免疫组化、HE染色步骤
石蜡切片、HE、免疫组化步骤
石蜡切片、HE、免疫组化实验一：取材及石蜡切片的制作（本次取材为小肠、膀胱、子宫、宫颈）①取材：小鼠脱颈处死后，应立即找到自己所需的组织器官，用一张滤纸将所需器官放在其上（可以加一些生理盐水在上面，防止干了），修去多余的脂肪、系膜等不要的组织，根据不同器官切成合适大小的形状（如小肠应切成1cm长度的长柱形）。
将切好的组织装于冻存管中，加入4%的PFA（PFA的作用是保护蛋白，防止蛋白降解）固定过夜（固定时间不能超过24h，如果24h后不能完成脱水工作，可以先50%、70%酒精脱水后，置于4℃冰箱保存。
）①脱水（目的是为了使组织从水相置换到有机相）（根据不同的组织，脱水时间不同）：将PFA中的组织取出，放入组织盒（组织盒子应尽量选择小格子，防止组织脱水过程中掉出来），一个组织盒可以放4~8个组织小块，切一张与格子大小合适的纸条一并装入，做好标签，防止后期辨认不出具体组织（只能用铅笔写，中性笔会被酒精脱去）。
使用自动脱水机进行脱水，设定程序为：酒精50%、70%、80%、90%（各20min）、无水乙醇（30min/次，两次）、酒精二甲苯混合物（1：1）20min、二甲苯20min（两次）、二甲苯石蜡混合物（1：1）30min、石蜡①1h；脱水结束后，取出组织盒，置于石蜡①中1h（石蜡应提前融化，且不能凝固，放在70℃烘箱中）。
①包埋：用4X6cm的小纸条根据小木块形状，叠成盒子（盒子最好四边叠平，不要左右不平，便于放融化的蜡进去后能得到比较好的形状，最好不要漏），取一个盒子，将融化的石蜡①倒入，在其快要凝固的时候，将组织按照所需的形状，摆正（如小肠切成的小柱子应立起来，便于后面切片的时候，可以切到所需的形状），再用做好标记的长纸条贴着盒子壁固定（为了包埋后识别组织，且不能将纸条放在蜡块中央，后期不好取出，会损坏刀片），倒蜡之前，可以将盒子放在铁皮或小铁块上（能够让石蜡更快凝固。
），每次用镊子拿组织或摆正组织之前，先烧一下（能够更好摆正组织块，可以随时调整组织位置）。
免疫组织化学及HE染色实验步骤
免疫组织化学及HE染色实验步骤免疫组织化学和HE（Hematoxylin and Eosin）染色是常用的组织学研究技术。
免疫组织化学用于检测组织中特定抗原的表达，可以帮助研究者了解细胞和组织的功能和性质。
HE染色则是常用的常规组织染色方法，用于观察组织的形态学特征。
下面将分别介绍免疫组织化学和HE染色的实验步骤。
1.获取组织标本：首先，需要获取要研究的组织标本，可以是活体组织或固定的组织。
固定的组织标本一般使用10%缓冲福尔马林进行固定。
2.制备标本切片：将标本切割成适合光镜观察的薄片。
切片厚度一般为3-5微米。
3.去蜡：将蜡包埋组织切片放入蜡溶液中，加热脱蜡，使组织切片恢复水化。
4.抗原修复处理：将切片放入抗原修复液中，通过高温或酶解方法进行抗原修复处理，使细胞或组织中的抗原保持完整。
修复液的选择和具体实验要求有关。
5.阻断非特异性结合：将切片浸入阻断液中，阻断非特异性结合位点，减少假阳性结果。
6.一抗孵育：将合适浓度的一抗溶液加到切片上，使其孵育一段时间。
根据要检测抗原的性质选择合适的一抗。
7.二抗孵育和信号增强：将与一抗结合的二抗溶液加到切片上，同时可以加入信号增强剂，提高检测灵敏度。
8.反应显色：将切片加入显色液中，使阳性细胞或组织部分显示出颜色反应。
常用的显色方法有原位杂交、过氧化物酶法和碱性磷酸酶法等。
9.脱水和封片：经过显色后，将切片在酒精中进行脱水处理，然后用透明介质嵌片，并保护封片，以便于观察。
HE染色的实验步骤如下：1.获取组织标本：同样，首先需要获取组织标本，可以是活体组织或固定的组织。
2.制备标本切片：将标本切割成适合光镜观察的薄片。
切片厚度一般为3-5微米。
