菌种的确认标准操作规程
菌种划种LB琼脂平板检查标准操作规程
菌种划种LB琼脂平板检查标准操作规程菌种划种LB琼脂平板检查标准操作规程依据：《中华人民共和国药典》2005年版第三部。
范围：适用于大肠杆菌表达的重组人基因工程产品。
目的：检查该菌种的菌落形态是否与标准大肠杆菌菌落形态一致，并检查是否染有杂菌。
原理：将该菌种在LB琼脂平板上划线分离培养，以检查菌落形态以及是否染有杂菌。
内容：1 材料1．1 材料1．1．1 菌种：PBV888/DH5α，来源于主种子批或工作种子批。
1．1．2 注射用水：符合《中华人民共和国药典》2005年版的要求。
1．1．3 药品氯化钠 NaCl 分析纯琼脂粉分析纯酵母粉蛋白胨无水乙醇 CH3CH2OH 分析纯1．1．4 器皿平皿、三角烧瓶（3L）、量筒（1L）、玻棒、试剂瓶。
1．1．5 其它材料线绳、牛皮纸、硫酸纸、剪刀、接种环、煤气灯。
1．2 仪器设备生物安全台Ⅱ级A型安徽蚌埠净化设备厂恒温培养箱 HG303-5B型湖北省黄石市医疗器械厂扭力天平 TN-100B型上海第二天平厂2 方法2．1 准备工作2．1．1 生产环境：在十万级洁净间进行。
场地摘下“清场合格”标志牌，挂“使用中”标志牌。
2．1．2 器皿的洁净要求玻璃器皿经洗刷组处理完毕后，用硫酸纸及牛皮纸包好，用线绳系紧，送高压灭菌（121.3℃60分钟）。
脱脂棉用硫酸纸、牛皮纸包好，高压灭菌121.3℃60分钟。
2．1．3 调试仪器设备2．1．3．1确认扭力天平运行状态良好，已挂有“备用”标志牌。
2．1．3．2确认恒温培养箱运行状态良好已挂有“运行”标志牌。
2．1．3．3确认生物安全台运行状态良好已挂有“备用”标志牌。
2．2 溶液的配制2．2．1 LB琼脂培养基的配制1000ml摘下扭力天平“备用”标志牌，挂上“运行”标志牌。
用扭力天平称取酵母粉5克，蛋白胨10克，NaCl 10克，琼脂粉20克，倒入三角烧瓶中，加注射用水1000ml，用玻棒搅匀，分别用硫酸纸、牛皮纸包口，用线绳扎紧，标明名称、配制时间， 115.6℃30分高压灭菌。
菌种检定操作规程
菌种检定操作规程
《菌种检定操作规程》
一、目的
菌种检定操作规程旨在规范菌种检定过程，确保检定结果准确可靠，保障实验室菌种质量。
二、适用范围
本规程适用于各类实验室对菌种进行检定的操作。
三、设备和试剂
1. 必备设备：无菌工作台、培养箱、平板计数器等。
2. 必备试剂：琼脂培养基、生理盐水、甘油等。
四、菌种检定操作流程
1. 取样准备：将待检菌种进行悬浮液制备或直接取样，保证单一菌种在接种时的质量。
2. 培养基接种：将取样溶液均匀涂敷于琼脂培养基表面，将琼脂培养基放入培养箱进行培养。
3. 孵化：将接种后的琼脂培养基置于培养箱中，进行相应的温度和时间的培养。
4. 菌落计数：使用平板计数器对菌落进行计数，记录结果。
5. 结果分析：根据计数结果，对菌种进行鉴别和鉴定。
五、结果确认与报告
1. 只有经过两名以上实验人员的确认，结果方可出具。
2. 将检定结果填写在检定记录表上，并进行备份存储。
六、质量控制
1. 定期对实验室设备和试剂进行检验、校正。
2. 定期进行内部质量控制，对检定结果进行复核和比对。
七、附则
1. 对于异常情况的处理：出现异常结果时，要及时进行排查并记录处理过程。
2. 本规程未尽事宜，由实验室主管负责进行详细规定。
以上即为《菌种检定操作规程》的内容，希望各实验室严格按照此规程进行菌种检定工作，确保实验室菌种质量及检定结果的准确性。
菌种鉴定标准操作规程
菌种鉴定标准操作规程目的：建立菌种鉴定标准操作规程范围：适用于******鉴定标准操作职责：内容：1整体操作步骤1.1纯化、分离待鉴定菌用接种环挑取待鉴定菌落或少许含菌溶液到相应的培养基上（如TSA），划线分离，以出现微生物单菌落为止。
1.2挑取纯化后的单菌落，进行革兰染色、镜检，以确定待鉴定菌的革兰属性。
1.3如镜检结果为革兰阴性杆菌，则先进行发酵实验。
如发酵实验结果为阴性，则选用API20NE试剂条进行鉴定；如发酵实验结果为阳性，则在经过细胞色素氧化酶实验后选用API20E试剂条进行鉴定。
1.4如镜检结果为革兰阳性球菌，则先进行过氧化氢酶实验。
如实验结果为阴性则选用API Strep试剂条进行鉴定，如实验结果为阳性则选用API Staph试剂条进行鉴定。
1.5假如镜检结果为革兰阳性杆菌并且有内生芽胞，则选用API 50CHB试剂条进行鉴定；否则，根据运动性实验和过氧化氢酶实验结果选用API Coryne或其他试剂条进行鉴定。
1.6选定正确的试剂条以后，根据不同的API试剂条的标准操作规程准备接种物，进行接种、培养等操作并将结果形成数码，用API鉴定软件鉴定或查询待检菌的名称均可。
鉴定结果应记录，必要时，给出相应解释。
2革兰氏染色2.1染色剂的配制2.1.1结晶紫染色液：甲液：结晶紫 1.0g95%的酒精20ml乙液：草酸铵0.8g水80ml将甲液和乙液混合均匀，静置48h使用，置密闭棕色瓶中储存。
2.1.2碘液：碘 1.0g碘化钾 2.0g水300ml配制时先用3～5ml水将碘化钾溶解，再加入碘，用力摇匀，使之全部溶解后，再加水稀释至300ml，摇匀，分装在棕色瓶中储存。
2.1.3稀石碳酸红溶液:碱性品红 1.0g石碳酸 5.0ml95%乙醇10.0ml配制时用乙醇溶解碱性品红，然后加入石碳酸溶液，使用时加水稀释至100ml，摇匀。
2.2操作:2.2.1涂片：用接种环挑取液体培养物中菌体在载玻片上涂成薄层，固体培养物则先在载玻片上滴一滴蒸馏水或生理盐水，用接种环挑取少量菌体在载玻片上涂成薄层。
不同生物安全级别微生物菌种操作规程
不同生物安全级别微生物菌种操作规程微生物可根据其自身或其所产生的毒素的危害程度分为四个不同的生物安全等级。
