植物组织培养-外植体的选择与建立资料讲解
外植体选择的原则
外植体选择的原则外植体选取的原则是什么?1、选择优良的种质无论是离体培养繁殖种苗，还是进行生物技术研究，培养材料的选择都要从主要的植物入手，选取性状优良的种质或特殊的基因型。
对材料的选择要有明确的目的，具有一定的代表性，以提高成功的几率，增加其实用价值。
2、选择健壮的植株选取发育正常的器官或组织，再生能力强，组培易成功。
组织培养用的材料，最好是从生长健壮的无病虫的植株上选取发育正常的器官或组织。
因为这些器官或组织代谢旺盛，再生能力强，培养后比较容易成功。
此现象可能是由于外植体内部的植物激素水平能够在接种后得以维持所致。
3、选择适宜的部位植物组织培养几乎在植物体的各个部位都获得了成功，这些部位包括茎尖、茎段、皮层及维管组织、髓细胞、表皮、块茎的储藏薄壁细胞、花瓣、根、茎、子叶、鳞茎、胚珠和花药等。
但是不同种类的植物以及同一植物的不同器官对诱导条件反应是不一致的，有的部位诱导分化率高，有的部位很难脱分化，或者再分化频率很低。
4、选择适当的时期组织培养选择材料时，要注意植物的生长季节和生长发育阶段，对大多数植物而言，应在其开始生长或生长旺季采样，此时材料内源激素含量高，容易分化，不仅成活率高，而且生长速度快，增殖率高。
若在生长末期或已进入休眠期时采样，则外植体可能对诱导反应迟钝或无反应。
花药培养应在花粉发育到单核靠边期取材，这时比较容易形成愈伤组织。
百合在春夏季采集的鳞茎、片，在不加生长素的培养基中，可自由地生长、分化；而其他季节则不能。
叶子花的腋芽培养，如果在1～2月采集，则腋芽萌发非常迟缓；而在3～8月采集，萌发的数目多，萌发速度快。
对于大多数植物而言，应在其生长季节开始时采样。
在生长末期或已进入休眠期时取样，外植体可能对诱导反应迟钝或无反应，较难成活。
5、考虑器官的生理状态和发育年龄一般认为，生理年龄小的幼嫩组织较生理年龄大的成熟衰老组织具有较高的形态发生能力。
随着组织年龄的增加，器官的再生能力逐渐减弱甚至完全失去再生能力。
第四章 外植体的选择、消毒和接种
接种材料预处理:
(1)接种材料预培养 (2)就地套袋 (3)接种材料修整 (4)冲洗
接种前准备:
1
2
3
456外植体 Nhomakorabea毒:外植体剪切:
1.叶片0.5cm×0.5cm 2.微茎尖0.2-0.5mm 3.带节茎段0.5-1.0cm 4.芽丛分离
六、外植体的褐变及其防止措施
褐变
• 褐变是指外植体在培养过程中体内的多 酚氧化酶被激后活，使细胞内的酚类物质 氧化成棕褐色醌类物质，这种致死性的褐 化物不但向外扩散致使培养基逐渐变成褐 色，而且还会抑制其他酶的活性，严重影 响外植体的脱分化和器官分化，最后变褐 而死亡的现象
影响褐变的因素
• 植物种类：一般木本植物，单宁、色素含量 高的植物易发生褐变 。
(6)接种时，接种员双手不能离开工作台，不能说话、走动和 咳嗽等；
(7)接种完毕后要清理干净工作台，可用紫外灯灭菌30min。 若连续接种，每5天要大强度灭菌一次。
接种前外植体消毒顺序:
第三节 培养条件
在植物组织培养中温度、光照、湿度等各种环境条 件，培养基组成、ＰＨ值、渗透压等各种化学环境条件 都会影响组培苗的生长和发育。
污染的原因及其预防措施
1、污染：植物组织培养 过程中培养基和培养材 料滋生杂菌，导致培养 失败的现象
2、污染的原因 • 一是病原菌污染（细菌、
真菌） • 二是外植体、培养基、
培养器皿带菌 • 三是操作人员未遵守操
作规程。
真菌污染
污染的预防措施
组织培养中降低污染率是工厂化生产中不可忽 视的技术环节。预防措施有： • 防止材料带菌------选择取材时间、材料与培养、 外植体灭菌等措施； • 防止用具带菌------器皿与金属器械灭菌； • 操作室要处于无菌状态------工作室、培养室灭菌 等； • 操作人员要按照操作程序进行。 • 在培养基中加入抗菌素 • 分散接种
组培苗生产技术—外植体的选择、处理与接种(植物组织培养课件)
3、蔬菜（龙牙百合） 龙牙百合特征:鳞茎，无皮，广卵形，外部鳞片长,将整个鳞茎 包裹，直径5~15厘米，白色，茎高90厘米左右，直立茎上叶 多而散生，披针形，叶色从浓绿，光滑。花单生茎顶。花朵 呈喇叭状长筒形，白色，有清香。
不能损伤组织材料，保持外植体的生活力，使外 植体在良好的培养条件下很快恢复生机，正常 生长和繁殖.
