胰酶水解猪皮胶原蛋白及其产物氨基酸分析

基酸[12-13]，有其特别的组成。由表 1 可见胶原的氨基酸 酸种类无变化。表明采用胰酶水解猪皮胶原蛋白能显
组成的一些特点。
著提高其营养价值。猪皮胶原蛋白胰酶水解产物中各
表 1 胶原蛋白水解时间对氨基酸含量的影响 Table 1 Comparison of amino acid composition in collagenTrypsin-chymotrypsin hydrolysates at various hydrolysis time
占原料总氮含量/%
1.2 主要仪器设备及试剂
MM12 型绞肉机：广东省韶关市食品机械厂；
CU600 型电热恒温水箱：上海福玛实验设备有限公司；
KDN-2C 型定氮仪：上海纤检仪器有限公司；GL-21M
高速冷冻离心机：长沙湘仪离心机仪器有限公司；UV-
2000 型分光光度计：尤尼柯（上海）仪器有限公司。
试验中所采用试剂均为国产分析纯。
1.3 分析方法 氨态氮含量：水解液中游离氨基酸含量占原料中
总蛋白质含量百分比，采用甲醛电位滴定法[9]分析；可 溶性氮含量：水解液中蛋白质含量占原料中总蛋白质
处理温度 /℃ 图 1 不同热处理温度对猪皮胶原蛋白 Trypsin-chymotrypsin 酶解
产物中氮存在形式影响 Fig.1 Effects of different temperatures on N-forms in Pigskin
解螺旋，每条肽链因伸直而使其螺旋度减少，整个蛋白 的变化能微扰并引起胶原蛋白结构的变化。以上研究 与本试验结论一致，原蛋白质分子致密的立体结构有 碍于蛋白酶与底物的结合，热处理使其成为松散的结 构，暴露原来包埋于内部的作用位点，从而加速了水解 速率。 2.2 胰酶水解猪皮胶原蛋白过程中氮存在形式变化 规律
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食品研究与开发
基础研究
胰酶水解猪皮胶原蛋白及其产物氨基酸分析
胥彩云 1，童军茂 1，周晓宏 2,* （1．石河子大学 食品学院，新疆 石河子 832000；2.北京理工大学 生命科学与技术学院，北京 100081）
摘 要：采用胰酶水解猪皮胶原蛋白，研究其降解规律及酶解产物氨基酸组成。研究表明：95 ℃热处理猪皮胶原蛋白 10 min 能显著提高酶解速率；整个酶解过程中，可溶性氮、氨肽氮含量呈增加趋势，但 3 h 后增势变缓，而肽含量在 3 h 后达到最大值；大部分不溶性蛋白在酶解 6 h 后已经变成可溶性多肽和氨基酸；从酶解产物氨基酸组成可表明，采用 胰酶水解猪皮胶原蛋白能显著提高其营养价值。 关键词：猪皮胶原蛋白；热变性；酶解；氨基酸分析
collagen- Trypsin-chymotrypsin hydrolysates
含量百分比，采用微量凯氏定氮法分析；肽基氮含量： 水解液中肽含量占原料中总蛋白质含量百分比，即可 溶性氮含量与氨基氮含量之差；氨基酸组成分析：日 立 835-50 型氨基酸自动分析仪。 1.4 猪皮水解工艺
酶作用条件采用前期正交优化试验结果。取解冻 后猪皮 50 g，加 100 g 蒸馏水匀浆 1 min，调节初始 pH 至 8.5，升温至 37 ℃，加入 0.3 g 胰酶，于水浴上恒温搅 拌分别水解 2、4、6 、8、10 、12 h 。酶解完毕，将酶解液 于沸水浴中灭酶 20 min，离心（4 800 r/min，20 min）过 滤，所得滤液为酶解产物。其中未水解样为猪皮匀浆 后直接离心过滤的滤液部分，即猪皮水溶性提取物。 所有样品均稀释至 240 g 用于分析。
Trypsin Hydrolysis Pigskin Collagen and its Amino Acid Analysis XU Cai-yun1, TONG Jun-mao1, ZHOU Xiao-hong2,*