对健康成年人（动物）已知无致病作用的微生物的生物安全级别为一级；对人（动物）或环境具有中等潜在危害的微生物的生物安全级别为二级；主要通过呼吸途径使人（动物）传染上严重的甚至是致死疾病的致病微生物（通常已有预防传染的疫苗）的生物安全级别为三级；对人体（动物）具有高度的危险性，通过气溶胶途径传播或传播途径不明，目前尚无有效的疫苗或治疗方法的致病微生物的生物安全级别为四级。
不同生物安全级别微生物菌种的操作，如分离、培养、鉴定和保藏，应在相应生物安全防护的条件下进行。
本规范根据当前国家自然科技资源平台建设的总体要求，结合微生物菌种资源的特点制定，便于在微生物菌种资源的收集、保存、鉴定、评价、研究和利用过程中，尽量避免环境和人员受到微生物本身及其代谢产物的危害，实现菌种资源的高效共享和可持续利用。
不同生物安全级别微生物菌种操作规程1范围本规程规定了微生物生物安全分类标准，以及不同生物安全级别防护级别进行微生物的操作规程。
本规程适用于各菌种保藏单位所保藏的菌种资源的操作，如分离、培养、鉴定和保藏。
2规范性引用文件下列文件中的条款通过本规范的引用而成为本规范的条款。
凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改（不包括勘误内容）或修订版均不适用于本规范，然而，鼓励根据本规范达成的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。
凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本规范。
《病原微生物实验室生物安全管理条例》（国务院第424条令）《兽医实验室生物安全管理规范》（2003年农业部302号公告）WS233-2002微生物和生物医学实验室生物安全通用准则OIE2003国际动物卫生法典WHO《实验室生物安全手册》第二版GB19489-2004《实验室生物安全通用要求》3术语、定义、符号、缩写语3.1一类微生物对个体和群体危害程度高，通常引起人和/或动物严重疫病且暂无有效的预防和治疗措施的致病微生物。
16srrna鉴定菌株的标准操作规程
16srrna鉴定菌株的标准操作规程1. 准备工作：清洗实验室器具、准备培养基和试剂、保持操作环境的无菌状态。
2. 提取细菌样品：从菌落、液体培养基或环境样品中选择一个菌落较纯净的菌株。
使用无菌操作工具，在无菌条件下，用菌液或菌落均匀涂抹于无菌平板上。
3. 培养菌株：将无菌平板培养基转移到适合该菌株生长的培养条件下。
通常情况下，大多数菌株可以在37℃下培养24小时后获得足够的菌量。
4. 提取菌株的16S rRNA基因：使用合适的菌株提取方法提取菌株的总DNA，并使用PCR方法扩增16S rRNA基因。
PCR 反应条件可根据实验室的标准方法或相关文献进行设置。
5. 准备电泳样品：将扩增的16S rRNA基因产物与DNA分子量标记物一同混合，通过琼脂糖凝胶电泳进行分离和检测。
6. 电泳分析：将准备好的电泳样品注入琼脂糖凝胶孔中，进行电泳分析。
根据相对位置和迁移速度，确定16S rRNA基因的大小。
7. 分离目标DNA带：使用无菌操作工具，在琼脂糖凝胶上切割目标DNA带。
8. 提取目标DNA带：使用合适的目标DNA提取方法，从琼脂糖凝胶上提取目标DNA带。
9. DNA序列测定：将提取的目标DNA带进行测序，可以委托测序机构进行测序，也可以使用实验室的测序设备进行测序。
10. 序列分析：使用生物信息学工具对测序结果进行分析，包括序列比对、物种鉴定和进化分析等。
11. 物种鉴定结果的确认：将测序结果与数据库中的已知序列进行比对，确定菌株的物种鉴定结果。
12. 数据和结果的解释：根据测序结果和数据库比对结果进行数据分析和结果解释。
上述是针对16S rRNA基因进行鉴定的一般操作流程，具体操作规程可能因实验室的要求和设备的不同而有所差异。
实施过程中应始终保持无菌操作，确保结果的准确性和可靠性。
微生物菌种、毒株和样本标准操作程序与流程
病原微生物菌（毒）种和样本的标准操作规程流程1．目的：对本实验室菌种、毒种的申购、保存、保管、领用、处理等各个环节实行有效的监督控制，防止意外事故发生，确保疾病预防与控制检验业务及科研教学工作。
2．适用范围及菌种、毒种专职管理人员适用于本科微生物实验室菌种、毒株的管理；菌种、毒种专职管理人员：于瑞芳、侯恩言3．职责①微生物实验室负责菌、毒种的出入库保管、保存及处理等日常管理。
②科室指定2名菌种、毒种库管理人员承担菌、毒种日常管理。
③科室负责人负责一、二类菌、毒种的出入库和向上级索取及对下级发送的审核。
④技术管理层批准本实验室一、二类菌、毒种的出入库和向上级索取及对下级发送的审批。
4．工作程序⑴报送及入库①当微生物实验室检出菌、毒株应及时报送市疾病预防控制中心。
②新发现的菌、毒种，要做好原始记录，逐级报送进行复核确认，报送时须2人参加。
③一、二类菌、毒种入库前，科室审核，技术管理层批准后入库④个人不得擅自保留菌、毒种，必须由科室进行统一编号、登记入库管理⑤菌、毒种入库时， 2名菌、毒种保管人员须认真做好菌毒种的编号、登记工作。
⑵日常管理①保管人员由于瑞芳、侯恩言2名检验人员组成。
②菌、毒种入库时，保管人员应及时验收，统一编号，填写《菌、毒种登记表》③严禁随意将菌、毒种置于非菌、毒种专用保存场所，应做到三专（专室、专柜、专锁）。
④菌、毒种库由2名保管人员双锁管理，铁门与锁必须牢固有效，发现损坏须及时报修。
未经各科室负责人同意，不得擅自将钥匙委托他人代管。
⑤菌、毒种保管人员应定期对库内温度、湿度、通风及冰箱、冰柜等菌、毒种保藏设备运转情况进行检查，并做好记录。
⑥菌、毒种保管人员根据菌、毒种的保存期限，及时通知分管病种的检验人员进行传代，定期鉴定，并详细记录在《菌、毒种登记表》⑦菌、毒种保管人员发现菌、毒种发生变异和死亡，应及时向科室负责人报告，并填写《菌、毒种登记表》。
科室须将变异及死亡的一、二类菌、毒种通报技术管理层。
16SrDNA鉴定菌株的标准操作规程