• 消毒剂的要求 • 要求：具有良好的消毒作用，既不会杀死植物的
组织细胞，又易被无菌水冲洗掉，不影响消毒后 外植体的生长和分化.
常用灭菌药剂的使用和效果
灭菌剂 使用浓度（%） 清除的难易 消毒时间 效 果
2、茎段（采用嫩茎的切段促进腋芽萌发，取材容易） 3、叶（幼嫩叶片组织通过愈伤组织或不定芽分化产生植株，
取材容易，操作方便，但易发生变异）； 4、花球和花蕾 5、种子、根、块根、块茎、花瓣等。
（二）实例分析 1、花卉（非洲菊） • 常用茎尖、嫩叶、花托进行非洲菊的组织培养，也有利用
种子进行组织培养的。 • 茎尖培养操作麻烦，但对于脱毒苗的生产是最有效的。 • 花托培养可直接成苗， 既可保持种性，又易行、 耗时短，是首选的外植体。
• 首先要选择花大、花色艳丽、市场流行的品种，然后再选 择无病虫害、植株生长健壮、花色纯正的优良品种单株进 行取材。
• 一旦选出优株后，应进行挂牌标记，并一直在其上采取花 蕾。作为外植体的花蕾要选取直径在1㎝左右，而且未露 心的小花蕾，太大或是太小的花蕾均不能获得满意的效果 。
2、水果（草莓）
（1）选择结果性优良的草莓母株上新抽出的匍匐茎作外植体，以每年6～7 月份最为适宜。
龙牙百合的许多器官、组织都可作为外植体， 如鳞片、花梗、叶片、茎尖、腋芽、花瓣、花托 、花丝、花药、胚、子房、根尖等，其中采用鳞 片作外植体的较多。
植物组织培养的完整过程
植物组织培养的完整过程1.选择适宜的母体植物：选择具有优良性状和抗病虫害能力的母体植物，从中选择健康的叶片、茎段等组织作为外植体。
2.外植体的准备：将母体植物采集的叶片或茎段进行无菌处理，去除表面杂菌和泥沙，然后用75%酒精或漂白粉消毒外表。
3.外植体的切割：将无菌环境下的外植体切割成小片，大小约为0.5-1cm，同时尽量保持外植体的干燥，以防止外植体内部水分过多。
4.外植体的接种：将切好的外植体小片接种在含有植物生长激素的无菌培养基上。
培养基通常由无机盐溶液、有机源、糖和植物生长激素等组成，植物生长激素的种类和浓度会影响到后续培养过程中的分化和增殖。
5.分化：外植体接种到培养基后，会经历分化阶段，外植体的组织逐渐增殖和分化为不同种类的细胞，形成生长点。
6.增殖：通过定期的次级培养，子培养、分生器、病毒消除等手段，将外植体中的细胞不断分化和增殖，以便大量生产幼苗。
7.再分化：经过增殖后的外植体，可以再次进行分化，形成茎尖、腋芽或花蕾等器官，以便进一步培养和繁殖。
8.根的诱导：在合适的培养条件下，外植体可以诱导生成根系，这是为了使外植体脱离体外培养环境，继续生长的必要步骤。
9.移栽：当幼苗的根系已经发达足够，可以将外植体移栽到含有适宜营养成分的固体培养基上或直接移植到土壤中，进行实地管理和生长。
10.过程控制：在整个培养过程中，要控制好环境条件，例如温度、湿度和光照等，以保证培养的成功率。
11.病毒清除：植物组织培养中经常伴随着病毒感染问题，可以通过不同的方法对外植体和培养基进行检测和清除，以保证获得健康的植株。
总的来说，植物组织培养是一个复杂的过程，需要严格的无菌操作和合适的培养条件。
它广泛应用于植物的繁殖、遗传改良、新品种选育以及病毒和细菌的清除工作中，对推动植物学研究和农业生产具有重要的意义。
外植体的选择与培养ppt课件
(6)接种工具随时蘸95%酒精灼烧，避免交叉污染；
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(7)接种完毕后要清理干净并用70%酒精擦工作台。 完整版课件
第三节 外植体的选择与培养
（二） 外植体培养
外植体培养：指把培养材料放在培养室里，使之 生长，分裂和分化形成愈伤组织或进一步分化 成再生植株的过程。