（1．College of Food Science，Shihezi University，Shihezi 832000，Xinjiang, China；2. School of Life Science and Technology, Beijing Institute of Technology，Beijing 100081，China）
由图 1 可知，在 90 ℃~100 ℃之间加热预处理可 加速胰酶对猪皮胶原蛋白的水解速率，所以采用胰酶 水解猪皮胶原蛋白时先于 95 ℃处理底物 10 min。再将 猪皮匀浆按照酶解工艺水解不同时间，其产物中氨态 氮、可溶性氮以及肽基氮含量见图 2 。
2 结果与分析 2.1 热处理对胰酶水解猪皮胶原蛋白的影响
Abstract：Pigskin collagen was hydrolyzed by Trypsin-chymotrypsin to explore the degrading pattern and the amino acid composition of the resultinghydrolysate. The results showed that heat Pigskin collagen 10 min at 95 ℃ was advantageous to enzymatichydrolysis of Pigskin collagen. Content of soluble nitrogen and amino nitrogen kept on increasing during hydrolysis, but increased slowly after 3 h hydrolysis. Peptide content reached a maximum after 3 h hydrolysis. A majority of unsoluble protein and peptides were degraded into soluble peptidesand amino acids after 6 h hydrolysis, acid composition in Pigskin collagen hydrolysate suggested that Pigskin collagen hydrolyzed by Trypsin-chymotrypsin improved the nutritional value of Pigskin collagen greatly. Key words：pigskin collagen；heat denaturation；enzymatic hydrolysis；aminoacidanalysis
分子量的肽和氨基酸两个过程，这两个过程在酶解过 氮含量由 63.5 %增加至 87.9 %；氨态氮含量由 10.8 %
程中某一时间段孰占优势对产物中肽的含量有直接 增加至 37.9 %。在整个酶解过程中，可溶性氮、游离氨
的影响，酶解后期，胰酶主要以产物中存在的肽为底 基酸含量呈增加趋势，前 3 h 内增势较快，但 3 h 后增
1 材料与方法 1.1 材料
猪皮购于北京市中关村家乐福超市（冻藏）刮脂、 洗净、缴碎，装袋，置于-18 ℃冰箱中冷冻，试验前从冰
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箱中取出在流动的自来水中源自文库化解冻，备用。
胰酶（Trypsin-chymotrypsin）由丹麦 NOVO 公司提供。
动物皮肤最重要的一个应用就是制革，但是由于 猪皮本身的质地不佳，目前在皮革工业中已经很少采 用猪皮，发展猪皮深加工是猪皮加工业的必然趋势。 猪皮中约含水分 70 ％～75 ％[1]，蛋白质 21 ％～23 ％，脂 肪 1 ％，灰分 0.5 ％。猪皮中的蛋白质以胶原蛋白为主， 含量为 87.7 %。胶原蛋白具有独特的三股超螺旋结 构，三条链相互平行而且由链间氢键相连[2]，具有十分 稳定的性质，一般的加工温度及短时间加热都难使其 分解，因此难被人体吸收，食用利用率较低[3]，将胶原蛋 白水解为多肽后，其营养及生理功能可显著提高：蛋白 质消化吸收率几乎达 100 ％，能保护胃黏膜以及抗溃 疡，促进皮肤胶原代谢，抑制血压上升，对关节炎等胶 原病具有很好的预防及治疗作用，能促进钙吸收和降 低血清中胆固醇含量等[4-6]。胶原蛋白的水解及胶原多