16SrDNA鉴定菌株的标准操作规程1.适用范围本标准规定了通过特定引物对细菌的16SrDNA片段进行PCR扩增,然后对扩增片段进行序列分析比对，快速获得细菌种属信息的操作规程。
本标准适用于未知细菌的快速种属分析，以及为细菌的生化鉴定提供指导信息。
2.方法和原理16SrDNA鉴定是指用利用细菌16SrDNA序列测序的方法对细菌进行种属鉴定。
包括细菌基因组DNA提取、16SrDNA特异引物PCR扩增、扩增产物纯化、DNA测序、序列比对等步骤。
是一种快速获得细菌种属信息的方法。
细菌rRNA（核糖体RNA）按沉降系数分为3种，分别为5S、16S和23S rRNA.16S rDNA是细菌染色体上编码16S rRNA相对应的DNA序列。
16S rDNA 由于大小适中，约1。
5Kb左右，既能体现不同菌属之间的差异，又能利用测序技术较容易地得到其序列，故被细菌学家和分类学家接受。
在16S rRNA分子中，可变区序列因细菌不同而异，恒定区序列基本保守，所以可利用恒定区序列设计引物，将16S rDNA片段扩增出来，利用可变区序列的差异来对不同菌属、菌种的细菌进行分类鉴定.16SrDNA序列的前500bp序列变化较大，包含有丰富的细菌种属的特异性信息，所以对于绝大多数菌株来说，只需要第一对引物测前500bp序列即可鉴别出细菌的菌属.针对科学论文发表或是前500bp无法鉴别的情况,需要进行16SrDNA的全序列扩增和测序，得到较为全面的16SrDNA的序列信息。
由于测序仪一次反应最多只能测出700bp的有效序列,为了结果的可靠性，通常将16SrDNA全长序列分成3部分进行测序.3.设备和材料3.1器材移液器(1000μL、200μL 、100μL、10μL）；涡旋振荡器；Eppendorf MixMate;离心机；水浴锅；电泳仪;制冰机;低温冰箱；PCR仪：Veriti 96 Well Thermal Cycler；凝胶成像仪:VersaDoc MP 4000；基因分析仪：AB3500、AB31303.2试剂DNA快速提取试剂：PrepMan Ultra;琼脂糖;PCR试剂：Taq酶，10×Taq Buffer(Mg2+），dNTPs，ddH2O等；ExoSAP-IT；测序试剂：BigDye Terminator,5×Sequencing Buffer；BigDye XTerminator Purification Kit;3.3耗材移液器吸头：1000μL、200μL、10μL；离心管:1.5mL、200μL；Micro Amp TM Optical 96-Well Reaction Plate；Micro Amp TM Optical Adhesive Film；3.4引物16SrDNA 名称序列扩增长度第1部分正向引物27F 5'-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG—3’500 bp左右反向引物519R 5’- GWA TTA CCG CGG CKG CTG -3'第2部分正向引物357F 5'- CTC CTA CGG GAG GCA GCA G—3'750bp左右反向引物1115R 5'-AGG GTT GCG CTC GTT GC—3’第3部分正向引物926F5'— AAA CTY AAA KGA ATT GAC GG-3'560 bp 左右反向引物1492R5’-TAC GGC TAC CTT GTT ACG ACT T-3'其中M=C:A ， Y=C:T. K=G:T ， R=A:G ， S=G ：C. W=A ：T ； all 1：14. 操作流程5. 实验方法5.1 核酸提取：挑取单菌落,然后置于装有100μLPrepMan Ultra 的离心管中，涡旋震荡混匀30s 左右，然后100℃水浴10min 后，以离心机最大转速离心3min,取10μL 上清液与490μL ddH 2O （即稀释50倍）,混匀作为下步PCR 的模板DNA 。
检定用菌种传代、贮存、接种操作细则
检定用菌种、传代、贮存、接种操作细则传代与接种操作步骤：1、先点燃酒精灯，在火焰旁的上部空间操作，烧灼接种环。
2、再将菌种管（即原有的菌种斜面培养基）与待接种的新鲜斜面培养基（接种管）持在左手拇指、食指与中指之间，要注意能清楚的观察到斜面，菌种管在前、接种管在后，应斜持试管显45℃角，使试管内斜面上，两试管口平齐，注意不要持成水平，以免底管凝聚小浸湿培养基表面。
3、用右手将两管棉塞转动，以便接种时易于拔取。
再灼烧接种环注意灼烧时，接种环应垂直或稍斜的在外焰上灼烧，外焰温度与内焰高，顶端的环必须烧红，以彻底灭菌，环以上进入试管部分也应充分通过火焰灭菌。
4、使用右手小指与无名指及无名指中指之间，在火焰旁分别拔下两只试管的棉塞、持住，将试管口通过火焰，以杀灭管口可能沾污的细菌，但勿烧烫。
5、将灼烧过的接种环伸入菌种管，先接触无军生长的培养基快速冷却，若接触的培养基有熔印时则表明接种环未冷却，能烫死细胞。
待冷后，从斜面上挑取菌苔少许，在火焰旁边，迅速踌躇接种环伸入接种管，在管内斜面上划线接种。
划线时在斜面上应先由内向外划一直线后，再由内向外划曲线。
*注意事项：1、整个操作过程应迅速且在酒精灯上方操作，勿使菌苔沾至管壁或管口。
2、从菌种管取出少量菌种苔后接种环，切不可通过火焰，以免菌种被烧死，也不宜火焰太远。
（避免污染）3、接种完毕后，立即在火焰旁塞上棉塞，再将接种环灼烧灭菌放回原处，再把可能未塞紧的棉塞塞紧，即可置适宜温度培养。
4、操作过程中，若棉塞不慎触及火焰而着火，切忌用口吹，若是棉塞进试管塞内一端着火，可在刚刚着火时迅速塞入试管，因管内氧气不是会很快熄灭，若棉塞外着火，可用手捏熄，若棉烧坏不宜再用，可另取未接种斜面培养基的灭菌棉塞，代替塞上。
5、借重完毕，应做好记录。
菌种的分离鉴别操作细则目的：当菌种污染某菌时，可将菌种接种于平板培养基进行分离，再根据菌种形态，挑取典型纯菌落并鉴别制成菌种管。
分离方法及步骤：1、取已污染某菌的菌落管，左手拿着菌种管拧松棉塞。