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第三节 外植体的选择与培养
除细胞分裂素，有利生根，提高成活率
3、无机盐浓度：适当降低 4、加入少许活性炭 5、控制好移栽前10天的光、温、湿环境因子 6、使试管苗从无菌向有菌逐渐过渡
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第1章 植物组织培养实验室 构建及操作技术
本章小结：
(1) 常用的培养基：①MS培养基；②B5培养基；③ White培养基；④N6培养基；⑤KM-8P培养基。
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第三节 外植体的选择与培养
五、培养过程中常出现的问题 及解决方法
污染
褐变
组织培养三大难题
玻璃化现象
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第三节 外植体的选择与培养
（一）污染
1、污染原因 细菌污染 真菌污染
真菌污染
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第三节 外植体的选择与培养
2、污染的预防措施
(1)减少或防止材料带菌 (2)外植体灭菌要彻底 (3)玻璃器皿和金属器皿的灭菌 (4)布质制品的灭菌 (5)无菌室的消毒 (6)操作人员一定要严格按照无菌操作的程序进 行接种。
(2)接种前15-20min，打开超净工作台的风机以及台上 的紫外灯；
(3)接种员先洗净双手，在缓冲间换好专用实验服，及拖 鞋等；
(4)上工作台后，用酒精棉球擦拭双手。然后70%酒精喷 雾降尘，并擦拭工作台面；
植物组织培养实用技术
3、继代培养
1）分离小鳞茎培养 选择直径达到0.5cm大小的小鳞茎，用镊子将
其轻轻剥离，置于增殖培养基中。
把原来的鳞片重新转到新鲜的诱导培养基上继续诱导 小鳞茎，小鳞茎还会在其他的部位产生，整个生长周 期可以延续5~6个月。
小鳞茎继代培养30天左右可增殖1~2倍。开始是在 鳞茎基部产生小鳞茎，40天左右小鳞茎长大，形成丛鳞 茎。小鳞茎慢慢抽出新芽，然后形成小植株。此时可把 丛芽切割继续培养增殖。
消毒步骤 ①用洗涤灵水溶液洗去材料表面的油质 ②用70％的乙醇浸泡数秒以除去表面的蜡质
③用3％的次氯酸钠溶液 浸泡消毒15～30min，然 后用无菌水冲洗3次
三、外植体的原代培养
把芽放在解剖镜下，无菌条件下，用镊子、刀 片、解剖针等工具把芽外面的幼叶和叶原基除 去，使生长点暴露。用利刀切下含有1～2个叶 原基，大小为０.5mm的生长点。
4、增重培养
直径达到1cm以上即可进行生根培养，对于达不到此 标准的小鳞茎，接种到增重培养基中，在此种培养基 上，小鳞茎较少长叶而明显增重。
如果能采用液体振荡培养，则增重效果更佳。一般转 速设为110r/min。是否可以进行浅层液体静置培养， 尚需试验。
五、试管苗的生根与练苗
将丛生的试管芽切成单株，接种在1/2MS+IBA 0.5mg/L+活性炭0.5%生根培养基上，7天后芽 基部开始形成根尖。慢慢伸长成辐射状白色的小 根。20天后根长达7~10cm，基部稍膨大。温度 设置为25~28℃，光照强度为1500Lx．每天给 予10~12h光照。
40天左右发育成球状的可见鳞片的小鳞茎。
四、龙牙百合的继代培养
大田培植
鳞茎
原代培养 形回顾
原代培养 形成再生芽
植物组织培养 组培苗生产技术外植体的选择处理与接种护理课件
ห้องสมุดไป่ตู้湿度
保持培养环境湿度适宜， 以防止培养基干燥和外植 体失水。
培养过程中的观察与记录
定期观察外植体的生长状 况，包括颜色、质地、生 长速度等，并记录观察结 果。
观察外植体是否有异常表 现，如病变、死亡或生长 异常等，及时采取相应措 施。
