菌种划种LB琼脂平板检查标准操作规程

菌种划种LB琼脂平板检查标准操作规程

菌种划种LB琼脂平板检查标准操作规程

依据：《中华人民共和国药典》2005年版第三部。

范围：适用于大肠杆菌表达的重组人基因工程产品。

目的：检查该菌种的菌落形态是否与标准大肠杆菌菌落形态一致，并检查是否染有杂菌。原理：将该菌种在LB琼脂平板上划线分离培养，以检查菌落形态以及是否染有杂菌。

内容：

1 材料

1．1 材料

1．1．1 菌种：PBV

888/DH

5α

，来源于主种子批或工作种子批。

1．1．2 注射用水：符合《中华人民共和国药典》2005年版的要求。1．1．3 药品

氯化钠 NaCl 分析纯

琼脂粉分析纯

酵母粉

蛋白胨

无水乙醇 CH

3CH

2

OH 分析纯

1．1．4 器皿

平皿、三角烧瓶（3L）、量筒（1L）、玻棒、试剂瓶。1．1．5 其它材料

线绳、牛皮纸、硫酸纸、剪刀、接种环、煤气灯。

1．2 仪器设备

生物安全台Ⅱ级A型安徽蚌埠净化设备厂

恒温培养箱 HG303-5B型湖北省黄石市医疗器械厂扭力天平 TN-100B型上海第二天平厂

2 方法

2．1 准备工作

2．1．1 生产环境：在十万级洁净间进行。场地摘下“清场合格”标志牌，挂“使用中”标志牌。

2．1．2 器皿的洁净要求

玻璃器皿经洗刷组处理完毕后，用硫酸纸及牛皮纸包好，用线绳系紧，送高压灭菌（121.3℃60分钟）。脱脂棉用硫酸纸、牛皮纸包好，高压灭菌121.3℃60分钟。

2．1．3 调试仪器设备

2．1．3．1确认扭力天平运行状态良好，已挂有“备用”标志牌。

2．1．3．2确认恒温培养箱运行状态良好已挂有“运行”标志牌。

2．1．3．3确认生物安全台运行状态良好已挂有“备用”标志牌。

2．2 溶液的配制

2．2．1 LB琼脂培养基的配制1000ml

摘下扭力天平“备用”标志牌，挂上“运行”标志牌。用扭力天平称取酵母粉5克，蛋白胨10克，NaCl 10克，琼脂粉20克，倒入三角烧瓶中，加注射用水1000ml，用玻棒搅匀，分别用硫酸纸、牛皮纸包口，用线绳扎紧，标明名称、配制时间， 115.6℃30分高压灭菌。

2．2．2 75%酒精溶液1000ml

取750ml无水乙醇，加注射用水定容1000ml，混匀，装入试剂瓶中，贴标签，标明液体名称、浓度、配制日期，室温备用。

2．3操作步骤

2．3．1 摘下生物安全台“备用”标志牌，挂上“运行”标志牌。用75%酒精棉擦拭台内，接通电源，打开风机，无菌风吹30分钟，待已灭菌LB琼脂培养基冷却至50℃左右，倒平板，每皿20-30ml，待凝固后，放入恒温培养箱中，37℃倒置培养24小时，如无杂菌生长，即可继续实验用。

2．3．2 划线分离：用接种环（经火焰灭菌，冷却后）取1环菌种于LB平板上划线分离。

2．3．3 将划线分离的平板置于37℃恒温培养箱中培养24小时。

2．3．4操作结束后，场地摘下“使用中”标志牌，挂上“待处理”标志牌。

3 结果判定

3.1判定标准：菌落形态如为圆形，湿润、光滑，中等大小（直径约2-3mm），即为典型大肠杆菌菌落。

3.2判定结果

判定结果经二人复核后，填写检定记录，注明菌种名称、批号、判定日期、检定结果、工作者及复核者等。

4清场

4．1 配液清场

4．1．1 药品称量之后，将药品瓶盖紧，放回原处。

4．1．2 将扭力天平处理干净，放回原处。摘下“运行”标志牌，挂上“备用”标志牌。并填写使用记录。

4．1．3生物安全台内用75%酒精棉擦拭干净，继续吹10分钟后，关闭风机，切断电源，摘下“运行”标志牌，挂上“备用”标志牌，并填写使用记录。

4．1．4操作台面用专用抹布擦干净。

4．2 操作清场

4．2．1 将带有细菌的LB平板送高压灭菌（121.3℃60分钟），灭菌后将平皿内容物倒入垃圾桶中。

4．2．2 玻璃器皿用纯化用水冲洗干净，送本室洗刷组处理。

4．2．3清场合格后，由车间工序负责人或质量监督员检查合格后，摘下“待处理”标志牌，“清场合格”标志牌，并填写清场记录。

5注意事项

5．1清场时，必须将带有细菌的平板先送高压灭菌处理后再送到洗刷组处理。

5．2所有工作均应二人复核，并填写工作记录。