农杆菌介导转化拟南芥
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实验七、农杆瘤菌介导转化拟南芥
实验目的： 1. 学会农杆菌的转化遗传转化及培养等 2. 学习真核生物的转基因技术及农瘤杆菌介导的 遗传转化转化原理。 实验要求： 1. 掌握农杆菌介导转化拟南芥的实验方法；
2. 了解拟南芥的生理特点及在基因工程实验中应用。
• 实验材料：农杆菌AGL1重组菌株，重组双元表达载体 PBI101，拟南芥 • 试剂：
4. 将待转化的拟南芥植株平放，将花蕾部分插入2mlEP管中， 加入上述转化液，浸染3-5min(如图)。轻轻甩掉浸液，做 好标记。
农杆菌介导转化拟南芥
转化后的管理
• 在箱底撒水保湿，然后将花盆平放到箱子中，并用塑料袋罩 住箱子暗培养16-24h（过夜）后，将拟南芥放置于塑料培养 池内，并浇足horgland营养液，恢复正常培养。 • 为了提高转化率，去除塑料袋3d后，用吸管吸取适量重悬目 的质粒的新鲜转化液，逐个醮沾花蕾。
2. 取上述菌液0.1ml 接至50ml 新鲜LB液体培养基（50 g/ml Kan，100 g/ml Rif）中，28℃ 220rpm培养2～4h，使OD 值达到0.8左右。 3. 取上述菌液1ml于EP管中，室温22℃，5500g，离心15min， 弃去上清，用转化介质重悬沉淀至OD值达到0.8左右。
（2）生长周期快，从播种到收获种子一般只需6--8周；
（3）基因组小(2n=10)，是目前已知植物基因组中最小的，但是 具有完成“复杂”的植物生长发育的所有基因；
（4）拟南芥是自花授粉植物，易于获得纯合突变体。
2. 转化原理
• 2.1 农杆菌对双子叶植物的创伤部位侵染广泛，在 某些条件下对单子叶植物也有一定的感染性。 • 2.2 根癌农杆菌含有 Ti (tumor-inducing plasmid) 质粒，Ti 质粒上的 T-DNA（transferred DNA） 在 Vir区（virulence region）基因产物的作用下可 以插入到植物基因组中，诱导在宿主植物中瘤状 物的形成。因此，将外源目的基因插入到 TDNA 中，借助 Ti 质粒的功能，使目的基因转移 进宿主植物中并进一步整合、表达。
• LB液体培养基，Kan（卡那霉素），Rif（利福平）；
转化介质 ：5%蔗糖，0.02%
1. 模式植物： 拟南芥
1.1 简介：
拟南芥（Arabidopsis thaliana）是一种十字花科植物，其作 为一重典型的模式植物被广泛用于植物遗传学、发育生物学 和分子生物学的研究。 （1）形态个体小，生活力强,种子量大；
LB
T-DNA
RB
Vir
农杆菌
大肠杆菌
转化
LB
T-DNA
RB
Vir
感染植物细胞
3. 转化方法
• 根据受体材料不同分为浸花法、原生质体 共培养法、叶盘法和创伤植物感染法。 • 其中 浸花法、叶盘法在许多植物上得到广 泛应用。
浸花法的实验流程
1. 挑取活化的含目的基因质粒的单克隆阳性农杆菌菌株至2ml 新鲜LB液体培养基（50g/ml Kan，100g/ml Rif）中， 28℃摇培24h。
DNA 区域，完全丧失了致瘤作用，主要是提供Vir基
因功能，激活处于反式位置上的T－DNA的转移。
另一部分是微型THale Waihona Puke Baidu质粒(Mini-Ti plasmid)，它在T－
DNA左右边界序列之间提供植株选择标记，如Hyg基 因或Lac Z基因等。
双元载体系统的转化原理：Ti质粒上的Vir基因可以 反式激活T－DNA 的转移。
冠瘿瘤
Ti质粒的结构
( tms ) iaa H iaa M Auxin LB ( tmr ) ipt Z Cytokinin Opine RB ( tmt )
Vir 区
Ti plasmid
Opine 代 谢 区
复 制 起 始 区
Ti质粒致瘤的分子机制
2.3 双元表达载体系统
双元表达载体系统主要包括两个部分： 一部分为卸甲Ti质粒，这类Ti质粒由于缺失了T－
• 转化后拟南芥的培养恢复正常管理，一旦再出现侧蘖或主苔 出现分枝，及时剪除。 • 转化5-6周后，为了加速拟南芥成熟可以适量少浇营养液。待 拟南芥个别角果开始枯黄后，可将其角果剪下放于培养皿内 干燥。拟南芥角果大部分枯黄后，即可收取全部种子存于 1.5ml 的EP管中（在盖上扎一小孔以便干燥）。种子完全干 燥后，放于1.5ml 新EP管中4℃短期保存。如需要可放于20℃冰箱内长期保存。