记录外植体的生长曲线， 以便了解其生长动态和规 律。
培养过程中的问题处理
污染问题
如发现外植体受到微生物污染， 应及时采取措施，如更换培养基、
增加消毒频率等。
褐化问题
外植体褐化是常见的现象，可以通 过添加抗氧化剂、调整培养基成分 等方法减轻褐化程度。
玻璃化现象
玻璃化是指培养中的植物组织出现 半透明状的现象，可以通过降低激 素浓度、增加培养基湿度等方法进 行改善。
外植体的繁殖与移栽
生根过程
无根苗在生根培养基上生长，经过细胞分裂和分 化形成根原基，进而发育成完整的根系。
移栽前的准备
在生根培养过程中，需要对外植体进行适当的炼 苗处理，以适应外界环境，提高移栽成活率。
移栽与驯化
移栽是将培养好的组培苗从培养 容器中取出，移植到自然环境中 的过程。
移栽后的管理：保持适宜的光照、 温度、湿度和水分条件，及时除 草、防治病虫害，促进组培苗健 康生长。
外植体的接种
无菌操作技 术
操作前准备
在操作前，需要对外植体进行彻底清洗，去除表面的污垢 和微生物。同时，操作人员需要对手部进行消毒，确保无 菌操作。
灭菌处理 外植体需要进行严格的灭菌处理，以消除附着在表面上的 微生物。常用的灭菌方法包括使用酒精、次氯酸钠或氯化 汞等消毒剂。
接种环境
接种环境需要保持无菌状态，通常在超净工作台或无菌室 内进行。同时，接种工具也需要进行消毒处理，避免交叉 污染。
植物组织培养
植物组织培养重点名词解释：1、植物组织培养：是指在无菌和人工控制的环境条件下，利用适当的培养基，对离体的植物器官、组织、细胞及原生质体进行培养，使其再生细胞或完整植株的技术。
又称为植物离体培养2、外植体（explant）：用于离体培养的那部分植物器官、组织或细胞。
3、愈伤组织（callus）：是指外植体因受伤或在离体培养时，其细胞进行活跃的分裂增殖而形成的一种无特定结构和功能的组织。
4、离体生态学（in vitro ecology）：是指研究离体培养环境条件控制的科学，其研究对象是培养基、植物材料和人工环境条件。
5、植物细胞全能性（totipotency）：是指任何携带完整遗传信息的植物活细胞都具有表达其所有遗传信息的能力，能够发育成完整的植株。
胞需经过脱分化和再分化过程才能表现其全能性。
6、脱分化（dedifferentiation）：成熟细胞或分化细胞转变为分生状态（即形成愈伤组织）的过程。
7、再分化（redifferentiation）：成熟细胞或分化细胞脱分化转变为愈伤组织后重新分化成异质细胞的过程。
8、植物茎段培养是指对植物的带有一个以上定芽或不定芽的外植体（包括块茎、球茎、鳞茎在内的幼茎切段）进行离体培养的技术。
9、茎尖培养（shoot tip culture or apical meristem culture）是指对植物顶端的原分生组织和它衍生的分生组织的培养。
10、叶培养的意义：研究叶形态建成、光合作用、叶绿体形成等；叶细胞全能性；原生质体融合；无性繁殖系；诱变育种。
11、离体叶组织发育途径：直接产生不定芽，由愈伤组织产生不定芽，胚状体和其他。
12、植物器官培养是指对植物某一器官的全部或部分或器官原基进行离体培养的技术。
13、植物胚胎培养是指对植物的胚、胚乳、胚珠和子房等进行离体培养，使其发育成完整植株的技术。
包括：胚培养、胚乳培养、胚珠培养以及子房培养。
14、胚乳培养是指将胚乳组织从母体上分离出来，通过离体培养，使其发育成完整植株的技术15、胚珠培养是将胚珠从母体分离出来，无菌条件下让其进一步生长发育，使其形成植株的技术。
植物组织培养实务--外植体的选择与消毒
植物组织培养实务--外植体的选择与消毒1、外植体的选择外植体是指植物组织培养中的各种接种材料。
从理论上讲，植物细胞都具有全能性，能够再生新植株，任何器官、任何组织、单个细胞和原生质体都可以作为外植体。