疾控中心检定菌保存、传代、使用、销毁标准操作规程
检定菌种保存、传代、使用、销毁标准操作规程1．目的：为规范微生物学检定用菌的管理，确保菌种的溯源性与稳定性，从而确保微生物学检验结果的准确可靠。
2．范围：本规程适用于检定用菌种的管理，包括菌种的申购、保存、传代、使用及销毁等。
3、定义：标准菌种是指由中国药品生物制品检定所医学微生物菌种保藏管理中心提供的冷冻干燥菌。
传代用菌种是指用标准菌种制备的采用特定保存方法长期固定保存的菌种，用于传代及制备工作用菌种。
工作用菌种是指用标准菌种或传代用菌种接种至普通琼脂斜面培养后，作为日常工作使用的菌种。
菌种的代是指将其接种至一新鲜培养基上或培养基内，每萌发一次即称为一代，从菌种保藏中心获得的冷冻干燥菌种为第0代。
4．职责：4.1检验科负责提出菌(毒)种的购买申请，并按国家有关生物安全法规的要求做好使用管理和销毁工作。
4.2总务科负责实施采购，检验科负责保存、验收。
5.规程：5.1．检定菌的申购检验科每年根据检定菌种的使用情况（包括临时检验需要），提出购买计划，交由中心分管主任审批后，向中检所菌种保藏中心购买冻干菌种（标准菌种）；也可以直接向省（市）疾控部门申请提供传代用菌种，需询问与确定菌种的代数，以便传代时控制代数。
5.2．检定菌的接收菌种到达实验室后，由菌（毒）种保管人接收菌种，检查其名称和数量，以及每一支的完整性，同时将菌种的所有信息，填写在《检定菌种接收记录》（附表1）上，并将其暂贮存于4～8℃冰箱中，在一周内必须完成转种。
5.3．检定菌的保存5.3.1．工作用菌种的保存工作用菌种采用斜面低温保存法。
将菌种接种在适宜的固体斜面培养基上，待菌生长充分以后，转移至2～8℃冰箱中保存。
此法仅用于工作用菌种的短期保存，并应随时检查其污染杂菌和变异等情况，发现异常情况，经应灭活处理后销毁。
保存时间根据菌种种类而不同，细菌：1个月；酵母菌：2个月；霉菌及芽胞：3个月。
5.3.2．传代用菌种的保存采用甘油冷冻管保藏法或液体石蜡保存法。
16SrDNA鉴定菌株的标准操作规程
16SrDNA鉴定菌株的标准操作规程1.适用范围本标准规定了通过特定引物对细菌的16SrDNA片段进行PCR扩增，然后对扩增片段进行序列分析比对，快速获得细菌种属信息的操作规程.本标准适用于未知细菌的快速种属分析,以及为细菌的生化鉴定提供指导信息。
2.方法和原理16SrDNA鉴定是指用利用细菌16SrDNA序列测序的方法对细菌进行种属鉴定。
包括细菌基因组DNA提取、16SrDNA特异引物PCR扩增、扩增产物纯化、DNA测序、序列比对等步骤。
是一种快速获得细菌种属信息的方法。
细菌rRNA（核糖体RNA)按沉降系数分为3种，分别为5S、16S和23S rRNA。
16S rDNA是细菌染色体上编码16S rRNA相对应的DNA序列。
16S rDNA由于大小适中，约1.5Kb左右,既能体现不同菌属之间的差异，又能利用测序技术较容易地得到其序列，故被细菌学家和分类学家接受。
在16S rRNA分子中,可变区序列因细菌不同而异,恒定区序列基本保守，所以可利用恒定区序列设计引物，将16S rDNA片段扩增出来，利用可变区序列的差异来对不同菌属、菌种的细菌进行分类鉴定。
16SrDNA序列的前500bp序列变化较大，包含有丰富的细菌种属的特异性信息,所以对于绝大多数菌株来说，只需要第一对引物测前500bp序列即可鉴别出细菌的菌属。
针对科学论文发表或是前500bp无法鉴别的情况，需要进行16SrDNA的全序列扩增和测序,得到较为全面的16SrDNA的序列信息。
由于测序仪一次反应最多只能测出700bp的有效序列，为了结果的可靠性,通常将16SrDNA全长序列分成3部分进行测序。
3.设备和材料1.1器材移液器(1000μL、200μL 、100μL、10μL）；涡旋振荡器；Eppendorf MixMate；离心机；水浴锅；电泳仪；制冰机；低温冰箱；PCR仪：Veriti 96 Well Thermal Cycler；凝胶成像仪：VersaDoc MP 4000;基因分析仪:AB3500、AB31301.2试剂DNA快速提取试剂：PrepMan Ultra；琼脂糖；PCR试剂：Taq酶,10×Taq Buffer （Mg2+），dNTPs，ddH2O等；ExoSAP-IT；测序试剂：BigDye Terminator,5×Sequencing Buffer；BigDye XTerminator Purification Kit；1.3耗材移液器吸头：1000μL、200μL、10μL；离心管:1.5mL、200μL;Micro Amp TM Optical 96—Well Reaction Plate;Micro Amp TM Optical Adhesive Film；1.4引物16SrDNA 名称序列扩增长度第1部分正向引物27F 5’—AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG—3'500 bp左右反向引物519R 5’- GWA TTA CCG CGG CKG CTG —3’第2部分正向引物357F 5'—CTC CTA CGG GAG GCA GCA G—3’750bp左右反向引物1115R 5'-AGG GTT GCG CTC GTT GC—3’第3部分正向引物926F5'- AAA CTY AAA KGA ATT GAC GG —3’560 bp 左右反向引物1492R5'—TAC GGC TAC CTT GTT ACG ACT T —3’其中M=C:A ， Y=C ：T 。
菌种鉴定标准操作规程
菌种鉴定标准操作规程目得:建立菌种鉴定标准操作规程范围:适用于**＊***鉴定标准操作职责:内容:1整体操作步骤1、１纯化、分离待鉴定菌用接种环挑取待鉴定菌落或少许含菌溶液到相应得培养基上（如TＳA)，划线分离,以出现微生物单菌落为止。
