农杆菌介导转化拟南芥
农杆菌侵染拟南芥花序的转化方法
农杆菌侵染拟南芥花序的转化方法制备转化用的农杆菌菌液准备：1．灭菌试管 400毫升细长烧杯2瓶，离心瓶4-6个（250ml）。
2．试剂：YEP 1200ml（每瓶300ml 共4瓶）+Kan 1;1000，Rif1:500。
1/2MS+2%蔗糖（灭菌115度20分钟），Silwet在-20℃贮存。
3．步骤：共转化农杆菌：于中午12点接菌于有YEP培养液的试管中10ul：10ml接种。
28℃，3000rpm摇过夜，约30小时，次日下午6点将已摇活的菌按（1：400）及750ul菌液转至汉300毫升YEP+K50+Rif中培养28℃，300rpm约14小时，次日上午8点测OD值，用YEP+Rif作为空白对照，当菌液达到OD600为1.5~3.0之内时，可收集菌体于250ml离心瓶（灭菌）,4℃，4000g 离心10min 。
用10%蔗糖（含0.02%silwet）稀释至OD600 约为0.8-- 1.0左右即，用10%蔗糖作对照。
转化时将花在溶液中浸泡50s左右，于弱光下生长。
4．浇水：转化前一天将需要做转化的野生型拟南芥苗子浇水浇透。
（注意：选取上述配好的溶液2ml，充分打碎管底部的菌体，在将混匀的菌体溶入600ml溶液中，混匀后再加入Silwet(100%)120ul终浓度为0.02%）。
2．先将浇透水用于转化的苗子的夹全部剪掉，再用宽胶带把花盆的土封好。
3．转化的准备工作：2个400细长烧杯，宽胶带，记号笔，表等。
4．转化过程略，视苗的长势弱 0.8 Pa 3`，长势好的0.8 Pa 5`。
5．标记好，将转化好的苗平放于盒子内，上盖封口膜封好，避光培养24hrs 2天后，将植株立起正常培养，浇水，3天1次。
花序浸泡(flower-dipping)法转化拟南芥（2）拟南芥种植取Columbia生态型的拟南芥种子，在EP管中用70%的酒精消毒2-3min，10%次氯酸钠消毒10min，无菌水冲洗5-6次，用0.1%的Top agar混匀，平铺在1/2 MS 培养基上，4℃保湿黑暗条件下春化3-4天，然后置于16h光照/8h黑暗光周期、2000-3000Lux、18℃、RH为70%条件下培养。
农杆菌侵染拟南芥花序的转化
农杆菌侵染拟南芥花序的转化
农杆菌渗透转化拟南芥
1）取含有重组质粒的农杆菌，在含有相应抗生素的YEP（LB也可以）平板上划线，28℃培养2-3d。
2）取划线的农杆菌单菌落，接种在3ml含相应抗生素的YEP培养液中，28℃，250rpm，振荡过夜培养。
3）在400-500ml 含相应抗生素的YEP培养基中，接种3ml过夜培养的起始农杆菌液，并在28℃摇床上振荡过夜，培养至细菌OD600值大于2.0。
4000rpm离心
10min收集细胞并悬浮于大约3倍体积的渗透培养液（1/2MS，50g/L蔗糖，0.5g
MES，pH=5.7-5.8，250ul/L silwetL-77(0.02%silwet)）中，此时的OD600值约
为0.8。
一般来说，400ml YEP过夜培养的农杆菌应至少可以渗透转化6钵植株。
4）在一个开口的大器皿（如500ml烧杯）内倒入200-300ml的悬浮有农杆菌的渗透液。
5）将生长有拟南芥的培养钵（盛花期拟南芥，最好在转化前修剪掉果荚和已经开放的花）小心地反扣在上述器皿内，让拟南芥的花芽完全浸入农杆菌悬浮液中
大约1min，将培养钵移开侧倒放入大盘中，让多余液体流净。
6）将处理过的植物用塑料盖盖上避光大约24h培养。
7）将植物放置在适宜的条件下培养3-4周，收集种子，进行下一步的筛选处理。
转化前一天将需要做转化的野生型拟南芥苗子浇水浇透。
Silwe-77t：加300微升/L 浸30s 50-100微升/L 浸3分钟。
农杆菌介导浸花法侵染拟南芥
农杆菌介导浸花法侵染拟南芥一、实验目的1.了解浸花法(floral tip)转化的机理；2.掌握拟南芥浸花法(floral tip)转化的技术二、实验原理拟南芥的花序大量产生时，将其在含有转化辅助剂silwet和蔗糖的农杆菌溶液中浸泡20秒，3-4周后对转化植株收种子。
在含有合适抗生素的平板上对种子进行筛选，能够健康生长的幼苗为转基因植株。
三、实验材料及仪器材料：生殖期的拟南芥植株，含目的基因质粒的农杆菌(PCAMIBIA 3301-ZEP)，无菌滤纸仪器设备：超净工作台，恒温摇床，培养箱，台式高速离心机，涡旋仪，抽滤器，高压灭菌锅，电子天平，酸度计，培养室用具：微量移液器，金属药匙，牙科手术钩或细菌涂布器，100 ml无菌三角瓶，直径9 cm 培养，200 ml及1ml tip枪头，枪形镊四、实验步骤1)当野生型株系的拟南芥植株生长了个月左右。
将其主薹剪掉，待其次生薹长出，浸染前剪掉植株上的果荚和已经完全开放的花；2)将农杆菌菌液扩大培养接入到250 ml含有50 μg/ml的Kan和Rif的YEP的液体培养基中:3)将装有250 ml YEP液体培养基的500 ml三角瓶置于28℃ 200 rpm下振荡培养24 h;4)分批次将250 ml YEP液体培养基装在50 ml离心管中多次离心，每次7500 rpm离心5 min,直到把所有的农杆菌都聚集在管底；5)用5%的蔗糖溶液。
其中加了0.02%-0.05% (VV)的silwet L-77来重新悬浮聚集在管底的农杆菌，直到把浓度稀释到OD600为1.5左右即可；6)把蔗糖溶液重悬的农杆菌菌液放入50 ml 离心管中，将花盆倒转过来，将花序浸入农杆菌中20 s，轻轻转动和晃动植物，保证腋芽生长的花都能浸到液体溶液中，取出后能看见植物上有一层水膜，轻轻晃动植物3-5 s抖掉过多的液体(花在液体中浸泡时间过长有所伤害)。
7)浸染过得植株放置在塑料盆中并用一个高的遮光的袋子遮住植株以保持其湿度,并将盆置于弱光或黑暗的条件下一天；8）将其遮光袋拿去，移到智能气候室培养，并定期补浇营养液，直到角果成熟收获种。
eha105 拟南芥原理
EHA105 拟南芥原理详解拟南芥简介拟南芥（学名：Arabidopsis thaliana）是一种小型的模式植物，属于十字花科，是研究植物生物学和遗传学的重要模式生物。
拟南芥的基因组相对简单，具有短的生命周期和快速的生长速度，使其成为研究植物基因功能和表达调控的理想模型。
拟南芥转化技术拟南芥转化技术是将外源基因导入拟南芥植株中，使其表达特定的基因或蛋白质。
其中，EHA105是一种常用的拟南芥转化介导体，通过农杆菌介导的转化方法将目标基因导入拟南芥。
拟南芥转化技术的基本原理如下：1.农杆菌介导的转化：农杆菌是一种常见的土壤细菌，具有天然的遗传转化能力。
利用农杆菌的特性，可以将目标基因导入拟南芥细胞中。
转化过程中，农杆菌通过寄生在植物细胞上的线粒体和质体，将外源基因导入植物细胞的染色体中。
2.构建转化载体：为了将目标基因导入拟南芥细胞中，需要构建一个转化载体，其中包含了目标基因的DNA序列。
转化载体一般由多个功能模块组成，包括选择标记基因、启动子、终止子等。
选择标记基因可以在转化后的拟南芥中表达，用于筛选转化成功的植株。
3.转化条件优化：转化过程中，需要优化一系列的条件，以提高转化效率。
包括农杆菌的培养条件、拟南芥的生长条件、转化载体的浓度和转化时间等。
通过优化这些条件，可以提高转化效率，增加转化成功的概率。
4.筛选转化植株：转化后的拟南芥植株需要经过筛选，以确定哪些植株成功地导入了目标基因。
常用的筛选方法是通过选择标记基因的表达来鉴定转化植株。
选择标记基因一般与目标基因共同构建在转化载体中，通过选择标记基因的表达来判断转化是否成功。
5.遗传稳定性验证：转化后的拟南芥植株需要进一步验证其遗传稳定性。
通过后代分析，确定转化基因是否稳定地遗传给下一代。
通常，通过PCR、Southern blot等方法来检测目标基因的存在，并验证其在后代中的稳定性。
EHA105的特点和应用EHA105是一种常用的拟南芥转化介导体，具有以下特点和应用：1.高转化效率：EHA105具有较高的转化效率，可以在较短的时间内实现大量的拟南芥转化。
农杆菌花序侵染法转化拟南芥
农杆菌花序侵染法转化拟南芥
侵染液制备
1、将保存的农杆菌拿出按1：100的比例接种与5ml含抗生素的液
体YEP培养基中。
28°C、220rpm过夜培养。
农杆菌2h左右繁殖一代，培养时间较大肠杆菌长。
2、将活化好的农杆菌按1：100的比例加入100ml含抗生素的液
体YEP培养基中继续28°C、220rpm培养16h左右。
3、次日中午测菌液OD600值，用含抗生素的液体YEP培养基作为
空白对照。
OD600值达到1.0-1.3之间时，用50ml离心管，
室温4000rpm离心10min集菌。
倒掉上清，加入悬浮液重悬
菌体，调节OD600达到0.8-1.0.