作者简介：胥彩云（1983—），女（汉），在读硕士研究生，研究方向：农 产品加工与贮藏。 * 通信作者
肽的利用一直是科学工作者研究的一个热门课题。因 此，利用酶技术处理猪皮制备胶原蛋白是提高其资源 利用率和附加值的有效途径。目前对猪皮酶水解的研 究集中在水解工艺条件的摸索方面，班玉凤等[7]确定 了 Alcalase 对猪皮胶原蛋白水解的最优条件，王川，李 燕等研究了用胰酶、木瓜蛋白酶和胃蛋白酶从猪皮中 提取胶原蛋白，其中以胰酶提取物得率最高，但结构破 坏较严重，用胃蛋白酶提取的胶原蛋白制品的结构最 完整，色泽最为洁白，但得率最低[8]。本文采用胰酶氮 存在形式、肽分子量分布变化规律以及水解产物的氨 基酸组成，为酶技术应用于生产具高附加值的猪皮深 加工制品(如复合氨基酸和活性肽等)提供参考。
分别取猪皮 50 g，加入 100 g 水匀浆 1 min，分别 于温度为 70、80、90、100 ℃水浴中保温 10 min，然后按 照 1.4 工艺水解 2 h。不同温度处理后猪皮胶原蛋白胰 酶水解产物中氨态氮、可溶性氮以及肽基氮含量见图1。
由图 1 可以看出，水解时间相同时，随着热处理 温度的增加，猪皮胶原蛋白胰酶酶解产物中可溶性氮、 氨基氮含量呈增高趋势，即热变性温度越高，猪皮胶原 蛋白消化率越高，70 ℃以后，这种趋势更加明显。胶原 蛋白的分子量约为 300 000~360 000，它是由 3 条肽链 盘绕而成的三股螺旋结构[10]，但热处理使三股螺旋解 旋而成游离多肽链，破坏分子间的共价交联，引起胶 原中键的随机水解，变成大分子明胶，肖和兰等[11]运用 傅 里 叶 红 外 光 谱 法 （FTIR） 和 二 维 相 关 分 析（2D correlation analysis）技术研究也发现，在 15 ℃~95 ℃升 温过程中，胶原的 3 条螺旋肽链之间的氢键减弱，逐渐
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胶原蛋白为底物，酶解 3 h 时肽含量达到最大值，随后 3 结论
下降，这是由于酶解过程中同时存在着猪皮胶原蛋白
胰酶水解猪皮胶原蛋白研究表明：热处理猪皮胶
降解成肽和氨基酸以及这些肽被进一步降解成更小 原蛋白大大提高酶解速率：热处理后，酶解液中可溶性
占原料总氮含量/%
水解时间/h 图 2 胰酶水解猪皮胶原蛋白过程中氮形式变化 Fig.2 Changes of N-forms during hydrolysis of Pigskin collagen
by Trypsin-chymotrypsin
由图 2 可以看出，随着酶解时间的延长，水解产 物中可溶性氮、游离氨基酸含量不断地增加，且都在水 解 3 h 内增速最快，随后增势变缓；而肽含量也是在水 解 3 h 内增速最快，这表明这段时间胰酶主要以猪皮
%
氨基酸 天冬氨酸
苏氨酸 丝氨酸 谷氨酸 甘氨酸 丙氨酸 缬氨酸 蛋氨酸 异亮氨酸 亮氨酸 酪氨酸 苯丙氨酸 赖氨酸 组氨酸 精氨酸 脯氨酸
种类 ASP THR SER GLU GLY ALA VAL MET ILE LEU TYR PHE LYS HIS ARG PRO
12 h 9.37 2.40 4.76 16.37 41.51 16.53 4.26 1.22 2.20 3.98 0.57 0.87 5.41 0.91 10.79 15.52
物，释放出更小分子量的肽和氨基酸，因此肽的含量表 势缓慢，而肽含量在水解 3 h 达到最大值 48.1 %。大部
现出下降趋势。
分不溶性蛋白在酶解 4 h 后已经变为可溶性多肽和氨
2.3 胰酶水解猪皮胶原蛋白产物氨基酸分析
基酸，蛋白质的溶解过程基本结束。酶解 12 h~48 h 各
一般蛋白质含有 20 种氨基酸，胶原含有 18 种氨 时间段酶解产物中 18 种氨基酸含量略有变化，但氨基