1、2挑取纯化后得单菌落，进行革兰染色、镜检,以确定待鉴定菌得革兰属性.1、3如镜检结果为革兰阴性杆菌，则先进行发酵实验。
如发酵实验结果为阴性,则选用API２0NE试剂条进行鉴定;如发酵实验结果为阳性,则在经过细胞色素氧化酶实验后选用ＡＰI20E试剂条进行鉴定．1、4如镜检结果为革兰阳性球菌，则先进行过氧化氢酶实验。
如实验结果为阴性则选用API Strep试剂条进行鉴定,如实验结果为阳性则选用API Stapｈ试剂条进行鉴定．1、5假如镜检结果为革兰阳性杆菌并且有内生芽胞,则选用ＡPI 5０ＣHB试剂条进行鉴定;否则,根据运动性实验与过氧化氢酶实验结果选用AＰＩＣoｒｙne或其她试剂条进行鉴定。
１、6选定正确得试剂条以后,根据不同得ＡＰI试剂条得标准操作规程准备接种物，进行接种、培养等操作并将结果形成数码,用API鉴定软件鉴定或查询待检菌得名称均可。
鉴定结果应记录,必要时，给出相应解释。
2革兰氏染色2、１染色剂得配制2、１、１结晶紫染色液：甲液:结晶紫1、０g９5%得酒精２0ml乙液：草酸铵０、８ｇ水8０mｌ将甲液与乙液混合均匀,静置48h使用,置密闭棕色瓶中储存。
２、1、2碘液：碘1、0g碘化钾2、0ｇ水３00ｍl配制时先用３～5ml水将碘化钾溶解,再加入碘,用力摇匀,使之全部溶解后,再加水稀释至30０ml,摇匀，分装在棕色瓶中储存。
2、1、3稀石碳酸红溶液：碱性品红1、0g石碳酸5、0ｍl95%乙醇１0、0mｌ配制时用乙醇溶解碱性品红,然后加入石碳酸溶液，使用时加水稀释至100ml,摇匀。
2、2操作:２、2、１涂片：用接种环挑取液体培养物中菌体在载玻片上涂成薄层，固体培养物则先在载玻片上滴一滴蒸馏水或生理盐水,用接种环挑取少量菌体在载玻片上涂成薄层.2、2、2干燥固定：涂片自然干燥或在酒精灯火焰上方微热烘干,并在火焰上通过2~3次，以固定涂片.２、2、３染色:在已固定得标本上滴加结晶紫溶液数滴，使染色液覆盖整个涂片标本,染色1分钟。
菌种验证操作规程
菌种验证操作规程1.目的为菌种验证试验提供作业指导，保证菌种的纯度和良好生长力，保持其生物特性的稳定。
保证实验结果的可靠性和准确性。
2.适用范围本规范适用于新购买菌种及本中心所保藏菌种传代保种的验证试验。
3.职责3.1微生物检验室主管负责监督实施本操作规程。
3.2微生物室检验人员严格按该验证方法进行菌种的验证。
4.菌种确认试验主要内容4.1菌种的纯度确认4.1.1纯度检测：是指通过适当的方法检测菌种是否为纯培养物。
4.1.2 试验内容①菌落形态：在特定的培养基上，将待检测培养物稀释涂布或平板划线，适宜培养后，同一平板上的单菌落的大小、形状、颜色、质地、光泽等是否相似；对于两种或以上形态的出发菌株，应再分别挑取单菌落划线或稀释涂布培养，检测是否重复出现相同特征。
②镜检特征：对数生长期的培养物革兰氏染色反应应呈现一致性；细胞形状、大小、荚膜、芽孢等特征应相似。
4.2 菌种的特性确认4.2.1 生化试验：各种微生物具有各自的独特的酶系统，因而在代谢过程中所参与的物质分解和合成代谢的产物也不同，这些代谢产物又具有不同的生化特征。
根据此特征，利用生物化学方法来鉴定不同的微生物的试验即为微生物的生化试验。
4.2.2 菌种的确定方法用无菌接种环粘取培养物，在相应的培养基平板上划线分离单个菌落，并在适宜条件下培养。
培养后观察是否具有典型的菌落形态，然后挑取单一纯菌落，进行革兰氏染色、镜检，观察其染色特性及菌形。
再做生化试验或使用菌种鉴定系统进一步鉴定菌种。
4.3根据不同菌种的生理生化特性做相应的鉴定试验，参照依据见下表。
5.菌种存活率验证将需要验证的菌种同时接种多个斜面，观察菌种的是否存活，然后进行记录，计算。
接种的斜面管总数－未存活的斜面数量/接种的斜面管总数·100％＝存活率6.相关记录菌种验证试验记录编制人：校核人：批准人：。
16SrDNA鉴定菌株的标准操作规程
16SrDNA鉴定菌株的标准操作规程1.适用范围本标准规定了通过特定引物对细菌的16SrDNA片段进行PCR扩增,然后对扩增片段进行序列分析比对，快速获得细菌种属信息的操作规程。
本标准适用于未知细菌的快速种属分析，以及为细菌的生化鉴定提供指导信息。
2.方法和原理16SrDNA鉴定是指用利用细菌16SrDNA序列测序的方法对细菌进行种属鉴定。
包括细菌基因组DNA提取、16SrDNA特异引物PCR扩增、扩增产物纯化、DNA测序、序列比对等步骤.是一种快速获得细菌种属信息的方法。
细菌rRNA(核糖体RNA)按沉降系数分为3种，分别为5S、16S和23S rRNA。
16S rDNA是细菌染色体上编码16S rRNA相对应的DNA序列。
16S rDNA由于大小适中，约1。
5Kb左右,既能体现不同菌属之间的差异,又能利用测序技术较容易地得到其序列，故被细菌学家和分类学家接受.在16S rRNA分子中，可变区序列因细菌不同而异,恒定区序列基本保守，所以可利用恒定区序列设计引物，将16S rDNA片段扩增出来，利用可变区序列的差异来对不同菌属、菌种的细菌进行分类鉴定。
16SrDNA序列的前500bp序列变化较大，包含有丰富的细菌种属的特异性信息，所以对于绝大多数菌株来说，只需要第一对引物测前500bp序列即可鉴别出细菌的菌属。
针对科学论文发表或是前500bp无法鉴别的情况,需要进行16SrDNA的全序列扩增和测序，得到较为全面的16SrDNA的序列信息。
由于测序仪一次反应最多只能测出700bp的有效序列，为了结果的可靠性，通常将16SrDNA全长序列分成3部分进行测序。
3.设备和材料1.1器材移液器(1000μL、200μL 、100μL、10μL）；涡旋振荡器;Eppendorf MixMate；离心机；水浴锅；电泳仪;制冰机；低温冰箱;PCR仪：Veriti 96 Well Thermal Cycler；凝胶成像仪：VersaDoc MP 4000;基因分析仪：AB3500、AB31301.2试剂DNA快速提取试剂：PrepMan Ultra；琼脂糖；PCR试剂：Taq酶，10×Taq Buffer(Mg2+)，dNTPs，ddH2O等；ExoSAP—IT；测序试剂:BigDye Terminator,5×Sequencing Buffer；BigDye XTerminator Purification Kit；1.3耗材移液器吸头：1000μL、200μL、10μL;离心管:1。