悬浮液100ml为例：ddH2O 1OOml、MS 0.216g、蔗糖5g、
L-77 30ul，调节PH=5.8
4、拟南芥有花序、花蕾的植株浸入悬浮好的菌液40-50s ,确保
所有的花都浸在农杆菌培养液中。
浸染后避光过夜，第二天
揭开覆膜。
正常光照培养。
每隔七天转化一次。
可转化3次
提高转化效率。
一种基于农杆菌介导的拟南芥瞬时转化技术优化
一种基于农杆菌介导的拟南芥瞬时转化技术优化郭勇;王玉成;王智博【摘要】利用根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的拟南芥瞬时转化体系影响因素来确定最佳转化条件.以生长15日龄的拟南芥幼苗为试验材料,以转化pCAMBIA1301空载体的根癌农杆菌EHA105为目的菌株进行瞬时转化.研究了吐温20、菌液OD值、乙酰丁香酮(AS)及转化时间等对拟南芥瞬时转化效率的影响.结果表明:以体积分数为0.05％的吐温、菌液OD600值为1.0和120 μmol/L 的AS侵染拟南芥2.5 h后,再共培养72 h,能够得到高瞬时转化效果.【期刊名称】《东北林业大学学报》【年(卷),期】2016(044)006【总页数】5页(P41-44,83)【关键词】拟南芥;GUS基因;瞬时表达;实时定量;农杆菌介导转化【作者】郭勇;王玉成;王智博【作者单位】林木遗传育种国家重点实验室(东北林业大学),哈尔滨,150040;林木遗传育种国家重点实验室(东北林业大学),哈尔滨,150040;林木遗传育种国家重点实验室(东北林业大学),哈尔滨,150040【正文语种】中文【中图分类】Q786拟南芥是重要的模式植物，很多植物基因的功能都是通过基因转入拟南芥中进行研究，而转基因又分稳定表达与瞬时表达两种方式[1]，稳定表达需要的培养、鉴定时间较长，而与之相比，瞬时表达具有简单、快捷、周期短、准确等优点[2]，并且表达效率较稳定，转化率高。
当需要在短时间内进行基因功能的分析或者蛋白间的互作以及蛋白与基因间互作等的研究时，瞬时表达的方法可作为一种高效的手段[3]。
基于瞬时转化技术使基因在宿主体内瞬时表达，是一种快速的研究基因表达、蛋白质亚细胞定位及基因间互作的一种重要手段,与传统的转基因相比,瞬时表达不需要整合到染色体上，而且瞬时表达还不受基因的位置效应和基因沉默的影响，也不会产生可遗传的子代,生物安全性高[4]。
农杆菌侵染拟南芥花序的转化方法
农杆菌侵染拟南芥花序的转化方法制备转化用的农杆菌菌液准备：1．灭菌试管 400毫升细长烧杯2瓶，离心瓶4-6个（250ml）。
2．试剂：YEP 1200ml（每瓶300ml 共4瓶）+Kan 1;1000，Rif1:500。
1/2MS+2%蔗糖（灭菌115度20分钟），Silwet在-20℃贮存。
3．步骤：共转化农杆菌：于中午12点接菌于有YEP培养液的试管中10ul：10ml接种。
28℃，3000rpm摇过夜，约30小时，次日下午6点将已摇活的菌按（1：400）及750ul菌液转至汉300毫升YEP+K50+Rif中培养28℃，300rpm约14小时，次日上午8点测OD值，用YEP+Rif作为空白对照，当菌液达到OD600为1.5~3.0之内时，可收集菌体于250ml离心瓶（灭菌）,4℃，4000g 离心10min 。
用10%蔗糖（含0.02%silwet）稀释至OD600 约为0.8-- 1.0左右即，用10%蔗糖作对照。
转化时将花在溶液中浸泡50s左右，于弱光下生长。
4．浇水：转化前一天将需要做转化的野生型拟南芥苗子浇水浇透。
（注意：选取上述配好的溶液2ml，充分打碎管底部的菌体，在将混匀的菌体溶入600ml溶液中，混匀后再加入Silwet(100%)120ul终浓度为0.02%）。
2．先将浇透水用于转化的苗子的夹全部剪掉，再用宽胶带把花盆的土封好。
3．转化的准备工作：2个400细长烧杯，宽胶带，记号笔，表等。
4．转化过程略，视苗的长势弱 0.8 Pa 3`，长势好的0.8 Pa 5`。
5．标记好，将转化好的苗平放于盒子内，上盖封口膜封好，避光培养24hrs 2天后，将植株立起正常培养，浇水，3天1次。
花序浸泡(flower-dipping)法转化拟南芥（2）拟南芥种植取Columbia生态型的拟南芥种子，在EP管中用70%的酒精消毒2-3min，10%次氯酸钠消毒10min，无菌水冲洗5-6次，用0.1%的Top agar混匀，平铺在1/2 MS 培养基上，4℃保湿黑暗条件下春化3-4天，然后置于16h光照/8h黑暗光周期、2000-3000Lux、18℃、RH为70%条件下培养。
农杆菌介导DR1372基因转化拟南芥的
第32卷第2期2013年2月绵阳师范学院学报Journal of Mianyang Normal University Vol．32No．2Feb．，2013收稿日期：2012-12-30基金项目：转基因生物新品种培育重大专项（2009ZX08009－091B ），国家自然科学基金（30871555），教育部新世纪优秀人才支持计划（NCET －08－0940），四川省教育厅（09ZA034）、西南科技大学博士研究基金（11zx7104）和农业部公益性行业科研专项（201103007）作者简介：张思维，硕士研究生，主要从事植物遗传与抗逆研究*通讯作者：代其林，博士，副教授，研究方向为植物遗传与抗逆研究．E －mail ：daiqilinmj@．sina．com农杆菌介导DR 1372基因转化拟南芥的研究张思维，周文波，张新，陈翠娜，代其林*（西南科技大学生命科学与工程学院，四川绵阳621000）摘要：耐辐射奇球菌(D．radiodurans ，DR )在极端胁迫条件下能够继续生存，其耐辐射奇球菌基因组中(DRR1)拥有一个独特的极端环境抗性基因组而被广泛研究．DR 1372基因就是在DR R1中克隆得到的一个基因，其蛋白序列存在一个Why 功能域，此功能域可能参与了植物的抗旱过程．我们利用基因工程手段首先构建了植物DR1372－GV3103表达载体，然后利用花序浸染法成功将目的基因DR 1372转入拟南芥中，最后对阳性植株进行盐胁迫，证实了DR 1372基因在拟南芥中的表达明显改善了转基因植株的耐盐性．初步建立了农杆菌介导DR 1372基因转化拟南芥体系，为后续DR 1372基因的功能研究工作提供了理论基础．关键词：DR 1372;载体构建;盐胁迫;拟南芥中图分类号：O175.12文献标识码：A 文章编号：1672-612x （2013）02-0057-080引言目前，越来越多的抗旱相关基因已经被克隆，并用来提高植物的抗旱性．按照抗旱基因的功能，可以把植物抗旱相关基因分为两大类：第一类是编码在植物抗性中直接起保护作用的蛋白质基因，属于功能基因；第二类是编码在信号传导和逆激基因表达过程中起调节作用的转录因子基因，属于调节基因［1］．Pibn －Smits 等将otsA 和otsB 导入烟草，在干旱胁迫下，转基因植株中海藻糖含量比对照高，叶面积增大，光合活性提高［2］．Kishor 等将从乌头叶豇豆中克隆的P5CS 基因与CaMV35S 启动子连接转入烟草中，发现转基因烟草的脯氨酸含量比对照高10－18倍；干旱胁迫下，转基因烟草落叶少而迟，根比对照长40%，生物量增加2倍［3］．Capell 等发现Adc 在水稻中的超表达缓解了干旱条件下转基因水稻叶绿素的损失，并提高了水稻的抗旱性［4］．由于转录因子能在转录水平上调控一系列基因的表达，所以转化调节基因能有效地提高植物的耐旱性，与抗旱相关的转录因子有DREB 、MYC /MYB 、bZIP 、WRKY 和NAC 类等，其中MYB /MYC 是植物中最大的转录因子家族．Chen 等发现了小麦中23个MYB 转录因子，其中有4个与抗旱相关［5］．耐辐射奇球菌（D．radiodurans ，DR ）是Anderson 等科学家在1956年从经过灭菌处理的肉类中发现的一种红色非致病性球菌，目前被认为是"世界上抗性最强的细菌"，因其对电离辐射、干燥、紫外线及一些DNA 损伤试剂显示超强的抗性，一直倍受生物医学界的关注［6］．White 等在1999年公布了DR R1的完全基因组序列，包括两条染色体，共携带有3195个可预测基因，并对部分基因进行了评注［7］．DR R1基因组可以在一个细胞中完成DNA 修复，DNA 损伤信号输出，干旱和饥饿胁迫的应答，以及基因组的修复等功能．Battista 等推测，在耐辐射球菌R1中的抗旱性研究将用于引导较高生物体的抗旱性研究［8］．DR1372基因是耐辐射奇球菌体内1号染色体上的一个基因，把这个基因转入大肠杆菌后进行培养，经初步定性分析发现，在大肠杆菌中有稳定细胞膜，调节细胞内外渗透压的作用，初步推测为与调节水分胁迫应答有关的基因．