有的菌种，作为工作用菌种。
也可取用“甘油冷冻管保藏法”保存的菌种，进行复苏，直接作为工作用菌种。
菌种每1周传代一次，当超过5代，须用“甘油冷冻管保藏法”保存的原始菌种传代。
传代用菌种的传代首先划线接种确认，根据日常检验工作的需要量，挑取纯菌落转接平板，作为工作用菌种；同时，结合菌种的代数和最长保存期限，挑取纯菌落制成菌悬液，按“”的方法制备甘油冷冻管数支，作为传代用菌种。
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菌种划种LB琼脂平板检查标准操作规程
菌种划种LB琼脂平板检查标准操作规程
依据：《中华人民共和国药典》2005年版第三部。
范围：适用于大肠杆菌表达的重组人基因工程产品。
目的：检查该菌种的菌落形态是否与标准大肠杆菌菌落形态一致，并检查是否染有杂菌。
原理：将该菌种在LB琼脂平板上划线分离培养，以检查菌落形态以及是否染有杂菌。
内容：
1 材料
1．1 材料
1．1．1 菌种：PBV
888/DH
5α
，来源于主种子批或工作种子批。
1．1．2 注射用水：符合《中华人民共和国药典》2005年版的要求。
1．1．3 药品
氯化钠 NaCl 分析纯
琼脂粉分析纯
酵母粉
蛋白胨
无水乙醇 CH
3CH
2
OH 分析纯
1．1．4 器皿
平皿、三角烧瓶（3L）、量筒（1L）、玻棒、试剂瓶。
1．1．5 其它材料
线绳、牛皮纸、硫酸纸、剪刀、接种环、煤气灯。
1．2 仪器设备
生物安全台Ⅱ级A型安徽蚌埠净化设备厂
恒温培养箱 HG303-5B型湖北省黄石市医疗器械厂扭力天平 TN-100B型上海第二天平厂
2 方法
2．1 准备工作
2．1．1 生产环境：在十万级洁净间进行。
场地摘下“清场合格”标志牌，挂“使用中”标志牌。
2．1．2 器皿的洁净要求
玻璃器皿经洗刷组处理完毕后，用硫酸纸及牛皮纸包好，用线绳系紧，送高压灭菌（121.3℃60分钟）。
脱脂棉用硫酸纸、牛皮纸包好，高压灭菌121.3℃60分钟。
2．1．3 调试仪器设备
2．1．3．1确认扭力天平运行状态良好，已挂有“备用”标志牌。
2．1．3．2确认恒温培养箱运行状态良好已挂有“运行”标志牌。
2．1．3．3确认生物安全台运行状态良好已挂有“备用”标志牌。
2．2 溶液的配制
2．2．1 LB琼脂培养基的配制1000ml
摘下扭力天平“备用”标志牌，挂上“运行”标志牌。
用扭力天平称取酵母粉5克，蛋白胨10克，NaCl 10克，琼脂粉20克，倒入三角烧瓶中，加注射用水1000ml，用玻棒搅匀，分别用硫酸纸、牛皮纸包口，用线绳扎紧，标明名称、配制时间， 115.6℃30分高压灭菌。
2．2．2 75%酒精溶液1000ml
取750ml无水乙醇，加注射用水定容1000ml，混匀，装入试剂瓶中，贴标签，标明液体名称、浓度、配制日期，室温备用。
2．3操作步骤
2．3．1 摘下生物安全台“备用”标志牌，挂上“运行”标志牌。
用75%酒精棉擦拭台内，接通电源，打开风机，无菌风吹30分钟，待已灭菌LB琼脂培养基冷却至50℃左右，倒平板，每皿20-30ml，待凝固后，放入恒温培养箱中，37℃倒置培养24小时，如无杂菌生长，即可继续实验用。
2．3．2 划线分离：用接种环（经火焰灭菌，冷却后）取1环菌种于LB平板上划线分离。
2．3．3 将划线分离的平板置于37℃恒温培养箱中培养24小时。
2．3．4操作结束后，场地摘下“使用中”标志牌，挂上“待处理”标志牌。
3 结果判定
3.1判定标准：菌落形态如为圆形，湿润、光滑，中等大小（直径约2-3mm），即为典型大肠杆菌菌落。
3.2判定结果
判定结果经二人复核后，填写检定记录，注明菌种名称、批号、判定日期、检定结果、工作者及复核者等。
4清场
4．1 配液清场
4．1．1 药品称量之后，将药品瓶盖紧，放回原处。
4．1．2 将扭力天平处理干净，放回原处。
摘下“运行”标志牌，挂上“备用”标志牌。
并填写使用记录。
4．1．3生物安全台内用75%酒精棉擦拭干净，继续吹10分钟后，关闭风机，切断电源，摘下“运行”标志牌，挂上“备用”标志牌，并填写使用记录。
4．1．4操作台面用专用抹布擦干净。
4．2 操作清场
4．2．1 将带有细菌的LB平板送高压灭菌（121.3℃60分钟），灭菌后将平皿内容物倒入垃圾桶中。
4．2．2 玻璃器皿用纯化用水冲洗干净，送本室洗刷组处理。
4．2．3清场合格后，由车间工序负责人或质量监督员检查合格后，摘下“待处理”标志牌，“清场合格”标志牌，并填写清场记录。
5注意事项
5．1清场时，必须将带有细菌的平板先送高压灭菌处理后再送到洗刷组处理。
5．2所有工作均应二人复核，并填写工作记录。