标准菌种确认标准操作规程
标准菌种确认标准操作规程一目的建立标准菌种确认标准操作规程，以减少菌种污染和生长特性的改变，保证实验结果的可靠性和准确性。
二围本规程适用于质量控制实验室所用标准储备菌株。
三容1.1 试验菌株大肠埃希菌（Escherichia coli）[CMCC(B)44102]金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）[CMCC(B)26003]枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）[CMCC(B)63501]白色念珠菌（Candida albicans）[CMCC(F)64941]黑曲霉（Aspergillus niger）[CMCC(F)98003]铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）[CMCC(B)10104]生孢梭菌（Clostridium sporogenes）[CMCC(F)98001]1.1.1 标准菌株1.1.1.1 标准菌株应来自认可的国或国外菌种收藏机构。
1.1.1.2 标准菌株经过复活并在适宜的培养基中生长后，即为标准储备菌株。
1.1.1.3 标准储备菌株应进行纯度和特性确认。
1.1.2 工作菌株1.1.2.1 标准储备菌株可用于制备每两个月或定期转种的工作菌株。
1.1.2.2 工作菌株的传代次数应严格控制，不得超过5 代（从菌种收藏机构获得的标准菌株为第0代），以防止过度的传代增加表型变化的风险。
因此必要时，应对工作菌株的纯度和特性进行确认。
1.2 菌种确认试验的主要容1.2.1 菌种的纯度确认1.2.1.1 纯度检测：是指通过适当的方法检测菌种是否为纯培养物。
1.2.1.2 试验容①菌落形态：在特定的培养基上，将待检测培养物稀释涂布或平板划线，适宜培养后，同一平板上的单菌落的大小、形状、颜色、质地、光泽等是否相似；对于两种或以上形态的出发菌株，应再分别挑取单菌落划线或稀释涂布培养，检测是否重复出现相同特征。
②镜检特征：对数生长期的培养物革兰氏染色反应应呈现一致性；细胞形状、大小、荚膜、芽孢等特征应相似。
菌种操作规程
菌种操作规程菌种操作是微生物实验室中非常重要的一项工作，它涉及到菌种的储存、分离、培养和传代等操作。
以下是一份常见的菌种操作规程，以确保实验室操作的安全性和结果的准确性。
一、菌种的储存1. 菌种的储存通常采用液氮冷冻或低温冰箱冷冻的方式。
2. 菌种的储存容器应该选择无菌的冻干管、冻存瓶或冷冻管，并在储存前进行无菌处理。
3. 在冷冻储存前，应制备菌种的冻存物质，如15%甘油溶液，以确保菌种冷冻过程中的生存率。
二、菌种的分离1. 菌种的分离通常采用扩散法、涂布法或稀释法等方法。
2. 在进行菌种分离前，实验室的工作台、培养皿和所需工具应进行彻底的消毒和无菌处理。
3. 分离出的纯菌落应进行单克隆处理，避免混菌的情况。
三、菌种的培养1. 发放和接收菌种时，应注意标签的准确性，并确认菌种的来源和鉴定信息。
2. 菌种的培养应选择适当的培养基和培养条件，以促进菌种的生长和代谢。
3. 在进行菌种培养时，应注意无菌操作，避免菌种的污染。
四、菌种的传代1. 菌种的传代应选择适当的传代方法，如子代分离、液体培养或固体培养等。
2. 传代菌种前，应将培养皿等实验器具进行干燥消毒，并进行无菌处理。
3. 在进行菌种传代时，应注意选择合适的传代时间和传代次数，避免菌种的突变和变异。
五、菌种的保管1. 菌种的保管应采取适当的方法，如冷冻保存、液氮冷冻保存或继代保存等。
2. 在进行菌种保管时，应注意保存容器的密封性和标识的清晰性。
3. 对于保存已久的菌种，应定期进行复苏培养，以维持菌种的活力和纯度。
六、菌种的管理1. 每次使用菌种前，应查验菌种的保藏情况和标签信息，并进行必要的鉴定。
2. 菌种管理应建立清晰的档案记录，包括菌种的来源、分离日期、储存方式和使用情况等。
3. 菌种的使用应按照实验室的安全操作规程进行，避免对环境和人员的污染。
对于菌种操作的规程，实验室应制定具体的操作细则，并根据实验室的实际情况进行调整和完善。
同时，实验室操作人员应接受相关培训，掌握正确的操作技巧和安全意识，以确保菌种操作的准确性和安全性。
菌种管理操作规程
菌种管理操作规程1.目的规范本中心标准菌种和野生菌种的管理。
2.范围本规程适用于标准菌种和实验过程中分离纯化的野生菌种的管理。
3.职责3.1菌种管理员：负责菌种的申购、接收、保存、分发。
3.2微生物检验员：负责菌种的确认、传代、使用及销毁。
3.3科室负责人：负责指导、监督检验员和管理员对菌种的管理。
4.术语4.1标准菌种（冻干菌种）：由国内或国际菌种保藏机构保藏的，遗传学特性得到确认和保证并可追溯的菌种。
4.2标准储备菌种：又称传代用菌种，由标准菌种经一次传代得到的培养物，是指用标准菌种制备的采用特定保存方法长期固定保存的菌种，用于传代及制备工作菌种。
4.3工作菌种：工作菌种是指用标准菌种或标准储备菌种接种至普通琼脂斜面培养后，作为日常工作使用的菌种。
4.4代：菌种的代是指将其接种至一新鲜培养基上或培养基内，每萌发一次即称为一代，从菌种保藏中心获得的冷冻菌种为第O代（Go）。
5.程序5.1菌种的申购菌种管理员每年根据菌种的使用情况（包括临时检验需要）提出购买计划，经批准后，向菌种保藏中心购买标准菌种（冻干菌种），采购执行《服务和供应品的采购程序》。