对DR1372蛋白序列进行分析发现，其内部存在一个WHy 功能域非特异性结合位点，与HIN1蛋白中的WHy 功能域结构非常相似［9］．WHy 结构域存在于几大类蛋白质家族中，大约由100个氨基酸组成，这些氨基酸由亲水性和疏水性氨基酸交替排列，并且在N 末端都存在一个非蛋白氮（NPN ）结构．同时，研究者还在胚胎发育晚期蛋白中也发现了WHy 功能域的存在，最终推测WHy 结构域是参与植物水分胁迫应答以及超敏应答的一类功能域［9］．脱水素是一类亲水性蛋白质，其蛋白结构中也含有一个WHy 功能域，它们在胚胎发生后期阶段产生，对低温、外源ABA 、干旱、盐渍以及脱水胁迫反应迅速，进而在植株中积累［10、11］．由于WHy 功能域参与了干旱胁迫应答，这些间接证据表明DR 1372基因在干旱胁迫过程中也可能参与了抗旱性相关的基因．因此，本研究利用基因工程手段构建植物DR 1372－GV3103表达载体，将DR 1372基因转入拟南芥中，得到转基因抗性拟南芥，并对转DR 1372基因拟南芥幼苗进行了盐胁迫的反应，不仅为后续的该基因研究提供了丰富的植物材料，也为DR 1372的功能研究包括WHy 功能域的功能研究奠定了基础，对植物育种工作也有一定的指导意义．1实验材料1．1植物材料拟南芥野生型col －0生态型1．2菌株DR 1372+Z3（DR 菌内与干旱相关的基因DR 1372与穿梭质粒pRADZ3连接转大肠杆菌），JM109，JM109，GV31032实验方法2．1构建DR 1372－GV3103植物表达载体2．1．1DR 1372基因的引物设计根据DR 1372基因序列，利用生物软件Primer5设计出该基因的上、下游引物（分别命名为DR 1372－F ，DR 1372－R ）；根据pBI121质粒图谱，分别引入XbaI ，SacI 限制性酶切位点，并设计引物如下：Sence ：5＇－－－－－－GC TCTAGA ATGAAGAAGATGGCTTTTGCG －－－－－3＇Antisence ：5＇－－－CG AGCTC TCAAAACACCGATAAAGGCGC －－－－3＇（加粗标记示酶切位点）2．1．2PCR 扩增目的基因DR 1372用试剂盒（TIANGEN ）提取DR 1372+Z3质粒，在最优扩增体系下进行PCR 扩增．电泳验证．2．1．3质粒pBI121的提取用试剂盒（TIANGEN ）提取pBI121质粒．电泳验证．2．1．4PCR 产物胶回收PCR 产物经电泳检测后，使用琼脂糖凝胶DNA 回收试剂盒（TIANGEN ）回收扩增的目的片段DR1372和pBI121．电泳验证．2．1．5DR 1372基因和pBI121的酶切，连接，筛选及鉴定2．1．5．1目的片段DR 1372和pBI121质粒用XbaI ，SacI （购自Takara 公司）进行双酶切，37ħ酶切过夜，回收目的片段．2．1．5．2将回收的目的基因片段和pBI121质粒大骨架片段，16ħ连接过夜，重组质粒转化JM109感受态细胞．2．1．5．3阳性克隆检测：进行菌落PCR 初步鉴定，将PCR 检测出的阳性单克隆摇菌后送华大基因公司测序．2．1．6挑取测序成功的JM109单菌落，继代培养，保菌．将保存菌种摇菌提取质粒，得到DR 1372－GV3103植物表达载体．2．2花序浸染法转化拟南芥2．2．1培养基：MS 培养基中抗性筛选平板加入卡拉霉素（Kan ，50mg /ml ）Hoagland＇s （霍格兰氏）液体培养基药品试剂：乙酰丁香酮（AS ）Silwet －L77表面活性剂2．2．2拟南芥种子的消毒、铺板及植株培养选取150粒拟南芥种子，用75%乙醇消毒1min ，然后用无菌水洗2遍；再用2．5%NaClO 消毒5min ，用无菌水清洗5遍后，最后用加无菌水少许，放在4ħ冰箱春化2d 后进行铺板．·85·第32卷绵阳师范学院学报（自然科学版）铺板前一天按照每板大约25mL MS 配制固体平板培养基，col －0生态型拟南芥种子铺于无抗性培养基上，放入光照培养箱中（22ħ，16h /8h 光/暗培养（光强130μmol ·m －2·s －1））．培养10d 后把拟南芥幼苗移栽至培养土中（营养土/蛭石=2：1），相同温度和光照条件下继续培养，每3d 浇水一次．待拟南芥开出花序准备进行浸染．2．2．3花序浸染法浸染拟南芥：2．2．3．1DR 1372－GV3103农杆菌的培养：在200mL LB 液体培养基中加入0．2mL DR 1372－GV3103菌液，28ħ220rpm 振荡培养15h 左右，室温下4000rpm 离心20min ，弃上清，用1/2MS 液体培养基（含AS 100μmol /L ，0．05%Silwet －L77表面活性剂）悬浮菌体，稀释到原体积的10倍，在28ħ220rpm 振荡培养1h ，菌液浓度达到OD 600=0．5时待用．2．2．3．2浸染：将拟南芥未开花的花序浸入菌液中3－5s ，倒放24h ，并用薄膜覆盖避光24h ，然后21ħ光照培养．2．2．4收取拟南芥的T 1代种子：T 1代种子采收后，用含有卡那霉素的平板进行转基因阳性筛选，然后提取抗卡那霉素的拟南芥幼苗基因组进行PCR 鉴定，阳性T 1代幼苗开花结实后，收取T 2代种子，得到纯合体转基因拟南芥种子．2．3转DR1372基因拟南芥幼苗对盐胁迫的反应2．3．1拟南芥种子的消毒、铺板选取T 2转基因拟南芥种子约200粒，用75﹪乙醇消毒1min ，用无菌水洗2遍；再用2．5﹪NaClO 消毒5min ，随后用无菌水清洗5遍，再次加入无菌水放置在4ħ冰箱进行春化处理2d．然后把春化后的种子铺在25mL MS 固体培养基上，转基因和非转基因拟南芥种子均铺于无卡拉霉素的培养基上，封口放入光照培养箱中培养（22ħ，16/8h 光/暗培养（光强为130μmol ·m －2·s －1））．2．3．2对拟南芥幼苗进行NaCl 盐胁迫待拟南芥幼苗在平板上长出3片叶后，在平板中加入0、100、200、250和300mmol /L 灭菌的NaCl 溶液．然后观察拟南芥幼苗的生长状况．3结果3．1pBI121－DR 1372质粒的构建3．1．1提取含DR 1372基因质粒提取DR 1372质粒，其电泳结果如图A 所示，我们提取的目标基因条带清晰，无弥散现象，可以用于PCR 扩增．3．1．2DR 1372基因的扩增利用DR 1372－F 和DR 1372－R 引物对DR 1372基因进行PCR 扩增，其电泳结果如图B．DR 1372基因分子大小为495bp ，条带位置正确，并且为单一条带．然后对PCR 产物进行胶回收，其胶回收电泳结果如图C．3．1．3pBI121质粒的提取提取pBI121质粒后进行电泳，其电泳结果如图D 所示，所提取的目标基因条带清晰，无弥散现象，可以进行酶切．3．1．4对DR 1372胶回收产物进双酶切，酶切位点分别为XbaI ，SacI ，经电泳后（图E ）再胶回收（图F ）．同时对pBI121质粒进行XbaI ，SacI 双酶切，其电泳图和胶回收情况见图G 和图H．从图G 和图H 两个电泳图分析表明：经双酶切后，目的基因DR 1372和质粒pBI121都被切开，胶回收后都能够得到清晰单一的条带，该连接了DR 1372基因的质粒pBI121载体可以用于大肠杆菌和根癌农杆菌的转化．3．1．5连接目的基因的质粒转化菌种JM109把链接了目的基因的质粒转化到JM109后，经培养后挑取抗卡拉霉素菌落直接进行PCR 扩增，其扩增的部分结果如图I ，表明：有多个菌落显示为阳性，把阳性克隆送去测序，测序反馈结果经过软件分析，目的序列与DR 1372序列完全一致，说明DR 1372外源基因成功导入到了大肠杆菌中JM109．·95·张思维等：农杆菌介导DR 1372基因转化拟南芥的研究第2期图1pBI121－1372质粒的构建结果Fig．1pBI121－DR 1372clone in JM109A －I 中M 为DL2000MarkerA ：DR 1372+Z3质粒电泳条带A ：Agar gel electrophoresis of DR 1372B ：DR 1372扩增条带B ：Agar gel electrophoresis of PCR productC ：DR 1372PCR 胶回收验证C ：Agar gel electrophoresis of DNA extractionD ：pBI121质粒提取验证D ：Agar gel electrophoresis of pBI121E ：DR 1372双酶切电泳图E ：Agar gel electrophoresis of DR 1372digested productsF ：DR 1372双酶切后胶回收电泳图F ：Agar gel electrophoresis of DR 1372digested products ，extractionG ：pBI121双酶切电泳图G ：Agar gel electrophoresis of pBI121digested productsH ：pBI121双酶切胶回收验证H ：Agar gel electrophoresis of pBI121digested products ，extractionI ：JM109菌落PCR 验证I ：1：positive control ；2：negative control ；3－10：PCR products of JM109with pBI121－DR 1372clone3．