3.去蜡和水化：将蜡包埋组织切片放入蜡溶液中，加热脱蜡，然后用醇和水进行水化，使组织切片恢复水化。
4.酸性染料处理：将标本切片放入染色液中，使用血红素作为酸性染料，将细胞核染成蓝色。
5.碱性染料处理：将标本切片放入染色液中，使用溴化钡和噻唑蓝作为碱性染料，将细胞质和胞浆染成红色。
免疫组化之组织处理、切片和染色实验技术步骤
免疫组化之组织处理、切片和染色实验技术步骤1.组织处理恰当的组织处理是做好免疫组化染色的先决条件，也是决定染色成败的内部因素，在组织细胞材料准备的过程中，不仅要求保持组织细胞形态完整，更要保持组织细胞的抗原性不受损或弥漫，防止组织自溶。
如果出现自溶坏死的组织，抗原已经丢失，即使用很灵敏的检测抗体和高超的技术，也很难检出所需的抗原，反而往往由于组织的坏死或制片时的刀痕挤压，在上述区域易出现假阳性结果。
1) 组织及时取材和固定组织标本及时的取材和固定是做好免疫组化染色的关键第一步，是有效防止组织自溶坏死，抗原丢失的开始，离体组织应尽快的进行取材，最好2h内，取材时所用的刀应锐利，要一刀下去切开组织，不可反复切拉组织，造成组织的挤压，组织块大小要适中，一般在2.5cm×2.5cm× 0.2cm，切记取材时组织块宁可面积大，千万不能厚的原则，(也就是说组织块的面积可以大到3cm×5cm，但组织块的厚度千万不能超过0.2cm，否则将不利于组织的均匀固定)。
固定液快速渗透到组织内部使组织蛋白能在一定时间内迅速凝固。
从而完好的保存抗原和组织细胞形态。
对于固定液的选择，原则上讲，应根据抗原的耐受性来选择相应的固定液，但除非是专项科研项目，在病理常规工作很难做到这一点，因为病理的诊断和鉴别诊断都是在常规HE病理诊断的基础上决定是否进行免疫组化的染色，而HE染色的常规组织处理是采用10%的中性缓冲福尔马林或4%缓冲多聚甲醛4倍于组织体积进行组织固定，利用其渗透性强，对组织的作用均匀进行固定，但组织固定时间最好在l2h 内，一般固定时间不应超过24小时。
随着固定时间的延长对组织抗原的检出强度将逐渐降低。
2) 组织脱水、透明、浸蜡组织经固定后进行脱水、透明、浸蜡和包埋。
掌握的原则是脱水透明要充分但不能过，浸蜡时间要够，温度不能高，否则造成组织的硬脆使组织切片困难，即使能切片，由于组织的硬脆，也使切片不能完好平整，染色过程中极易脱片，对免疫组化染色抗原的定位及背景都不利，所以无水酒精脱水和二甲苯透明的时间不宜过长，正常大小的组织无水酒精脱水lh×3次，二甲苯透明lh×2次即可，浸蜡及包埋石蜡温度不要超过65℃。
免疫组织化学及HE染色实验步骤复习过程
免疫组织化学及H E 染色实验步骤免疫组织化学（ immunohistochemistry）1组织脱水、包埋及切片（1）将剥离出瘤组织切成合适大小的组织块放于4%多聚甲醛中固定2天，固定时间最长不能超过1个月；（2）将组织块从固定液中取出，PBS漂洗1h，然后开始进行组织脱水，程序如下：70%乙醇浸泡30min—80%乙醇浸泡30min—90%乙醇浸泡30min—95%乙醇浸泡30min—95%乙醇浸泡30min—无水乙醇浸泡30min—无水乙醇浸泡30min—无水乙醇浸泡30min—二甲苯浸泡30min—二甲苯浸泡30min；（3）将组织块完全浸泡在蜡液中60℃过夜；（4）打开包埋仪器，设置相应参数，2h后将蜡液中的组织块取出放入包埋机的蜡缸中，将包埋所用铁槽清理干净放入蜡缸，用镊子将组织块放于铁槽正中央，取出铁槽接取少量蜡液使凹槽填满，将包埋盒倒置卡在铁槽上，放于低温工作台上冷却凝固，待其完全凝固后，取下包埋好的蜡块；（5）在切片前，先将蜡块表面修平，切成连续的厚度为5µm的切片，放入冷水中展片，用刀片将连续蜡带分开，然后放入40℃水浴锅中，用防脱载玻片捞出目的蜡带，放入烤片机上过夜，组织切片4℃保存。