5.2菌种的接收菌种到达实验室后，由菌种管理员接收菌种，检查其名称和数量，以及每一支的完整性，同时将菌种的所有信息，填写《标准菌种接收记录表》，贴好标签并按照该菌适宜储存条件进行储存（储存期及储存条件见菌种说明书）。
5.3菌种的编号5.3.1标准/标准储备菌种采用字母加数字表示：英文缩写字母•来源编号•代次・传代日期■顺序号。
菌种的英文缩写字母：大肠埃希菌（E.c）、金黄色葡萄球菌（S.a）、枯草芽胞杆菌（B.s）、黑曲霉菌（A.n）、白假丝酵母（Ca）等，来源以购进方编号为准；代数用一位带有下标数字的字母表示；标准/标准储备菌种用G表示；工作菌种用W表示；如G3表示标准菌种第3代；W3表示工作用菌种第3代。
传代日期用6位数字表示：年份取最后两位数，月、日分别用两位数。
标准菌种确认标准操作规程
标准菌种确认标准操作规程一目的建立标准菌种确认标准操作规程，以减少菌种污染和生长特性的改变，保证实验结果的可靠性和准确性。
二范围本规程适用于质量控制实验室所用标准储备菌株。
三内容1.1 试验菌株1.1.1 标准菌株1.1.1.1 标准菌株应来自认可的国内或国外菌种收藏机构。
1.1.1.2 标准菌株经过复活并在适宜的培养基中生长后，即为标准储备菌株。
1.1.1.3 标准储备菌株应进行纯度和特性确认。
1.1.2 工作菌株1.1.2.1 标准储备菌株可用于制备每两个月或定期转种的工作菌株。
1.1.2.2 工作菌株的传代次数应严格控制，不得超过5 代（从菌种收藏机构获得的标准菌株为第0代），以防止过度的传代增加表型变化的风险。
因此必要时，应对工作菌株的纯度和特性进行确认。
1.2 菌种确认试验的主要内容1.2.1 菌种的纯度确认1.2.1.1 纯度检测：是指通过适当的方法检测菌种是否为纯培养物。
1.2.1.2 试验内容①菌落形态：在特定的培养基上，将待检测培养物稀释涂布或平板划线，适宜培养后，同一平板上的单菌落的大小、形状、颜色、质地、光泽等是否相似；对于两种或以上形态的出发菌株，应再分别挑取单菌落划线或稀释涂布培养，检测是否重复出现相同特征。
②镜检特征：对数生长期的培养物革兰氏染色反应应呈现一致性；细胞形状、大小、荚膜、芽孢等特征应相似。
1.2.2 菌种的特性确认1.2.2.1 生化试验：各种微生物具有各自的独特的酶系统，因而在代谢过程中所参与的物质分解和合成代谢的产物也不同，这些代谢产物又具有不同的生化特征。
根据此特征，利用生物化学方法来鉴定不同的微生物的试验即为微生物的生化试验。
1.3 菌种的确定方法用无菌接种环粘取培养物，在相应的培养基平板上划线分离单个菌落，并在适宜条件下培养。
培养后观察是否具有典型的菌落形态，然后挑取单一纯菌落，进行革兰氏染色、镜检，观察其染色特性及菌形。
再做生化试验或使用菌种鉴定系统进一步鉴定菌种。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
1．目的
建立菌种确认标准操作规程，以减少菌种污染和生长特性的改变，保证实验结果的可靠性和准确性。
2．依据
《中国药典》2010版二部
3．范围
本规程适用于质量控制实验室所用标准储备菌株。
4．责任
质量管理部，质量控制实验室
5．内容
5.1试验菌株
大肠埃希菌（Escherichia coli）[CMCC(B)44 102]
金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）[CMCC(B)26 003]
枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）[CMCC(B)63 501]
白色念珠菌（Candida albicans）[CMCC(F)98 001]
黑曲霉（Aspergillus niger）[CMCC(F)98003]
5.1.1标准菌株
5.1.1.1标准菌株应来自认可的国内或国外菌种收藏机构。
5.1.1.2标准菌株经过复活并在适宜的培养基中生长后，即为标准储备菌株。
5.1.1.3标准储备菌株应进行纯度和特性确认。
5.1.2工作菌株
5.1.2.1标准储备菌株可用于制备每月或每周一次转种的工作菌株
5.1.2.2工作菌株的传代次数应严格控制，不得超过5 代（从菌种收藏机构获得的标准菌
株为第0代），以防止过度的传代增加表型变化的风险。
因此必要时，应对工作菌株的纯度和特性进行确认。
5.2菌种确认试验的主要内容
5.2.1菌种的纯度确认
5.2.1.1纯度检测：是指通过适当的方法检测菌种是否为纯培养物。
5.2.1.2试验内容
①菌落形态：在特定的培养基上，将待检测培养物稀释涂布或平板划线，适宜培养后，同一平板上的单菌落的大小、形状、颜色、质地、光泽等是否相似；对于两种或以上形态的出发菌株，应再分别挑取单菌落划线或稀释涂布培养，检测是否重复出现相同特征。
②镜检特征：对数生长期的培养物革兰氏染色反应应呈现一致性；细胞形状、大小、荚膜、芽孢等特征应相似。
5.2.2菌种的特性确认
5.2.2.1生化试验：各种微生物具有各自的独特的酶系统，因而在代谢过程中所参与的物质分解和合成代谢的产物也不同，这些代谢产物又具有不同的生化特征。
根据此特征，利用生物化学方法来鉴定不同的微生物的试验即为微生物的生化试验。
5.3 菌种的确定方法
用无菌接种环粘取培养物，在相应的培养基平板上划线分离单个菌落，并在适宜条件下培养。
培养后观察是否具有典型的菌落形态，然后挑取单一纯菌落，进行革兰氏染色、镜检，观察其染色特性及菌形。
再做生化试验或使用菌种鉴定系统进一步鉴定菌种。
5.3.1大肠埃希菌的确认
5.3.1.1菌落形态
5.3.1.1.1取大肠埃希菌新鲜培养物至营养肉汤培养基中，经35℃培养18～24h后，形成菌膜，管底有粘液状沉淀，培养物有粪臭味。
5.3.1.1.2取上述培养物接种于曙红亚甲蓝琼脂(EMB)琼脂平板和麦康凯琼脂平板上，35℃培养18～24h后，观察结果。