2DR 1372－GV3103植物表达载体的构建将测序正确的JM109单菌落质粒转化GV3103感受态，得到的单菌落进行菌落PCR 验证，结果如图2．由图2可以选择1－2、4－6号保菌做浸染拟南芥用，阳性率为66．67%．图2DR1372－GV3103的菌落PCRFig．2Analysis of DR1372－GV3103M ：DL2000maker ，9：阳性对照，10：阴性对照，1－8：单克隆菌落PCRM ：DL2000Marker ；9：positive control ；10：negative control ；1－8：PCR products of GV3103with pBI121－DR 1372clone ·06·第32卷绵阳师范学院学报（自然科学版）3．3转DR 1372基因拟南芥体系的建立及抗性植株的获得3．3．1转DR 1372基因拟南芥体系的建立利用花序浸染法侵染拟南芥未开花的花序，待拟南芥角果成熟后收取种子（浸染到收取种子的过程如图3所示）．将收取的种子用50mmol /L 卡那霉素筛选，得到30株抗卡拉霉素的幼苗，提取抗性幼苗DNA ，进行PCR 检测，然后得到10株转DR 1372基因的阳性拟南芥苗，待成熟后收种T 1代种子．对T 1代种子进行进一步筛选，得到纯合的转基因阳性植株T 2代，T 2代得到阳性苗60株，经PCR 检测后得到纯合阳性植株22株，阳性率为36．7%．3．3．2阳性植株的PCR 检测对具有卡那霉素抗性的转化植株提取DNA ，进行PCR 扩增和电泳检测，其电泳的部分结果如图4所示，共检测出12株拟南芥有清晰的495bp 大小的扩增条带，说明外源DR 1372基因成功转入到野生型拟南芥中．图3转DR1372基因拟南芥体系的建立Fig．3Regeneration of transgenic ArabidopsisA ：花序浸染后拟南芥B ：50MKan 筛选T 1代抗性苗C ：T 1带抗性拟南芥幼苗D ：T 1抗性拟南芥代成株子E ：筛选T 2代抗性苗F ：T 2代抗性拟南芥幼苗G ：T 2代抗性拟南芥成株A ：the impregnated ArabidopsisB ：resistant shoots of T 1generationC ：T 1generation Arabidopsis seedlingD ：the mature plant of T 1generationE ：resistant shoots of T 2generationF ：T 2generation Arabidopsis seedlingG ：the mature plant of T 2generation·16·张思维等：农杆菌介导DR 1372基因转化拟南芥的研究第2期图4转DR 1372基因拟南芥PCR 检测Fig．4PCR test of DR 1372gene in transgenic plantsM ：DL2000maker ；1：阳性对照；14：阴性对照（野生型）；2－13：抗性植株M ：maker ；1：positive control ；14：Negative controls （WT ）；2－13：Transformed plants3．4转DR 1372基因拟南芥幼苗对盐胁迫的反应当转DR 1372基因拟南芥T 2代和非转基因植株种子发芽生长至第3片叶时，分别添加0、100、200、250和300mmol /L 的NaCl 溶液．NaCl 胁迫7d 后，转DR 1372基因拟南芥植株与非转基因植株的生长发育状态发生了很大的变化，并且相同浓度下转基因植株与非转基因植株的萎蔫程度也有着明显的差别（如图5）．当NaCL 胁迫浓度为100mmol /L 时，非转基因植株叶片开始黄化，盐环境已经对拟南芥的生长产生抑制，而转基因植株未受影响；当NaCL 浓度达到200mmol /L 时，非转基因拟南芥的叶片和茎部黄化程度加重，植株开始萎蔫，同时转基因植株部分叶片也出现黄化；当NaCL 浓度达到250mmol /L 时，转基因拟南芥植株与非转基因植株都出现了不同程度的萎蔫死亡，但非转基因植株萎蔫程度要比转基因植株严重；当NaCL 浓度达到300mmol /L 时，非转基因拟南芥绝大部分萎蔫死亡，转基因植株虽然叶片和茎部出现萎蔫发紫，但死亡程度较小，部分植株仍能正常生长存活，说明转基因拟南芥有一定的抗盐能力，盐胁迫环境下下，DR 1372基因在一定程度上调控了植株度过盐环境．图5转DR 1372基因拟南芥幼苗对盐胁迫的反应Fig．5Growth of transgenic and wild type Arabidopsis seedlingstreated with different concentrentions of NaCL·26·第32卷绵阳师范学院学报（自然科学版）4讨论近几年许多与植物抗旱耐盐相关基因被克隆和分析，同时通过转基因技术将这些基因转入到植物中进行异源表达，能显著提高转基因植物的抗旱耐盐能力．其中转录因子通过与相关基因的特异性结合来调控其表达，进而产生相关调控蛋白等物质增强植物在逆境中的生存能力［12］．DR 1372基因的蛋白中有WHy结构域，这结构域是通过对HIN1蛋白进行分析鉴定的一种独特的结构域．Francesca D 、Ciccarelli 、Peer Bork ［9］等人研究表明，WHy 结构域在植物中具有抗水分胁迫和高敏反应等干燥应答功能．WHy 功能域作为一种干燥响应蛋白，在国内的研究中外鲜有报道，在植物体内的抗水分胁迫应答机制中，是WHy 功能域独自发挥了作用还是能够识别某些特定的序列而协同发挥响应，这一问题有待进一步探究．对转化了DR 1372基因的大肠杆菌进行定性分析发现，逆境下的大肠杆菌中细胞膜很稳定，其细胞膜调节细胞内外渗透压的能力很强．由此推断，将DR 1372基因通过基因工程手段转入植物中，该基因可能会提高植物抗旱性，以此为基础通过培育抗旱品种，以降低干旱对农作物产量的影响．拟南芥是转基因最好的模式植物，由于其基因高度纯合，并且自花授粉，能够快速鉴定基因的相关作用．本研究通过基因工程手段成功将外源基因DR 1372转入了拟南芥基因组中．实验中构建了DR 1372－pBI121载体，载体上带有一个GUS 基因，以及CaMV35S 强启动子和NOS 终止子，能够稳定调控DR 1372基因在植物中的表达．利用冻融法将植物表达载体DR 1372－pBI121载体导入农杆菌GV3103，最后利用根癌农杆菌介导法成功将外源基因DR 1372整合到拟南芥．对DR 1372基因拟南芥幼苗进行盐胁迫反应，发现转基因植株与非转基因植株在盐胁迫反应过程中，当NaCL 浓度较小时，虽然植株的生长都受到了抑制性影响，但转DR 1372基因拟南芥植株的抑制作用明显小于非转基因植株，当浓度达到300mmol /L 时，非转基因植株基本萎焉死亡，而部分抗性植株仍能存活生长，说明DR 1372基因在拟南芥中的表达明显改善了转基因植株的耐盐性．本实验通过基因工程手段，成功得到转DR 1372基因阳性植株，盐胁迫处理发现阳性植株比非转基因植株有更强的耐盐功能，这为后续该基因或类似功能基因的抗旱、抗盐性研究提供了丰富的植物材料和理论依据．参考文献：［1］李晓慧，董明伟，刘康．植物抗旱基因及其功能研究进展［J ］．江苏农业科学，2009，5（4）：73－77．［2］Pilon －Smits E A H ，Ebskamp M J M ，Paul M J ，et al．Improved performance of transgenic fructanaccumulating tobacco un-der drought stress ［J ］．Plant Phyiol ，1995，107：125－130．［3］Kishor P B K ，Hong Z ，M iao G ，Hu C A ，et al．Overexpression of pyrroline carboxylase synthase increase proline productionand confersosmotolerance in transgenic plants ［J ］．Plant Physiol ，1995，108：1367－1394．