胰酶水解猪皮胶原蛋白及其产物氨基酸分析

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食品研究与开发
基础研究
胶原蛋白为底物，酶解 3 h 时肽含量达到最大值，随后 3 结论
下降，这是由于酶解过程中同时存在着猪皮胶原蛋白
胰酶水解猪皮胶原蛋白研究表明：热处理猪皮胶
降解成肽和氨基酸以及这些肽被进一步降解成更小 原蛋白大大提高酶解速率：热处理后，酶解液中可溶性
分别取猪皮 50 g，加入 100 g 水匀浆 1 min，分别 于温度为 70、80、90、100 ℃水浴中保温 10 min，然后按 照 1.4 工艺水解 2 h。不同温度处理后猪皮胶原蛋白胰 酶水解产物中氨态氮、可溶性氮以及肽基氮含量见图1。
由图 1 可以看出，水解时间相同时，随着热处理 温度的增加，猪皮胶原蛋白胰酶酶解产物中可溶性氮、 氨基氮含量呈增高趋势，即热变性温度越高，猪皮胶原 蛋白消化率越高，70 ℃以后，这种趋势更加明显。胶原 蛋白的分子量约为 300 000~360 000，它是由 3 条肽链 盘绕而成的三股螺旋结构[10]，但热处理使三股螺旋解 旋而成游离多肽链，破坏分子间的共价交联，引起胶 原中键的随机水解，变成大分子明胶，肖和兰等[11]运用 傅 里 叶 红 外 光 谱 法 （FTIR） 和 二 维 相 关 分 析（2D correlation analysis）技术研究也发现，在 15 ℃~95 ℃升 温过程中，胶原的 3 条螺旋肽链之间的氢键减弱，逐渐
试验中所采用试剂均为国产分析纯。
1.3 分析方法 氨态氮含量：水解液中游离氨基酸含量占原料中
总蛋白质含量百分比，采用甲醛电位滴定法[9]分析；可 溶性氮含量：水解液中蛋白质含量占原料中总蛋白质
处理温度 /℃ 图 1 不同热处理温度对猪皮胶原蛋白 Trypsin-chymotrypsin 酶解
产物中氮存在形式影响 Fig.1 Effects of different temperatures on N-forms in Pigskin
占原料总氮含量/%
1.2 主要仪器设备及试剂
MM12 型绞肉机：广东省韶关市食品机械厂；
CU600 型电热恒温水箱：上海福玛实验设备有限公司；
KDN-2C 型定氮仪：上海纤检仪器有限公司；GL-21M
高速冷冻离心机：长沙湘仪离心机仪器有限公司；UV-
2000 型分光光度计：尤尼柯（上海）仪器有限公司。
解螺旋，每条肽链因伸直而使其螺旋度减少，整个蛋白 的变化能微扰并引起胶原蛋白结构的变化。以上研究 与本试验结论一致，原蛋白质分子致密的立体结构有 碍于蛋白酶与底物的结合，热处理使其成为松散的结 构，暴露原来包埋于内部的作用位点，从而加速了水解 速率。 2.2 胰酶水解猪皮胶原蛋白过程中氮存在形式变化 规律
collagen- Trypsin-chymotrypsin hydrolysates
含量百分比，采用微量凯氏定氮法分析；肽基氮含量： 水解液中肽含量占原料中总蛋白质含量百分比，即可 溶性氮含量与氨基氮含量之差；氨基酸组成分析：日 立 835-50 型氨基酸自动分析仪。 1.4 猪皮水解工艺
酶作用条件采用前期正交优化试验结果。取解冻 后猪皮 50 g，加 100 g 蒸馏水匀浆 1 min，调节初始 pH 至 8.5，升温至 37 ℃，加入 0.3 g 胰酶，于水浴上恒温搅 拌分别水解 2、4、6 、8、10 、12 h 。酶解完毕，将酶解液 于沸水浴中灭酶 20 min，离心（4 800 r/min，20 min）过 滤，所得滤液为酶解产物。其中未水解样为猪皮匀浆 后直接离心过滤的滤液部分，即猪皮水溶性提取物。 所有样品均稀释至 240 g 用于分析。
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Hale Waihona Puke 食品研究与开发基础研究
胰酶水解猪皮胶原蛋白及其产物氨基酸分析
胥彩云 1，童军茂 1，周晓宏 2,* （1．石河子大学 食品学院，新疆 石河子 832000；2.北京理工大学 生命科学与技术学院，北京 100081）
摘 要：采用胰酶水解猪皮胶原蛋白，研究其降解规律及酶解产物氨基酸组成。研究表明：95 ℃热处理猪皮胶原蛋白 10 min 能显著提高酶解速率；整个酶解过程中，可溶性氮、氨肽氮含量呈增加趋势，但 3 h 后增势变缓，而肽含量在 3 h 后达到最大值；大部分不溶性蛋白在酶解 6 h 后已经变成可溶性多肽和氨基酸；从酶解产物氨基酸组成可表明，采用 胰酶水解猪皮胶原蛋白能显著提高其营养价值。 关键词：猪皮胶原蛋白；热变性；酶解；氨基酸分析
占原料总氮含量/%
水解时间/h 图 2 胰酶水解猪皮胶原蛋白过程中氮形式变化 Fig.2 Changes of N-forms during hydrolysis of Pigskin collagen
by Trypsin-chymotrypsin
由图 2 可以看出，随着酶解时间的延长，水解产 物中可溶性氮、游离氨基酸含量不断地增加，且都在水 解 3 h 内增速最快，随后增势变缓；而肽含量也是在水 解 3 h 内增速最快，这表明这段时间胰酶主要以猪皮