但实际上，不同品种、不同器官之间的分化能力有巨大差异，培养的难易程度不同。
为保证植物组织培养获得成功，选择合适的外植体是非常重要的。
（1）选择优良的种质及母株无论是离体培养繁殖种苗，还是进行生物技术研究，培养材料的选择都要从主要的植物入手，选取性状优良的种质、特殊的基因型和生长健壮的无病虫害植株。
尤其是进行离体快繁，只有选取优良的种质和基因型，离体快繁出来的种苗才有意义，才能转化成商品；生长健壮无病虫害的植株及器官或组织代谢旺盛，再生能力强，培养后容易成功。
（2）选择适当的时期组织培养选择材料时，要注意植物的生长季节和生长发育阶段，对大多数植物而言，应在其开始生长或生长旺季采样，此时材料内源激素含量高，容易分化，不仅成活率高，而且生长速度快，增殖率高。
若在生长末期或已进入休眠期时采样，则外植体可能对诱导反应迟钝或无反应。
花药培养应在花粉发育到单核靠边期取材，这时比较容易形成愈伤组织。
百合在春夏季采集的鳞茎、片，在不加生长素的培养基中，可自由地生长、分化；而其他季节则不能。
叶子花的腋芽培养，如果在1月至翌年2月间采集，则腋芽萌发非常迟缓；而在3-8月间采集，萌发的数目多，萌发速度快。
（3）选取适宜的大小培养材料的大小根据植物种类、器官和目的来确定。
通常情况下，快速繁殖时叶片、花瓣等面积为5mm2，其他培养材料的大小为0.5~1.0cm。
如果是胚胎培养或脱毒培养的材料，则应更小。
材料太大，不易彻底消毒，污染率高；材料太小，多形成愈伤组织，甚至难以成活。
（4）外植体来源要丰富为了建立一个高效而稳定的植物组织离体培养体系，往往需要反复实验，并要求实验结果具有可重复性。
因此，就需要外植体材料丰富并容易获得。
（5）外植体要易于消毒在选择外植体时，应尽量选择带杂菌少的器官或组织，降低初代培养时的污染率。
植物组织培养的基本技术与设施
（三）几种外植体的灭菌方法
1、茎尖、茎段及叶片等的消毒 ➢消毒前要经自来水较长时间的冲洗。 ➢消毒时要用70%的酒精浸泡数秒，无菌水冲洗2～3次，然后用2%～ 10%的次氯酸钠溶液浸泡10～25min，若材料有茸毛最好在消毒液中 加入几滴吐温-80，或者用0.1％～0.2％升汞浸泡消毒5～10分钟消毒 后，用无菌水冲洗3次后方可接种。
➢入无菌室前，要洗手。l%新洁尔灭溶液内5分钟 ➢入室时要穿上经过消毒的工作服、帽子、口罩和鞋子等。 ➢操作前要用70%酒精擦洗手，操作中要经常用酒精擦洗手。不准 讲话，以免微生物污染材料、培养基和用具。每次重新操作都要把 工具在火焰上消毒。 ➢必须在酒精灯火焰处进行操作，如打开瓶口，转接材料。盖瓶盖 前应将瓶口在火焰上烧一下，再将盖子也在火焰上烧一下，然后盖 上。
（二） 外植体灭菌的一般步骤
1．预处理，先对植物组织进行修整，去掉不需要的部分，将 准备使用的植物材料在流水中冲洗干净。经过预处理的植物材 料，其表面仍有很多细菌和真菌。
2．将植物组织块置于一个有丝盖的玻璃瓶中，注入75%的酒 精溶液埋没材料，浸泡10S左右。倒出酒精，用无菌水冲洗一次。
3. 将适当浓度的消毒液(0.1%升汞或2%次氯酸钠)(含有几滴活 化剂Tween20或Tween 80)，使材料完全浸没在消毒液中，盖 上盖，把玻璃瓶置入超净工作台灭菌一定时间。在灭菌期间须 把玻璃瓶摇动2～3次。 4．消毒处理后，将瓶盖打开，将消毒液倒出，注入适量的无 菌蒸馏水，再盖上盖，摇动数次，将水倒掉，重复3～4次。
行灭菌？ 5．离体培养的植物材料对光、温、湿度有何要求？
如何调控？ 6. 何谓玻璃化？何谓褐化？如何克服？
第二节 实验室的设计与设备
一、实验室设计
准备间、缓冲室、接种室、培养间 驯化室、温室
第四章——组培外植体的选择及无菌操作
三，组培污染原因和预防措施
1、污染原因 污染是指在组织培养过程中培养基和培养材料滋生