［4］Capell T ，Escobar C ，Liu H ，et al．Overexpression of the oatarg in inedecarboxylase cDNA in transgenic rice affects normaldevelopment patterns in vitro and result in putrescine accumulation in transgenic plants ［J ］．Theor Appl Genetics ，1998，97：246－254．［5］Chen J．and Wang Z．Y．Progress in the study of plant mybtranscription factors ，Zhiwu Shengli Yu Fenzi Shengwuxue Xuebao（Journal of Plant Physiology andMolecular Biology ），2002，28（2）：81－88．［6］Anderson ，A．W ，Nordon ，H．C ，Cain ，R．F．，et al．Studies on a radio －resistant micrococ －cus．I．Isolation ，morpholo-gy ，cultural characteristics ，and resistance to gamma radiation ［J ］．Food Technol ，1956，10：575－578．［7］White O ，Eisen J ．A ，Heidelberg J ．F ，et al．Genome sequence of the radio －resistant bacterium Deinococcus radioduransR1［J ］．Science ，1999，286：1571－1577．［8］Cominelli E ，Sala T ，Calvi D ，et a．l Over exp ression of the Arabidopsis AMYB 41genealters cell expans ion and leaf surfacepermeability ［J ］．Plant Journal ，2008，53（1）：53－64．［9］Francesca D．Ciccarelli and Peer Bork ．The WHy domain mediates the response to desiccation in plants and bacteria ［J ］．Discovery Note ，2005，8：1304－1307．［10］Ingram J ，Bartels D．The molecular basis of dehydration tolerance in plants ［J ］．Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol ，1996，47：377－403．［11］刘广宇，魏令波，陈吉龙，等．植物脱水素研究进展［J ］．生物工程进展，2001，21（2）：35－38．［12］陈丽萍，何道一．植物抗旱耐盐基因的研究进展［J ］．生物工程进展，2010，29（3）：542－549．·36·张思维等：农杆菌介导DR 1372基因转化拟南芥的研究第2期On Agrobacterium －mediated Transformation ofDR 1372Gene into Arabidopsis thalianaZHANG Si －wei ，ZHOU Wen －bo ，ZHANG xin ，CHEN Cui －na ，DAI Qi －lin *（School of Life Science and Engineering ，Southwest University of Scienceand Technology ，Mianyang ，Sichuan 621000）Abstract ：DR 1372is cloned from an extremely radiation resistant bacterium which named D．radiodurans．It contains a special domain called Why which may be involved in the mechanism of drought resistance of plants．In this study ，the plant expression vector DR 1372－GV 3103was firstly constructed and DR 1372gene was inserted into Arabidopsis successfully by using the transgenic technique．Then ，positive plants have got a salt stress and the results show that DR 1372gene improves the salt tolerance of Arabidopsis obviously．Thus ，it not only contributes good conditions to later research on DR 1372gene ，but also has great important application in plant gene engineer-ing technology．Key words ：DR 1372；Construction of express vector ；Salt stress ；Arabidopsis thaliana（上接第50页）On Extractives from Natural HerbsUsed in Functional CosmeticsHU Li －chuan 1，MEI Shuang 1，YANG Tong －xiu 1，CHEN Lang 2，YU Zong －lan 2，Guo Ting －ting 2，CHEN Ying 1（1．School of Chemistry ＆Chemical Engineering ，2．School of Life Science and Technology ，Mianyang Normal University ，Mianyang ，Sichuan 621000）Abstract ：This paper is to introduce a new paste functional cosmetic and a percutaneous absorption acne patch with competence of essential oil from wormwood and artemisia apiacea ，their physicochemical index ，antimi-crobial effect ，pox －eliminating effect have been tested ，and the results are as follow ，these two have good stabili-ty ，compatibility ，anti －bacterial activity ，and certain pox －eliminating effect．Key words ：Wormwood ；artemisia apiacea ；essential oil ；cosmetic ；anti －bacterial activity ·46·第32卷绵阳师范学院学报（自然科学版）。
农杆菌介导植物的遗传转化实验报告
农杆菌介导植物的遗传转化实验报告
本实验使用农杆菌介导植物的遗传转化技术，将外来基因导入到拟南芥植物中。
通过将拟南芥的幼苗浸泡在农杆菌中，再经过一定的培养条件，使外来基因被顺利地导入到拟南芥植物的细胞中，并观察到了转化成功的基因表达现象。
实验过程：
1. 构建外源基因载体——将目的基因把它克隆进载体中，构建出我们所需要的质粒；
2. 建立农杆菌表达载体——通过将农杆菌表达载体连接到质粒上，形成我们的转化载体；
3. 准备转化基质——通过将农杆菌营养培养在一定条件下，形成我们所需要的转化基质；
4. 转化拟南芥中——通过将拟南芥幼苗浸泡到农杆菌基质中，利用细胞壁酶和孔道蛋白结合作用，导入外源基因，最终实现基因转化；
5. 鉴定转化水平——通过将转化后的拟南芥植株置于含有抗生素的培养基中，筛选出转化成功的植株。
实验结果：
通过观察实验结果，我们发现拟南芥细胞成功地接受了外源基因，使其表达了目