实验目的： 1. 学会农杆菌的转化遗传转化及培养等 2. 学习真核生物的转基因技术及农瘤杆菌介导的 遗传转化转化原理。 实验要求： 1. 掌握农杆菌介导转化拟南芥的实验方法；
2. 了解拟南芥的生理特点及在基因工程实验中应用。
• 实验材料：农杆菌AGL1重组菌株，重组双元表达载体 PBI101，拟南芥 • 试剂：
4. 将待转化的拟南芥植株平放，将花蕾部分插入2mlEP管中， 加入上述转化液，浸染3-5min(如图)。轻轻甩掉浸液，做 好标记。
农杆菌介导转化拟南芥
转化后的管理
• 在箱底撒水保湿，然后将花盆平放到箱子中，并用塑料袋罩 住箱子暗培养16-24h（过夜）后，将拟南芥放置于塑料培养 池内，并浇足horgland营养液，恢复正常培养。 • 为了提高转化率，去除塑料袋3d后，用吸管吸取适量重悬目 的质粒的新鲜转化液，逐个醮沾花蕾。
2. 取上述菌液0.1ml 接至50ml 新鲜LB液体培养基（50 g/ml Kan，100 g/ml Rif）中，28℃ 220rpm培养2～4h，使OD 值达到0.8左右。 3. 取上述菌液1ml于EP管中，室温22℃，5500g，离心15min， 弃去上清，用转化介质重悬沉淀至OD值达到0.8左右。
（2）生长周期快，从播种到收获种子一般只需6--8周；
（3）基因组小(2n=10)，是目前已知植物基因组中最小的，但是 具有完成“复杂”的植物生长发育的所有基因；
（4）拟南芥是自花授粉植物，易于获得纯合突变体。
2. 转化原理
• 2.1 农杆菌对双子叶植物的创伤部位侵染广泛，在 某些条件下对单子叶植物也有一定的感染性。 • 2.2 根癌农杆菌含有 Ti (tumor-inducing plasmid) 质粒，Ti 质粒上的 T-DNA（transferred DNA） 在 Vir区（virulence region）基因产物的作用下可 以插入到植物基因组中，诱导在宿主植物中瘤状 物的形成。因此，将外源目的基因插入到 TDNA 中，借助 Ti 质粒的功能，使目的基因转移 进宿主植物中并进一步整合、表达。
• LB液体培养基，Kan（卡那霉素），Rif（利福平）；
转化介质 ：5%蔗糖，0.02%
1. 模式植物： 拟南芥
1.1 简介：
拟南芥（Arabidopsis thaliana）是一种十字花科植物，其作 为一重典型的模式植物被广泛用于植物遗传学、发育生物学 和分子生物学的研究。 （1）形态个体小，生活力强,种子量大；
LB
T-DNA
RB
Vir
农杆菌
大肠杆菌
转化
LB
T-DNA
RB
Vir
感染植物细胞
3. 转化方法
• 根据受体材料不同分为浸花法、原生质体 共培养法、叶盘法和创伤植物感染法。 • 其中 浸花法、叶盘法在许多植物上得到广 泛应用。
浸花法的实验流程
1. 挑取活化的含目的基因质粒的单克隆阳性农杆菌菌株至2ml 新鲜LB液体培养基（50g/ml Kan，100g/ml Rif）中， 28℃摇培24h。
DNA 区域，完全丧失了致瘤作用，主要是提供Vir基
因功能，激活处于反式位置上的T－DNA的转移。
另一部分是微型THale Waihona Puke Baidu质粒(Mini-Ti plasmid)，它在T－
DNA左右边界序列之间提供植株选择标记，如Hyg基 因或Lac Z基因等。
双元载体系统的转化原理：Ti质粒上的Vir基因可以 反式激活T－DNA 的转移。
冠瘿瘤
Ti质粒的结构
( tms ) iaa H iaa M Auxin LB ( tmr ) ipt Z Cytokinin Opine RB ( tmt )
Vir 区
Ti plasmid
Opine 代 谢 区
复 制 起 始 区
Ti质粒致瘤的分子机制
2.3 双元表达载体系统
双元表达载体系统主要包括两个部分： 一部分为卸甲Ti质粒，这类Ti质粒由于缺失了T－
• 转化后拟南芥的培养恢复正常管理，一旦再出现侧蘖或主苔 出现分枝，及时剪除。 • 转化5-6周后，为了加速拟南芥成熟可以适量少浇营养液。待 拟南芥个别角果开始枯黄后，可将其角果剪下放于培养皿内 干燥。拟南芥角果大部分枯黄后，即可收取全部种子存于 1.5ml 的EP管中（在盖上扎一小孔以便干燥）。种子完全干 燥后，放于1.5ml 新EP管中4℃短期保存。如需要可放于20℃冰箱内长期保存。