Abstract：Pigskin collagen was hydrolyzed by Trypsin-chymotrypsin to explore the degrading pattern and the amino acid composition of the resultinghydrolysate. The results showed that heat Pigskin collagen 10 min at 95 ℃ was advantageous to enzymatichydrolysis of Pigskin collagen. Content of soluble nitrogen and amino nitrogen kept on increasing during hydrolysis, but increased slowly after 3 h hydrolysis. Peptide content reached a maximum after 3 h hydrolysis. A majority of unsoluble protein and peptides were degraded into soluble peptidesand amino acids after 6 h hydrolysis, acid composition in Pigskin collagen hydrolysate suggested that Pigskin collagen hydrolyzed by Trypsin-chymotrypsin improved the nutritional value of Pigskin collagen greatly. Key words：pigskin collagen；heat denaturation；enzymatic hydrolysis；aminoacidanalysis
分子量的肽和氨基酸两个过程，这两个过程在酶解过 氮含量由 63.5 %增加至 87.9 %；氨态氮含量由 10.8 %
程中某一时间段孰占优势对产物中肽的含量有直接 增加至 37.9 %。在整个酶解过程中，可溶性氮、游离氨
的影响，酶解后期，胰酶主要以产物中存在的肽为底 基酸含量呈增加趋势，前 3 h 内增势较快，但 3 h 后增
物，释放出更小分子量的肽和氨基酸，因此肽的含量表 势缓慢，而肽含量在水解 3 h 达到最大值 48.1 %。大部
现出下降趋势。
分不溶性蛋白在酶解 4 h 后已经变为可溶性多肽和氨
2.3 胰酶水解猪皮胶原蛋白产物氨基酸分析
基酸，蛋白质的溶解过程基本结束。酶解 12 h~48 h 各
一般蛋白质含有 20 种氨基酸，胶原含有 18 种氨 时间段酶解产物中 18 种氨基酸含量略有变化，但氨基
动物皮肤最重要的一个应用就是制革，但是由于 猪皮本身的质地不佳，目前在皮革工业中已经很少采 用猪皮，发展猪皮深加工是猪皮加工业的必然趋势。 猪皮中约含水分 70 ％～75 ％[1]，蛋白质 21 ％～23 ％，脂 肪 1 ％，灰分 0.5 ％。猪皮中的蛋白质以胶原蛋白为主， 含量为 87.7 %。胶原蛋白具有独特的三股超螺旋结 构，三条链相互平行而且由链间氢键相连[2]，具有十分 稳定的性质，一般的加工温度及短时间加热都难使其 分解，因此难被人体吸收，食用利用率较低[3]，将胶原蛋 白水解为多肽后，其营养及生理功能可显著提高：蛋白 质消化吸收率几乎达 100 ％，能保护胃黏膜以及抗溃 疡，促进皮肤胶原代谢，抑制血压上升，对关节炎等胶 原病具有很好的预防及治疗作用，能促进钙吸收和降 低血清中胆固醇含量等[4-6]。胶原蛋白的水解及胶原多
1 材料与方法 1.1 材料
猪皮购于北京市中关村家乐福超市（冻藏）刮脂、 洗净、缴碎，装袋，置于-18 ℃冰箱中冷冻，试验前从冰
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箱中取出在流动的自来水中缓化解冻，备用。
胰酶（Trypsin-chymotrypsin）由丹麦 NOVO 公司提供。
作者简介：胥彩云（1983—），女（汉），在读硕士研究生，研究方向：农 产品加工与贮藏。 * 通信作者
肽的利用一直是科学工作者研究的一个热门课题。因 此，利用酶技术处理猪皮制备胶原蛋白是提高其资源 利用率和附加值的有效途径。目前对猪皮酶水解的研 究集中在水解工艺条件的摸索方面，班玉凤等[7]确定 了 Alcalase 对猪皮胶原蛋白水解的最优条件，王川，李 燕等研究了用胰酶、木瓜蛋白酶和胃蛋白酶从猪皮中 提取胶原蛋白，其中以胰酶提取物得率最高，但结构破 坏较严重，用胃蛋白酶提取的胶原蛋白制品的结构最 完整，色泽最为洁白，但得率最低[8]。本文采用胰酶氮 存在形式、肽分子量分布变化规律以及水解产物的氨 基酸组成，为酶技术应用于生产具高附加值的猪皮深 加工制品(如复合氨基酸和活性肽等)提供参考。