的蛋白。
同时，通过筛选，我们也成功得到转化成功的植株。
结论：
农杆菌介导植物的遗传转化技术是一种有效的基因转化方法，可以将外源基因导入到植物细胞中，从而实现第二代遗传分析、基因功能研究、新品种选育等方面的应用。
拟南芥遗传转化实验报告
一、实验目的本实验旨在通过农杆菌介导法对拟南芥（Arabidopsis thaliana）进行遗传转化，将目的基因导入拟南芥基因组中，并通过筛选和鉴定得到转基因植株。
二、实验材料1. 拟南芥（T0代）植株2. 根癌土壤杆菌（Agrobacterium tumefaciens）GV3101菌株3. 目的基因质粒（含有荧光素酶基因）4. 抗生素：卡那霉素、氯霉素5. 培养基：MS培养基、N6培养基、再生培养基6. 仪器：离心机、PCR仪、荧光显微镜等三、实验方法1. 构建重组表达载体将荧光素酶基因插入到农杆菌转化载体pCAMBIA1300中，构建重组表达载体pC1300-FRT::GUS。
2. 农杆菌转化将重组表达载体转化根癌土壤杆菌GV3101菌株，通过平板划线法筛选阳性克隆。
3. 拟南芥转化将阳性克隆的农杆菌悬浮液与拟南芥（T0代）花序进行蘸花处理，将蘸花后的拟南芥放入MS培养基中培养。
4. 筛选和鉴定在含有卡那霉素的培养基上筛选转基因植株，通过PCR检测和荧光显微镜观察GUS 基因的表达情况，鉴定转基因植株。
5. 再生和繁殖将转基因植株移栽至N6培养基中培养，待植株生长稳定后，收集种子进行繁殖。
四、实验结果1. 构建重组表达载体成功构建了含有荧光素酶基因的重组表达载体pC1300-FRT::GUS。
2. 农杆菌转化通过平板划线法筛选到阳性克隆，表明重组表达载体已成功转化根癌土壤杆菌GV3101菌株。
3. 拟南芥转化蘸花处理后，部分拟南芥植株在含有卡那霉素的培养基上生长，表明转基因植株已成功筛选。
4. 筛选和鉴定通过PCR检测和荧光显微镜观察，发现部分转基因植株GUS基因表达阳性，荧光素酶活性明显。
5. 再生和繁殖将转基因植株移栽至N6培养基中培养，植株生长良好，繁殖成功。
五、实验讨论1. 本实验通过农杆菌介导法成功将荧光素酶基因导入拟南芥基因组中，获得了转基因植株。
2. 在实验过程中，农杆菌转化和拟南芥转化效果良好，表明该实验方法适用于拟南芥遗传转化。
实验三(1)通过根瘤农杆菌转化拟南芥
4．将沉淀用200ml浸染液重悬，形成均匀的农杆菌悬浮液 （OD600=0.8左右），并将农杆菌悬浮液转移到一个敞口 的器皿中（500ml烧杯）。 5．选取初果期的健壮植株，带盆钵一起倒扣于盛有农杆菌悬 浮液的容器上方，将整个花序浸入上述农杆菌悬浮液中约 20-30秒，注意叶片尽量不与浸染液接触。同一个烧杯中 的农杆菌悬浮液可以转化10株或者更多株拟南芥。在此过 程中，尽量避免将蛭石倒入农杆菌悬浮液中。 6．将盆钵取下，横放于暗箱中约24小时。注意保持一定的 湿度。 7．24小时后将处理过的拟南芥植株放于22～25℃的光照条 件下使其正常生长。 8．大约三周后收取成熟种子。
人工改造后的Ti质粒
1.保留T-DNA的转移功能，去掉T-DNA的致瘤性， 有利于转化体再生植株； 2.在T-DNA左右边界序列之间构建一段DNA序列， 其上含有一系列单个的限制性内切酶的识别位点、 即单克隆位点，以利于插入外源DNA和其后的操 作； 3.具有目的基因表达所需的启动子、终止子以及提 供重组细胞筛选的标记基因等； 4.具有使质粒能够在大肠杆菌中进行复制的DNA复 制起始位点，某些载体还同时带有可在农杆菌中 进行复制的起始位点。
思 考 题
1．目前拟南芥稳定表达有几种基本的方法？ 试分析不同转化方法的优缺点。 2．植物转基因技术有哪些应用? 3．拟南芥作为研究植物发育的重要模式植株 之一，请问有哪些特性？
培养基配制
准备—下周筛转基因种子和萌发实验。每两个人一 组，准备下述平板： （1）1个含有卡那霉素（50 mg/L）的 1/2 MS固体 平板； （2）1个1/2 MS固体平板（不含任何抗生素或者是 激素）； （3）一个加200 mM NaCl 1/2 MS固体平板（不含 抗生素）； （4）一个加1µM ABA 2 MS固体。 灭菌后将平板倒好并再4 ℃保存备用。
实验六农杆菌介导转化拟南芥
Hyg基因或Lac Z基因等。
双元载体系统旳转化原理是Ti质粒上 旳Vir基因能够反式激活T－DNA 旳转移。
外外源源基基因因 切
3 转化措施
• 根据受体材料不同分为浸花法、原生质 体共培养法、叶盘法和创伤植物感染法。
• 其中 浸花法、叶盘法在许多植物上得 到广泛应用。
试验流程
1. 挑取活化旳含目旳基因质粒旳单克隆阳性农杆菌GV3101菌 株至5ml 新鲜YEB液体培养基（50g/ml Kan，125g/ml Rif）中，28℃摇培24h。
科植物，二年生草本，高7～40厘米，花期3～5 月。广泛用于植物遗传学、发育生物学和分子生 物学旳研究，已成为一种经典旳模式植物，其原 因主要基于这种植物具有下列特点：
• （1）形态个体小，生活力强,种子量大；
• （2）生长周期快，从播种到收获种子一般只需 6--8周；
• （3）基因组小(2n=10)，是目前已知植 物基因组中最小旳，但是具有完毕“复 杂”旳植物生长发育旳全部基因；
试验六、农杆菌介导转化拟南芥
试验目旳：学习真核生物旳转基因技术及农杆菌介 导旳转化原理。
•试验要求：掌握农杆菌介导转化拟南芥 旳试验措施， 了解拟南芥旳生理特点及在基因工程试验中应用。
• 技术应用：一种以便，高效旳植物转基因措 施，多用于转化双子叶植物，经过改善后也 逐渐用于单子叶植物旳转化。
• 试验材料： 农杆菌GV3101重组菌株，重组双元 体现载体pCAMBIA1300 ，拟南芥
Vir区
2.3 双元体现载体系统源自•双元体现载体系统主要涉及两个部分：
•
一部分为卸甲Ti质粒，此类Ti质粒因为缺失了T
－DNA 区域，完全丧失了致瘤作用，主要是提供Vir
农杆菌实验报告
一、实验目的1. 掌握农杆菌介导的植物基因转化方法。
2. 学习基因转化过程中的操作技巧。
3. 研究农杆菌介导的基因转化在植物遗传育种中的应用。
二、实验原理农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）是一种土壤细菌，它具有将T-DNA（转移DNA）片段转移到植物细胞中的能力。
在植物基因转化实验中，利用农杆菌将目的基因导入植物细胞，进而实现基因的遗传转化。
本实验采用农杆菌介导的方法，将目的基因导入拟南芥（Arabidopsis thaliana）细胞中。
三、实验材料1. 拟南芥植株2. 农杆菌菌株（E. coli DH5α和Agrobacterium tumefaciens C58）3. 载体DNA（含目的基因）4. 限制性内切酶和连接酶5. 载体质粒（含T-DNA序列）6. 抗生素（卡那霉素和壮观霉素）7. 培养基和试剂四、实验方法1. 构建重组载体：将目的基因克隆到载体质粒中，并构建重组载体。
2. 农杆菌转化：将重组载体与农杆菌共同培养，使目的基因转移到农杆菌中。
3. 农杆菌感染：将转化后的农杆菌与拟南芥植株进行共培养，使农杆菌感染拟南芥细胞。
4. 抗性筛选：将感染后的拟南芥植株在含有抗生素的培养基上培养，筛选出含有目的基因的植株。
5. 基因表达检测：通过PCR、RT-PCR等方法检测目的基因在转化植株中的表达情况。
五、实验结果与分析1. 重组载体的构建：通过PCR和测序验证，成功构建了含目的基因的重组载体。
2. 农杆菌转化：经过共培养和感染，拟南芥植株表现出明显的抗性。
3. 抗性筛选：在含有抗生素的培养基上，成功筛选出含有目的基因的植株。
4. 基因表达检测：通过PCR和RT-PCR实验，证实目的基因在转化植株中得到了表达。
六、实验结论1. 成功构建了含目的基因的重组载体。
2. 农杆菌介导的基因转化方法在拟南芥中取得了较好的效果。
3. 通过抗性筛选和基因表达检测，验证了目的基因在转化植株中的稳定遗传和表达。
农杆菌转化和侵染拟南芥及其种子的消毒与筛选
一、拟南芥种子的消毒1、网筛：硅胶干燥过两三周的种子，用漏网筛滤几遍，尽量除去皮壳等杂质，倒入EP管中；2、消毒：于超净台上，用无菌枪头，向EP管中加入1ml的70% 酒精，并计时8分钟，在此期间不停的振荡，以使种子与酒精充分接触，最后12000rpm离心30s；3、洗涤：回到超净台上，酒精消毒双手，用无菌枪头将70% 酒精吸出，更换无菌枪头，吸取1ml无菌水加入管中，反复颠倒振荡，以使种子与无菌水充分接触，最后12000rpm离心30s；重复上述操作两次；4、春化：无菌枪头吸取1ml无菌水，加到种子EP管中，放入4℃冰箱中三天。