杂菌，导致培养失败的现象。 病原菌：细菌及真菌两大类。
⑴细菌污染特点-菌斑呈黏液状，接种后1-2天发现。 污染途径： 外植体带菌
培养基及器皿灭菌不彻底 操作人员未遵守操作规程
⑵真菌污染的特点-污染部分长有不同颜色的霉菌，接种后3-10天发现。 污染途径： 周围环境不清洁 超净工作台过滤装置失效 培养瓶的口径过大
• 在母株生长旺盛的季节取材，不仅成活率高，而且增殖 率也大。
1.1 外植体的选择对组培成功的影响
3，器官的生理状态和发育年龄
作为外植体的器官，其生理状态和发育年龄直接影响形态发生。一般 情况下，幼年组织比老年组织具有较高的形态发生能力，生理年龄越老的 组织或器官，越接近发育上的成熟，其再生能力逐渐减弱甚至完全失去再 生能力。
括号内为该类型植物使用该种外植体做组织培养的频率
1.1 外植体的选择对组培成功的影响
1，外植体的部位
1.1 外植体的选择对组培成功的影响
1，外植体的部位
对于大多数植物来讲，茎尖是最好的部位，由于其形态已基 本建成，生长速度快，遗传性稳定，也是获得无病毒苗的重 要途径，但茎尖往往受到材料来源的限制，而采用茎段可解 决培养材料不足的困难。
1.1 外植体的选择对组培成功的影响
4，外植体的来源
• 生长在自然环境下的植物 • 有目的地培育在温室控制条件下生长的植物 • 无菌环境下已经过离体培养的植物
自然环境中生长的植株，一般带有微生物，甚至与某些微 生物具有寄生关系，使植株具有内生菌。取自这些植物的外植 体，在培养过程中会有微生物滋生，从而影响培养效果。
已离体培养植株
多数情况下，应尽量使用温室或人工气候室控制培养的植物 材料作为外植体来源，减少培养过程中的微生物感染概率。同时， 生长在控制条件下的植物可以保持培养料间的一致性，提高实验 的可重复性，也便于培养技术的规范。
植物组织培养-外植体的选择与建立
第三节 外植体（培养物）的建立
• 与取样外植体年龄有关： 引起褐化程度的轻重常与取 样外植体组织的年龄有关， 通常是幼龄部位产生褐化 较轻，随着组织的老龄化 而褐化加重。因此，在外 植体接种时常需要剥去鳞 片和大叶片，尤其是以切 取幼嫩的芽尖或切取顶芽 分生组织（或带少量叶原 基）接种更为理想 。
第三节 外植体（培养物）的建立
（5）、内源菌防治： 植物组织培养中对材料只能进行表面灭菌， 而对材料组织内部所带的细菌往往难 以对付。 1. 表面污染与内源污染的区别：
第三节 外植体（培养物）的建立
• 常见内源菌：芽孢杆菌（rod bacteria）为主，尤其是 Bacilus licheniformis 和B.subtilis （“white ghost”）。 真菌中主要是镰刀菌(Fusarium)、轮枝孢菌(Verticillium)、 瓶霉菌(Phialophora)和丝核菌(Rhizoctonia)。 • 内源菌的检测：通常情况下，通过观察培养瓶就可看到 一些污染的迹象；但是对于生长缓慢的细菌或内生菌来 说，仅靠肉眼观察是不够的，必须通过指示培养，即采 用微生物特别容易生长的培养基和培养条件，让外植体 上的微生物快速生长，然后予以鉴定[培养基中加入蛋白 胨（peptone）、胰蛋白胨（trypone）或酵母汁(YE)]。
3 个材料/容器： 污染率=100-（60%）3=78.4% 污染量=100X78.4%=79 获得量= 100X（60%）3= 21 4 个材料/容器： 获得量= 100X（60%）4=13 5 个材料/容器： 获得量= 100X（60%）5=8 • 防止污染的对策： 小容器、多数量、尽量分散、相 互隔离
2、根据母株的年龄和生长发育阶段选择：
年 龄 或 幼 化 程 度
最新组培实验外植体选择处理及接种培养知识讲解
• 2.污染的预防措施