2免疫组化染色（1）首先，用二甲苯脱蜡，然后用梯度酒精和水使切片充分复水，详细流程为：二甲苯浸泡10min—二甲苯浸泡10min—无水乙醇浸泡5min—无水乙醇浸泡5min—90%乙醇浸泡5min—80%乙醇浸泡5min—自来水冲洗5min；（2）抗原修复：微波炉中火预热配制好的枸橼酸缓冲液3min，将切片浸入修复液内，用微波炉中火加热3min，在此过程中注意不要让修复液溢出，以免切片变干，加热后室温冷却5min，加热冷却过程重复3次，修复完成后自然冷却至室温，用PBS清洗3次，每次5min；（3）滴加适量的3% H2O2覆盖组织，室温孵育10min，以阻断内源性过氧化物酶的活性，摇床上PBS清洗3次，每次5min；（4）用PBS配制5%的山羊血清，滴加适量至组织上封闭1h；（5）封闭结束后，甩干载玻片，用吸水纸吸去残留液体，将载玻片放人湿盒内，滴加由5%山羊血清稀释的一抗，一抗液体要完全覆盖组织，放入4℃冰箱内孵育过夜；（6）将组织切片从冰箱中取出，放于室温静置至室温，用PBS摇床清洗3次，每次10min，用5%山羊血清稀释生物素标记的二抗覆盖组织表面，室温孵育45min，PBS 摇床洗3次，每次10min；（7）组织表面滴加适量亲和素标记的辣根过氧化物酶，室温孵育30min，PBS洗3次，每次5min；（8）DAB显色：配制DAB显色液，滴加至组织表面，在显微镜下观察着色，待出现明显棕色且背景无明显着色时放于自来水中终止显色；（9）苏木素染核1-2min，用自来水冲洗终止染色；（10）将组织依次放入80%乙醇、90%乙醇、95%乙醇、无水乙醇、无水乙醇各5min，再放入二甲苯10min，二甲苯 10min，完成组织脱水和透明；（11）滴加一滴中性树胶封片，显微镜下观察并拍照，室温保存。
HE染色及组化步骤
组织固定及HE染色步骤
1、固定：刚取的新鲜组织块经福尔马林溶液固定48小时（一般固定2天）
2、用镶子取出放到大的蜡盒上，用刀片切成1*0.5厘米的小块，用小白蜡盒包上，放入80%
的乙醇中过夜
3、脱水：第二天早上8点，把蜡盒依次放入95% I的乙醇中（3h）— 95%II的乙醇中（3h）
—100% I的乙醇中（3h）— 100%II的乙醇中（过夜）
4、透明：第二天早8点从100%11的乙醇中取出小蜡盒放到二甲苯1、二甲苯II中各30 分钟
5、浸蜡：放入蜡缸中I、II、IIL中各浸泡30分钟
6、包埋
7、切片
8、烤片
HE染色
二甲苯 I （30min）—二甲苯II （30min）一100% I 的乙醇中（lOmin）一 100%II 的乙醇中（lOmin） 95%的乙醇中（5min）— 90%的乙醇中（5min）— 80%的乙醇中（5min）—自来水缸中浸泡5min —苏木精染核5min —水洗一1%的盐酸酒精分化一水洗一弱氨水返蓝一水洗一镜下观察一伊红染质（15min）—水稍洗一80%的乙醇、95%的乙醇I、95% 的乙醇II中各过一下即可一100% I的乙醇中（5min）— 100%II的乙醇中（lOmin）—二甲苯I （lOmin）一二甲苯II （lOmin）一中性树胶封片
免疫组化步骤
切片常规脱蜡至水洗预处理（热修复或酶消化）阻断3%的H202 PBS洗封闭加一抗（鼠或兔抗人） PBS洗加二抗（生物素标记IgG鼠或兔））PBS洗加三抗（链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶）PBS洗DAB（AEC或BCIP/NBT）显色水洗复染核水洗弱氨水返兰水洗脱水透明封片。
HE染色与免疫组化
HE染色与免疫组化实验步骤：1) 取材与固定用小号解剖针挑取一定量本室培养之成螨，雌雄各半，用PBS洗去培养物后用擦镜纸包裹，常温浸没于Bouin固定液中24小时。
2) 盐酸预处理固定后的粉尘螨以PBS清洗后挑入4％的盐酸溶液中浸泡半小时。
3) 琼脂预包埋A. 配置1.5％琼脂溶液，微波炉中加热至完全溶解，稍冷却后注入自制包埋器。