二、表达载体克隆构建转化农杆菌1、冲洗电击杯：水龙头下流水冲洗3min以上；于超净台上无菌水冲洗：用无菌蓝枪头将无菌水加入电击杯中，然后吸出并打入电击杯底部狭缝，如此重复吹打几次，再换成新的无菌水，如此反复3次；无水乙醇冲洗，同上反复3次；70%酒精冲洗，同上反复3次；最后无水乙醇冲洗1次，并平放于枪头盒上对着超净台风向吹干；2、加样：将已经吹干的电击杯放在冰上预冷，与此同时，从-20℃取出的质粒解冻后亦放在冰上预冷；然后从-80℃中取出已制备好的农杆菌感受态，解冻时离心几秒钟使其均匀分布（储存完整量为50ul）；准备工作做好后，白枪头吸取质粒1ul打入50ul农杆菌感受态细胞中，然后轻轻反复吹打使两者混匀，再用黄枪头全部吸出，沿着电击杯内壁或侧壁打入缝隙中，最后放于冰上保持低温；3、电击：插上电击仪电源，打开开关，调至Bacteria，调至Agr（农杆菌），将电击杯外壁突出面放在前面，并放在电击仪槽中，然后将槽推进去，使两边电击卡住，最后摁下Pulse脉冲进行电击，听到蜂鸣后取出电击杯放回冰上；4、复苏：于超净台上，沿电击杯内壁，往电击杯狭缝中，加入800ul无抗LB培养液，然后换用黄枪头，反复吸出培养液并吹打底部感受态细胞，使其悬浮起来，最后吸到2ml无菌EP管中，于28℃恒温箱中复苏1～2小时；5、涂板：复苏结束后，将菌液涂至含有利福平（菌种自身抗性）和表达载体抗性抗生素的固体培养基平板上，于28℃恒温箱中倒置过夜培养；三、侵染拟南芥植株1、栽种：将春化种子点在土里，隔两天浇一次水；2、打顶：拟南芥幼苗抽薹两三天后，去除其顶上花序，注意要避免伤及叶生花序；3、转化：打顶三四天后，进行侵染转化。
拟南芥转化流程
拟南芥转化流程拟南芥（Arabidopsis thaliana）是一种常用的模式植物，被广泛用于植物生物学研究。
拟南芥转化是指将外源基因导入拟南芥的过程，通过转化技术，可以使拟南芥表达特定的基因，从而研究基因功能、调控机制以及植物生长发育等方面的问题。
下面将详细介绍拟南芥转化的流程。
一、前期准备工作在进行拟南芥转化之前，首先需要准备一些实验材料和试剂。
这些包括拟南芥种子、培养基、细菌菌株、质粒载体等。
同时还需要准备一些实验器材，如离心管、琼脂糖凝胶、PCR仪等。
二、质粒构建在进行拟南芥转化之前，需要构建含有目标基因的质粒。
质粒通常由多个部分组成，包括启动子、目标基因、选择标记等。
在构建质粒时，需要使用PCR技术扩增目标基因，并经过酶切、连接、转化等步骤，最终得到完整的质粒。
三、细菌转化和筛选构建好的质粒需要通过细菌转化来扩增。
将质粒导入适当的细菌菌株中，利用培养基和培养条件培养细菌，使其扩增质粒。
之后，通过筛选等手段，得到含有目标质粒的细菌菌落。
四、DNA提取和验证从筛选出的细菌菌落中提取质粒DNA，可以使用商业化的DNA提取试剂盒进行提取。
提取得到的DNA需要进行酶切鉴定，通过PCR扩增目标基因进行验证。
同时，还可以使用限制性片段长度多态性（RFLP）等技术对质粒进行进一步的验证。
五、拟南芥转化得到验证合格的质粒后，就可以进行拟南芥转化了。
常用的转化方法有农杆菌介导法和冷冻法。
在农杆菌介导法中，将构建好的质粒导入农杆菌中，然后将农杆菌与拟南芥叶片进行共培养，利用农杆菌的侵染能力将质粒导入拟南芥细胞中。
而冷冻法则是将拟南芥种子与农杆菌共同处理，通过冷冻和解冻的过程，使质粒导入拟南芥种子中。
六、筛选和培养转化完成后，需要对转化成功的拟南芥进行筛选和培养。
通常会在培养基中添加适当的选择标记，如抗生素等，以筛选出含有目标基因的拟南芥植株。
筛选出的植株可以继续培养，在适当的生长条件下进行生长发育观察和功能验证。
拟南芥蘸花法
农杆菌蘸花转化拟南芥法1、将低温保存的带有表达载体的农杆菌菌株，分别在对应抗性平板上划线，挑取单菌落接种于5ml的已加入对应抗生素的液体LB培养基中，28℃下250rpm振荡培养18-24h；2、然后相同条件下按照1:100接种扩大培养，总菌液体积为200ml，直到OD600值在0.8-1.0范围内；3、离心沉淀并去上清液，用等体积的5%的蔗糖溶液重悬菌体，在菌液中加入0.02%-0.04%的SilwetL-77混匀；4、将拟南芥的花序在菌液中蘸取0.5-1min即可(在转化前要先将拟南芥的角果剪掉);5、然后将拟南芥苗放置于黑暗，湿润的条件下16h，一周后，重复侵染一次；6、收种后种植后代，向12d的幼苗上喷洒54mg/ml除草剂或在将种子播种于抗性MS平板上以筛选阳性植株。
拟南芥播种1、将拟南芥种子用50%的84消毒液表面消毒6-8 min，继而用无菌水漂洗3次;2、在0.1%琼脂糖中悬浮，然后播种在抗性的MS培养基上，4ºC低温避光处理2天后，转入光照培养室生长。
3、幼苗7d左右便可筛到阳性植株，并移栽到含有蛭石的营养土中继续生长（蛭石：营养土=1：3）。
植株种植的培养箱维持22℃恒温和16h光照/8h黑暗培养的循环培养条件。
注：几种常用抗生素的工作液浓度Kanamycin 50μg/mlGentamicin 50μg/mlRifampicin 25-50μg/mlHygromycin 50μg/mlBarstar 25-50μg/ml注：MS培养基配方（1L）MS盐 4.4gMES 0.5g蔗糖10g调PH至5.8-6.0加Agar 10g(在抗性MS培养基上筛选阳性转基因植株时可不加蔗糖防止长菌)42. Schägger H, von Jagow G (1987) Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1 to 100 kDa.AnalBiochem166:368–379.。
农杆菌介导的拟南芥转基因技术方法探究
农杆菌介导的拟南芥转基因技术方法探究农杆菌介导的植物转基因技术在研究植物基因功能、改良作物农艺性状等方面发挥着重要作用。
拟南芥作为模式植物，是研究植物基因功能的重要材料。
本文主要介绍农杆菌介导的拟南芥转基因方法——浸花法。
该方法操作简单，转化效率高，易于在中学生物实验教学中推广。
通过该实验，可以培养中学生对于生物学科的兴趣，提高学生对于生物知识的理解力和创新能力。
标签：植物转基因；农杆菌；浸花法植物转基因技术是指把目的基因通过各种方法转移到植物基因组中，使之稳定遗传。
利用该技术研究基因在植物个体生长发育以及生理代谢过程中功能，研究成果可应用于农艺性状的改良、植物经济价值和观赏价值的提高等方面。
植物基因转化的方法可分为直接转化和载体介导两种转化方法。
基因直接导入法直接将外源目的基因导入植物的基因组中，包括基因枪转化法、电激转化法、超声波法、显微注射法和激光微束法、PEG 介导转化方法、脂质体法和花粉管通道法等；载体介导的转化方法需要将目的基因插入到改造后的农杆菌质粒或病毒的DN分子上，利用农杆菌或病毒对植物的侵染作用将目的基因导入到植物基因组中。
农杆菌介导的转化方法具有应用范围广，转化率高，单拷贝比例高，转化子稳定等特点，是植物转基因研究中的常用转化方法。
农杆菌能在自然条件下感染大多数双子叶植物受伤部位，并诱导产生冠瘿瘤或发状根。
在农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后，农杆菌中Ti质粒上的T-DNA可以插入到植物基因中。
科研人员经过长期的研究，将目的基因插入到经过改造T-DNA区，借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移和整合，从而获得转基因植株。
利用农杆菌介导的转化方法进行转基因操作时，根据植物材料的不同，采用不同的转化方法，如在烟草转化时常采用叶盘法，而水稻转化则采用愈伤组织转化的方法。
浸花法（floral tip）是拟南芥转化最常用的方法。
这种转化方法不需要组织培养和再生植株的过程，操作简便、转化效率较高，为科研人员提供了极大的便利。
实验六、农杆菌介导转化拟南芥
• （1）形态个体小，生活力强,种子量大；
• （2）生长周期快，从播种到收获种子一般只需 6--8周；
• （3）基因组小(2n=10)，是目前已知植 物基因组中最小的，但是具有完成“复 杂”的植物生长发育的所有基因；
2. 取上述菌液0.1ml 接至50ml 新鲜YEB液体培养基（50 g/ml Kan，125 g/ml Rif）中，28℃ 220rpm培养2～4h， 使OD值达到0.8左右。
3.取上述菌液1ml于EP管中，室温22℃，5500g，离心15min， 弃去上清，用转化介质重悬沉淀至OD值达到0.8左右。
Hale Waihona Puke • 为了提高转化率，去除塑料袋3d后，用吸管吸 取适量重悬目的质粒的新鲜转化液，逐个醮沾 花蕾。
说明
• 转化后拟南芥的培养恢复正常管理，一旦再出现 侧蘖或主苔出现分枝，及时剪除。