• 发现污染的材料应及时处理，否则将导致培养室环境污染。 对一些特别宝贵的材料，可以取出再次进行更为严格的灭 菌，然后接入新鲜的培养基中重新培养。要处理的污染培 养瓶最好在打开瓶盖前，先集中进行高压灭菌，再清除污 染物，然后洗净备用。现就根据污染途径，阐述污染的几 种预防措施。
常规的表面灭菌处理方法 ①把材料放进75%的酒精中约30～ 60s。 ②用2.5%的CaCl0（次氯酸钙）溶液浸泡15～20min。 ③无菌蒸馏水冲洗3～5次。 ④灭菌时进行摇动，使植物材料与灭菌剂有良好的接触。 ⑤在灭菌剂里滴入数滴0.1%的Tween20（吐温）或Tween80湿润 剂，能增强灭菌效果。
尔敏或75%的酒精擦洗，然后用紫外灯照射约20min。使 用前用75%的酒精喷雾，使空间灰尘落下。一年中要定 期一、二次用甲醛和高锰酸钾熏蒸。 • （7）操作人员在接种时一定要严格按照无菌操作的程 序进行
二、外植体的接种和培养 （一）外植体的接种 （二）外植体的培养
（一）外植体的接种
外植体的接种——是把经过表面消毒后的植物材料切碎 或分离出器官、组织、细胞，并将它们转放到无菌培养 基上的全部操作过程。整个接种过程均须无菌操作。操 作过程中引起的污染，主要由空气中的细菌和工作人员 本身引起的。因此除接种室空气消毒外，应特别注意防 止工作人员本身引起的污染。
常用灭菌药剂的使用和效果
灭菌剂
次氯酸钠 次氯酸钙 漂白粉 氯化汞 酒精 过氧化氢 溴水 硝酸银 抗菌素
使用浓度（%）
2—3 2
饱和浓度 0.1—1 70—75 10—12 1—2
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第二节 外植体（培养物）的选择
1、基因型：
再生能力 （1）、双子叶>单子叶； （2）、被子植物>裸子植物； （3）、双子叶植物中：茄科（Solanacea）；秋海棠
能否有效地控制微生物污染是植物离体培养是否成功的关键技术 之一。对于离体培养的探索性研究实验，污染会导致实验失败； 对于大规模的离体繁殖生产来说，污染使生产成本大大增加。 因此，无论是科研机构还是生产厂家都十分重视微生物污染问 题。
植物离体培养中的污染可分为外植体、培养基、无菌操作和培养 环境四个方面。其中培养基和无菌操作方面的污染，目前已得 到十分有效的控制。外植体方面污染最复杂，也最难控制，其 可能是细菌引起的，也可能是真菌引起的；微生物可能是附生 性的，也可能是内生性的。近年来，国外较重视各种微生物的 鉴定，并根据不同的微生物种类采取相应的控制措施，这方面 的研究进展较快。
第三节 外植体（培养物）的建立
（4）、附生菌控制：
• 采用化学杀菌剂可以有效地杀死附生菌，但是一些较特殊的外植体材料，如密披绒 毛的叶片或幼果、花芽或带苞片的叶芽，附生菌可能潜伏在外植体上，无法彻底清 除。这时，必须采取一些特殊的措施，才能有效控制附生菌。
取材来源：
• 从保护条件下生长的植株上取材，可有效地控制微生物污染。保护条件指温室、培 养箱、生长室等。从温室、培养箱里取材，可有效减少附生菌的群体数量。从栽培 于温室中的植株上取材和从露地取材相比，前者污染率更低。
抑 制 物 质 含 量
时间或季节
第二节 外植体（培养物）的选择
3、根据时间和季节取材
取取材材时时间间
物 质 含 量
抑制物质 生长物质
时间或季节
第二节 外植体（培养物）的选择
具原基结构的外植体：茎尖、 侧芽、原球茎、鳞芽、分生 组织
不具原基结构的外植体：根、 茎、叶、花、果等器官，需要 脱分化。
4、根据母株位置选择：
• 污染估算：首次接种通常污染 率40—60%
按40%计：接种100个材料 1个材料/容器：