B. 将盐酸处理后的粉尘螨以PBS清洗后挑入琼脂溶液中，让其自然凝固。
C. 解剖镜下修整琼脂块，形成边长与虫体对称轴相一致的长方体，虫体位于琼脂块中央。
4) 脱水、透明与浸蜡A. 将预包埋的尘螨置于50％乙醇中2小时（中间换液一次），然后置于70％乙醇中室温过夜。
B. 第二天取出后依次入梯度乙醇脱水并以二甲苯透明：80％乙醇I（1小时）80％乙醇II（1小时）95％乙醇I（30分钟）95％乙醇II（30分钟）100%乙醇I（15分钟）100%乙醇II（15分钟）乙醇：二甲苯（1：1）混合液（10分钟）二甲苯I、II透明（共约15分钟）镜下观察至虫体透明即可终止c．将经透明的琼脂块取出，按如下流程浸蜡：二甲苯：塑化石蜡（1：1）混合液（10分钟）塑化石蜡I、II、III（各一小时）5) 塑化石蜡包埋折叠大小适中的纸盒进行包埋。
用镊子轻轻夹取琼脂块，置于纸盒底部并注满石蜡。
解剖镜下迅速摆正琼脂块的位置，以便准确选取不同的方向进行切片。
待蜡块表面稍凝固后，连同纸盒一起沉入水中，使其迅速冷却。
6) 切片与展片先对蜡块进行修整，使其边与琼脂块的边相平行。
使用手摇轮转式切片机，调整切片厚度为4-6μm，连续切片。
将恒温水浴箱加热至45℃左右，同时将已包被Poly-L-lysine的载玻片预热。
在载玻片上滴加少许温水，截取适当长度的蜡带，在载玻片上进行展片。
晾干后置于60℃烤箱中2小时，使蜡带贴附牢固。
7) HE染色按常规方法进行染色。
由于尘螨体积微小，在染色过程中容易掉片，而且各组织嗜染性不同，故在试验中对各步骤进行了一些调整，获得较满意的效果。
HE染色与免疫组织化学染色实验报告
华中农业大学动物科技动物医学院HE染色与免疫组织化学染色实验报告1实验目的及意义1.1了解石蜡切片的制作过程1.2 掌握HE染色与免疫组织化学染色的基本原理以及染色方法1.3 熟悉HE染色与免疫组织化学染色后的读片知识2 实验方法及步骤2.1 石蜡切片制作及HE染色步骤2.1.1取材与固定：从人或动物新鲜尸体上取下组织块(一般厚度不超过0．5厘米)投入预先配好的固定液中(10％福尔马林)使组织、细胞的蛋白质变性凝固，以防止细胞死后的自溶或细菌的分解，从而保持细胞本来的形态结构。
2.1.2脱水透明：一般用由低浓度到高浓度酒精作脱水剂，逐渐脱去组织块中的水份。
再将组织块置于既溶于酒精，又溶于石蜡的透明剂二甲苯中透明，以二甲苯替换出组织块的中酒精，才能浸蜡包埋。
2.1.3浸蜡包埋：将已透明的组织块置于已溶化的石蜡中，放入溶蜡箱保温。
待石蜡完全浸入组织块后进行包埋：先制备好容器(如折叠一小纸盒)，倒入已溶化的石蜡，迅速夹取已浸透石蜡的组织块放入其中。
冷却凝固成块即成。
包埋好的组织块变硬，才能在切片机上切成很薄的切片。
2.1.4切片前的准备工作：先将包埋的每块组织周围过多的石蜡切去，四周留约2mm的石蜡块，块两边必须切成平行的直线。
将玻片擦洗干净后均匀涂抹薄薄的一层蛋白甘油，放置冰箱备用。
2.1.5切片与贴片：将预冷的蜡块固定于切片机上，调节切片厚度为6微米，切成薄片。
切下的薄片往往皱折，放到加热的水中烫平，再贴到载玻片上，放45℃恒温箱中烘干。
2.1.6 脱蜡至水华中农业大学动物科技动物医学院二甲苯Ⅰ20分钟，二甲苯Ⅱ20分钟，无水乙醇3分钟，95％酒精3分钟，80％酒精3分钟，70％酒精3分钟，自来水洗5分钟，依次按上述顺序加入相应试剂并作用相应时间。
2.1.7染色：苏木素液7分钟，自来水洗5分钟，1％盐酸溶液分化30秒，自来水洗5分钟，1％氨水返蓝10秒，自来水洗20分钟，95％酒精3分钟，1％伊红酒精溶液2分钟，依次按上述顺序加入相应试剂并作用相应时间。
HE染色、免疫组化