①曙红亚甲蓝琼脂(EMB)琼脂平板上菌落形态呈紫黑色、浅紫色、蓝紫色或粉红色,菌落中心呈深紫色或无明显暗色中心，圆形，稍凸起，边缘整齐，表面光滑、湿润，常有金属光泽。
②麦康凯琼脂平板上菌落形态呈鲜桃红色或微红色，菌落中心呈深桃红色，圆形，扁平，边缘整齐，表面光滑，湿润。
5.3.1.2革兰染色、镜检
5.3.1.2.1革兰染色
①以接种环沾取无菌水于洁净载玻片上，取菌落形态（①、②）的培养物少许，制成均匀涂片，自然或微温，再通过火焰2～3次干燥使固定。
②滴加结晶紫染液，染色1min，水洗。
③滴加碘液，媒染1min，水洗，以滤纸吸干余水。
④滴加95﹪乙醇，脱色20～30s，至流出液无色，水洗。
⑤滴加沙黄染液，复染1min，待干后，镜检。
5.3.1.2.2染色结果应是：革兰阳性菌呈蓝紫色：革兰阴性菌呈红色。
5.3.1.2.3镜检结果应是：两端钝圆的短小直杆菌，单个或成对，革兰阴性，无芽孢，多有鞭毛，以周身鞭毛运动或不运动，许多菌株有荚膜和微荚膜。
5.3.1.3生化试验
5.3.1.3.1靛基质试验（I）：取菌落形态（①、②）的培养物接种于蛋白胨水培养基中，培养24-48h，沿管壁加入靛基质试液数滴，轻轻摇动试管，液面呈玫瑰红色为阳性，呈试剂本色为阴性。
5.3.1.3.2甲基红试验（M）：取菌落形态（①、②）的培养物接种于磷酸盐葡萄糖胨水培养基中，培养48+2h，于培养液中加入甲基红指示液2～3滴（约1ml培养液加指示液1滴），轻微摇动，立即观察，呈鲜红色或橘红色为阳性，呈黄色为阴性。
5.3.1.3.3乙酰甲基甲醇生成试验（V-P）：取菌落形态（①、②）的培养物接种于磷酸盐葡萄糖胨水培养基中，培养48+2h，，于2ml培养液中加入α-萘酚乙醇试液1ml，混匀，再加40%氢氧化钾试液0.4ml，充分振摇，在4h（通常在30min）内出现红色应判为阳性，无红色反应为阴性。
5.3.1.3.4枸橼酸盐利用试验（C）：取菌落形态（①、②）的培养物接种于枸橼酸盐培养基斜面上，培养2-4天，培养基斜面有菌苔生成，培养基由绿色变为蓝色时为阳性，培养基颜色无改变、无菌苔生长为阴性。
5.3.1.3.5乳糖发酵试验：取菌落形态（①、②）的培养物接种于乳糖发酵管，培养24-48h，观察产酸（指示剂为酸性品红者为红色：指示剂为溴麝香草酚蓝者为黄色），产气（小倒管内有气泡，气泡无论大小都是产气）。
5.3.2金黄色葡萄球菌的确认
5.3.2.1菌落形态
5.3.2.1.1取金黄色葡萄球菌新鲜培养物至营养肉汤培养基中，经35℃培养18～24h后，呈均匀浑浊生长，繁殖较多时易产生沉淀，沉淀易被摇散。
5.3.2.1.2取上述培养物划线接种于甘露醇氯化钠琼脂平板和卵黄氯化钠琼脂平板上培养24～27h观察结果。
①甘露醇氯化钠琼脂平板上菌落形态金黄色，圆形凸起，边缘整齐，外围有黄色环,菌落直径0.7-1mm。
②卵黄氯化钠琼脂平板上菌落形态金黄色，圆形凸起，边缘整齐，外围有卵磷脂分解的乳浊圈，菌落直径1-2mm。
5.3.2.2革兰染色、镜检
5.3.2.2.1革兰染色（见大肠埃希菌检查法5.3.1.2）
5.3.2.2.2镜检结果：为革兰阳性球菌，菌体呈球形或略呈椭圆形，菌体较小，菌体大小不一。
无芽孢，一般不产生荚膜。
排列呈不规则的葡萄状，亦可呈单个、成双或短链状排列。
5.3.2.3生化试验
5.3.2.3.1血浆凝固酶试验
试管法：取无菌试管（10mm×10mm）2支，各加入血浆和0.9%无菌氯化钠溶液（1：1）0.5ml，1支加入营养肉汤培养液0.5ml作为阳性对照：另一支加入无菌营养肉汤0.5ml 作为阴性对照。
两管同时置37℃水浴或恒温培养箱，3h后开始检查，以后每隔适当时间观察一次，直至24h。
检查时，轻轻将试管倾斜（动作勿大），仔细观察。
①阳性对照管：血浆和无菌水混合液加金黄色葡萄球菌营养肉汤培养物，在3h后开始观察直至24h。
结果：血浆凝固。
②阴性对照管：血浆和无菌水混合液加稀释液，在3h后开始观察直至24h。
结果：血浆流动自如。
5.3.3枯草芽孢杆菌的确认
5.3.3.1菌落形态
5.3.3.1.1取枯草芽孢杆菌新鲜培养物至营养肉汤培养基中，经35℃培养18～24h后，呈浑浊生长。
5.3.3.1.2取上述培养物划线接种于营养琼脂平板上，培养24～27h观察结果：菌落为灰色、干燥、皱缩、无典型卷发状。
5.3.3.2革兰染色、镜检
5.3.3.2.1革兰染色（见大肠埃希菌检查法5.3.1.2）
5.3.3.2.2镜检结果：革兰阳性芽孢杆菌芽孢为椭圆到柱状，位於菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大。
5.3.4白色念珠菌的确认
5.3.4.1菌落形态
5.3.4.1.1取白色念珠菌新鲜培养物至沙氏葡萄糖肉汤培养基中，经35℃培养24～48h后，呈浑浊生长。
5.3.4.1.2取上述培养物划线接种于沙氏葡萄糖琼脂培养基平板上，经30～35℃培养24～48h（必要时延长至72 小时）观察结果：呈乳白色偶见淡黄色，表面光滑有浓酵母气味，培养时间稍久则菌落增大，颜色变深、质地变硬或有皱摺。
5.3.4.1.3取上述（5.3.4.1.2）培养物接种至白色念珠菌显色培养基平板上，经30～35℃培养24～48h（必要时延长至72 小时）观察结果：平板上为绿色或翠绿色的菌落生长。
5.3.4.2革兰染色、镜检及芽管试验
取上述（5.3.4.1.3）培养物接种至1%聚山梨酯80-玉米琼脂培养基上，培养24～48h。
取培养物进行染色，镜检及芽管试验。
5.3.4.2.1革兰染色（见大肠埃希菌检查法5.3.1.2）
5.3.4.2.2芽管试验：挑取1%聚山梨酯80-玉米琼脂培养基上的培养物，接种于加有一滴血清的载玻片上，盖上盖玻片，置湿润的平皿内，置35～37℃培养1～3h，置显微镜下观察，可见到由孢子长出短小芽管。
5.3.4.2.3镜检结果：革兰阳性芽孢杆菌芽孢为厚膜孢子、菌丝、芽管。
5.3.5黑曲霉菌的确认
5.3.5.1镜检：可见孢子，菌丝。