污染量=100X40%=40 获得量=100-40=60。 2个材料/容器： 2污染：1X40%X40%=16% 1污染：2X40%X40%=32% 弃掉 2未污染：60%X60%=36% 污染率=100-36=62% 污染量=100X62%=62 获得量=100-62=48
年
龄
或
幼
化 程 度
外 植 体
建
立
母株年龄和幼化程度与外植体建立
阶
段
发
育
外
植
体
建
立
母株阶段发育与外植体建立
第二节 外植体（培养物）的选择
杜鹃花 ‘van Weerden Poelman’
第二节 外植体（培养物）的选择
第二节 外植体（培养物）的选择
3、根据时间和季节取材
生 长 物 质 含 量
时间或季节
第三节 外植体（培养物）的建立
1、主要任务：成功的将外植
体建立在试管中。
2、主要技术环节：
（1）、外植体的选择 （2）、外植体的消毒 （3）、培养基的选择、配制 （4）、外植体消毒与接种
3、关键问题：
（1）、污染（Infection） （2）、褐变（Browning）
第二节 外植体（培养物）的选择
第三节 外植体（培养物）的建立
（1）、产生污染的因素： ①外植体：通常多年生的木本材料比一二年生的草本材料带菌多；
老的材料比幼嫩的带菌多；田间生长的材料比温室的带菌多； 带泥土的材料比清洁的带菌多。一年中以雨季的材料带菌多， 一天中以中午阳光最强时的材料带菌少。 ②培养基：高压蒸汽灭菌的温度、压力、时间和正确使用情况， 以及过滤灭菌中过滤膜孔径、过滤灭菌器械的灭菌处理、过滤 灭菌操作等均影响培养基的灭菌效果。 ③操作环节：接种室是否清洁、干燥、密闭，是否经常用紫外线 灯照射、甲醛熏蒸、70％酒精喷雾杀菌等，操作是否等熟练。 ④培养环境：培养室要求清洁、密闭。每天用70％酒精喷雾除菌、 降尘，每周用少量甲醛熏蒸灭菌。如有空气过滤装置效果更好。 培养室相对湿度太高时，污染加重。
杜鹃花 ‘Rhodoendron’
第二节 外植体（培养物）的选择
2、根据母株的年龄和生长发育阶段选择：
年龄
生长
开花
童年期
转变年期 阶段发育
成年期
第二节 外植体（培养物）的选择
2、根据母株的年龄和生长发育阶段选择：
植株的生长与发育
第二节 外植体（培养物）的选择
2、根据母株的年龄和生长发育阶段选择：
第三节 外植体（培养物）的建立
（2）、污染的防止： • 母株保护：保持母株清洁，减少喷
灌。温室种植，喷施杀菌（虫）剂， 减少病原菌含量。 • 材料选择：选取生长发育健壮，病 虫危害少的材料。 • 严格清洗、消毒与无菌操作。 • 小容器、分散接种。
第三节 外植体（培养物）的建立
（3）、污染估算及对策：
• 所取植株的生长土壤，是组织培养中的一个重要污染源。如果采用温室栽培，事先 应进行土壤灭菌。此外，灌溉水也可能成为污染源。取材于用过滤水和用缄市饮用 水灌溉的植株，前者大大降低了微生物污染.
3 个材料/容器： 污染率=100-（60%）3=78.4%
污染量=100X78.4%=79 获得量= 100X（60%）3= 21 4 个材料/容器： 获得量= 100X（60%）4=13 5 个材料/容器： 获得量= 100X（60%）5=8 • 防止污染的对策：
小容器、多数量、尽量分散、相 互隔离
第二节 外植体（培养物）的选择
第二节 外植体（培养物）的选择
第二节 外植体（培养物）的选择
第二节 植
外
体
植
大
体
小
建
立
4、外植根体据大小外与植外植体体的建立大小选择：
第二节 外植体（培养物）的选择
第三节 外植体（培养物）的建立
4、污染（Infection）
科（Begoniaceae）；景天科（Crassulaceae）； 苦苣苔科（Gesneriaceae）；十字花科（Cruciferae） 再生力特强；郁金香（Tulip）再生力较弱。 （4）、同一种植物中：活体（in vivo）再生力强者， 离体（in vitro）再生力也强。
第二节 外植体（培养物）的选择