• 转化5-6周后，为了加速拟南芥成熟可以适量少浇 营养液。待拟南芥个别角果开始枯黄后，可将其 角果剪下放于培养皿内干燥。拟南芥角果大部分 枯黄后，即可收取全部种子存于1.5ml 的EP管中 （在盖上扎一小孔以便干燥）。种子完全干燥后， 放于1.5ml 新EP管中4℃短期保存。如需要可放于 -20℃冰箱内长期保存。
Vir区
2.3 双元表达载体系统
•
双元表达载体系统主要包括两个部分：
•
一部分为卸甲Ti质粒，这类Ti质粒由于缺失了T
－DNA 区域，完全丧失了致瘤作用，主要是提供Vir
基因功能，激活处于反式位置上的T－DNA的转移。
拟南芥的遗传转化
用移液器转移到吸附柱 CP3 中，注意 尽量不要吸出沉淀。12，000 rpm 离心 30s，倒掉收集管中的废液；第六，向 吸 附 柱 CP3 中 加 入 300μl 漂 洗 液 PWT，12，000 rpm 离心 30s，倒掉收 集管中的废液；第七，重复步骤六； 第八，将吸附柱 CP3 放入收集管中， 12，000 rpm 离心 1 min，目的是将吸 附柱中残余的漂洗液去除；第九，将 吸 附 柱 CP3 置 于 一 个 干 净 的 离 心 管 中，向吸附膜的中间部位滴加 50μl 洗 脱缓冲液 TB，12，000 rpm 离心 30s 将 质粒溶液收集到离心管中。进行质粒 提取后，用两个内切酶 Bgl II 和 Pml Ι 分别对 pGM－T－目的基因的质粒和 pCAMBIA3301 载体进行双酶切。加样 结束后，混匀，37℃酶切 10h。酶切产 物进行琼脂糖凝胶电泳，且对目标片 段及 pCAMBIA3301 骨架进行胶回收。 然后，通过连接酶对目标片段和 pCAMBIA3301 骨架进行连接，构建重 组表达载体。转化大肠杆菌 Trans 5α感 受态，挑斑、摇菌，进行菌液 PCR 检 测。挑取阳性 pCAMBIA3301－目的基 因克隆提取质粒，进行双酶切验证和 测 序 。 测 序 正 确 后 ， 阳 性 pCAM⁃ BIA3301－目的基因克隆质粒转化农杆 菌 EHA105 感受态。
学术探讨
XU E SHU TA N职业学院 刘晓丽 魏 楠
摘 要：通过构建重组表达载体，转化农杆菌制作浸染液，实现农杆菌介导法进行目的基因的拟南芥遗传转化，将目的基因转入到野生 型拟南芥中。通过筛选和鉴定后，得到阳性的转基因植株，最终得到纯合 T3 代转基因株系。后续可以通过对纯合转基因株系和野生型拟南 芥进行比较鉴定，即可推断目的基因在拟南芥中的功能。
拟南芥的遗传工程
拟南芥的遗传工程拟南芥是一种小型的花卉植物，也是遗传学研究中最为常用的模式生物之一。
开展拟南芥的遗传工程可以为其生长方式、形态特征、反应机制等方面的研究提供有力的支持，有助于进一步深化人类对生命运作机理的认识。
拟南芥的基本遗传信息拟南芥是对称性叶状植物茎节数量达到300，花的蕾囊非常小，可在显微镜下观察。
其基因组大小约为125兆字节，核基因组具有5条染色体，端粒长度不到3kb，叶绿体长度为154kb，其每个细胞都有大约12个叶绿体。
拟南芥拥有约27,000个基因，占整个基因组大小的20％。
拟南芥的遗传转化技术目前，拟南芥的遗传转化技术主要包括农杆菌介导的遗传转化和生物素-结构的介导遗传转化。
农杆菌介导遗传转化技术是一种利用农杆菌侵染细胞后将遗传物质转移至目标生物细胞的技术。
该技术可通过简单、稳定和快速的途径将确定的DNA序列插入到植物细胞的基因组中，从而实现外来源基因的改变。
尽管农杆菌介导遗传转化技术在多数作物上都有广泛应用，但该技术在转移DNA之后，难以控制新的基因组改变和位置影响，这可能影响实验结果的可重复性。
与此不同，生物素-结构的介导遗传转化技术可在不需要遗传材料经过的过程中向植物细胞输送纯的DNA检测表头结果。
介导者生物素(med‐strombin) 在植物细胞中易与融合度高的DNA结合，制造出具有生物素的DNA结合来，从而实现把选定的DNA序列插入到目标生物细胞的有选择性的插入和表达。
拟南芥遗传转化技术的应用拟南芥可以被用来研究染色体的分离和纯化以及基因的表达、诱变和注释等方面。
这些特性被广泛应用于遗传学和分子生物学实验中，以支持人类对生命机理的认识。
例如，在研究肿瘤的起源和发展过程中，拟南芥可以被用来研究基因表达的变异以及肿瘤细胞与正常细胞之间基因表达模式的异同。
此外，拟南芥还可以被用于探究人类疾病的发病机制，帮助科学家更好地理解和治疗多种疾病。
结论拟南芥的遗传工程为遗传学和分子生物学的发展提供了强有力的支持。
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实验目的： 1. 学会农杆菌的转化遗传转化及培养等 2. 学习真核生物的转基因技术及农瘤杆菌介导的 遗传转化转化原理。 实验要求： 1. 掌握农杆菌介导转化拟南芥的实验方法；
2. 了解拟南芥的生理特点及在基因工程实验中应用。
• 实验材料：农杆菌AGL1重组菌株，重组双元表达载体 PBI101，拟南芥 • 试剂：
冠瘿瘤
Ti质粒的结构
( tms ) iaa H iaa M Auxin LB ( tmr ) tmt )
Vir 区
Ti plasmid
Opine 代 谢 区
复 制 起 始 区
Ti质粒致瘤的分子机制
2.3 双元表达载体系统
双元表达载体系统主要包括两个部分： 一部分为卸甲Ti质粒，这类Ti质粒由于缺失了T－
2. 取上述菌液0.1ml 接至50ml 新鲜LB液体培养基（50 g/ml Kan，100 g/ml Rif）中，28℃ 220rpm培养2～4h，使OD 值达到0.8左右。 3. 取上述菌液1ml于EP管中，室温22℃，5500g，离心15min， 弃去上清，用转化介质重悬沉淀至OD值达到0.8左右。
• LB液体培养基，Kan（卡那霉素），Rif（利福平）；
转化介质 ：5%蔗糖，0.02%
1. 模式植物： 拟南芥
1.1 简介：
拟南芥（Arabidopsis thaliana）是一种十字花科植物，其作 为一重典型的模式植物被广泛用于植物遗传学、发育生物学 和分子生物学的研究。 （1）形态个体小，生活力强,种子量大；
DNA 区域，完全丧失了致瘤作用，主要是提供Vir基
因功能，激活处于反式位置上的T－DNA的转移。
另一部分是微型Ti质粒(Mini-Ti plasmid)，它在T－
DNA左右边界序列之间提供植株选择标记，如Hyg基 因或Lac Z基因等。
双元载体系统的转化原理：Ti质粒上的Vir基因可以 反式激活T－DNA 的转移。
（2）生长周期快，从播种到收获种子一般只需6--8周；
（3）基因组小(2n=10)，是目前已知植物基因组中最小的，但是 具有完成“复杂”的植物生长发育的所有基因；
（4）拟南芥是自花授粉植物，易于获得纯合突变体。
2. 转化原理
• 2.1 农杆菌对双子叶植物的创伤部位侵染广泛，在 某些条件下对单子叶植物也有一定的感染性。 • 2.2 根癌农杆菌含有 Ti (tumor-inducing plasmid) 质粒，Ti 质粒上的 T-DNA（transferred DNA） 在 Vir区（virulence region）基因产物的作用下可 以插入到植物基因组中，诱导在宿主植物中瘤状 物的形成。因此，将外源目的基因插入到 TDNA 中，借助 Ti 质粒的功能，使目的基因转移 进宿主植物中并进一步整合、表达。
LB
T-DNA
RB
Vir
农杆菌
大肠杆菌
转化
LB
T-DNA
RB
Vir
感染植物细胞
3. 转化方法
• 根据受体材料不同分为浸花法、原生质体 共培养法、叶盘法和创伤植物感染法。 • 其中 浸花法、叶盘法在许多植物上得到广 泛应用。
浸花法的实验流程
1. 挑取活化的含目的基因质粒的单克隆阳性农杆菌菌株至2ml 新鲜LB液体培养基（50g/ml Kan，100g/ml Rif）中， 28℃摇培24h。
• 转化后拟南芥的培养恢复正常管理，一旦再出现侧蘖或主苔 出现分枝，及时剪除。 • 转化5-6周后，为了加速拟南芥成熟可以适量少浇营养液。待 拟南芥个别角果开始枯黄后，可将其角果剪下放于培养皿内 干燥。拟南芥角果大部分枯黄后，即可收取全部种子存于 1.5ml 的EP管中（在盖上扎一小孔以便干燥）。种子完全干 燥后，放于1.5ml 新EP管中4℃短期保存。如需要可放于20℃冰箱内长期保存。
4. 将待转化的拟南芥植株平放，将花蕾部分插入2mlEP管中， 加入上述转化液，浸染3-5min(如图)。轻轻甩掉浸液，做 好标记。
农杆菌介导转化拟南芥
转化后的管理
• 在箱底撒水保湿，然后将花盆平放到箱子中，并用塑料袋罩 住箱子暗培养16-24h（过夜）后，将拟南芥放置于塑料培养 池内，并浇足horgland营养液，恢复正常培养。 • 为了提高转化率，去除塑料袋3d后，用吸管吸取适量重悬目 的质粒的新鲜转化液，逐个醮沾花蕾。