HE染色步骤：1.脱蜡至水（二甲苯1、二甲苯2、二甲苯3各15分钟；100%酒精1、100%酒精2、95%酒精1、95%酒精2各5分钟；90%酒精3分钟；80%酒精2~3分钟），自来水冲洗（洗酒精的）2.苏木素染色5分钟，自来水冲洗，1%的盐酸乙醇分化（处理结合过多的苏木素），自来水冲洗，返蓝液返蓝（使胞核更加蓝化），自来水冲洗，伊红染色1.5~2分钟，自来水快速冲洗3.脱水（80%、90%、两个95%涮洗即过，两个100%各3~5分钟）4.二甲苯透明：二甲苯1、二甲苯2、二甲苯3各2分钟5.封片：盖玻片免疫组化染色：1.脱蜡至水（二甲苯1、二甲苯2、二甲苯3各15分钟；100%酒精1、100%酒精2、95%酒精1、95%酒精2各5分钟；90%酒精3分钟；80%酒精2~3分钟），自来水冲洗（洗酒精的）2.抗原修复：根据抗体说明书，选择抗原修复液（分两种：一、柠檬酸修复液配方——A柠檬酸钠29.41g溶入1000ml蒸馏水、B柠檬酸21g溶入1000ml蒸馏水，取A液41ml+B液9ml+450ml蒸馏水，测PH6.0，把配好的修复液放入高压锅里，开始加热待修复液沸腾后，将脱蜡好的片子放入耐高温的修复夹中，一起放入高压锅里，盖好锅盖等待锅嗤嗤响时，开始计时1分40秒），时间到后关火，把锅放入水池中降温，开小水冲洗缓慢降温，等锅凉后把锅打开，取出修复夹，自来水冲洗。
画圈（画圈笔或石蜡，目的节省抗体）3.3%过氧化氢封闭（针对石蜡切片中的红细胞），0.3%过氧化氢封闭（针对冰冻切片和爬片的红细胞），20分钟4.PBS洗5*3分钟，PBST涮洗，0.15%的triton破膜（30分钟），PBS洗5*3分钟，PBST涮洗，加二抗来源的血清（45分钟~1小时）5.甩掉血清加一抗，4度（18~24小时）或室温3~4小时，室温复浴45分钟~1小时6.PBS洗5*5分钟，PBST涮洗，加二抗（30分钟），PBS洗5*5分钟，PBST涮洗，加三抗（20分钟），PBS 洗5*3分钟，PBST涮洗，DAB显色（5~10分钟），自来水终止，苏木素衬染，自来水冲洗，1%盐酸乙醇分化，自来水冲洗，返蓝液返蓝，自来水冲洗，脱水、透明、封片。
免疫组织化学及HE染色实验步骤
免疫组织化学及HE染色实验步骤免疫组织化学（immunohistochemistry，简称IHC）是一种用于检测组织切片中特定蛋白质的方法，其原理是通过特异性抗体识别目标蛋白质并将其可视化。
本文将介绍IHC实验的基本步骤和HE染色实验的步骤。
IHC实验步骤：1.组织切片制备：从取材到固定、包埋和切片，保证组织样本的质量和完整性。
2.抗原修复：将组织切片放入含有钠胼胝土缓冲液或其它抗原修复液中进行抗原修复。
可以选择使用高温或酶解等方法。
3.阻断非特异性结合：将组织切片浸泡在阻断液中，如BSA、牛血清蛋白等，以防止抗体与非特异性的蛋白质结合。
4.一抗孵育：将含有一抗的抗体溶液滴在组织切片上，孵育一段时间，使一抗与目标蛋白质发生特异性结合。
5.二抗孵育：选择与一抗宿主不同的二抗标记物，如荧光素、过氧化物酶等，将含有二抗的溶液滴在组织切片上进行孵育。
6.吸附剂清洗：将组织切片用洗涤缓冲液洗去未与标记物结合的二抗。
7.标记物检测：根据所选择的标记物，可以进行荧光显微镜观察、酶反应等，将目标蛋白质可视化。
8.盖片封装：将组织切片用适当的缓冲液封装至玻璃盖片上。
HE染色实验步骤：1.组织切片制备：从取材到固定、包埋和切片，保证组织样本的质量和完整性。
2.脱蜡：将组织切片放入甲醇中脱去石蜡包埋。
3. 染剂处理：将组织切片依次浸泡在嗜铬酸钾溶液中，漂洗后浸泡在碱性染剂中，如伊红（Eosin）染料。
4. 酸性染剂处理：将组织切片浸泡在酸性染剂中，如苏木红（Hematoxylin）染料。
5.脱染：将组织切片用酒精和醋酸溶液进行脱染。
6.脱水：将组织切片依次浸泡在酒精梯度中，脱去水分。
7.透明化：将组织切片逐渐浸泡在透明剂中，如苯酚乙醇、二甲苯等，使组织切片透明。
8.盖片封装：将组织切片用适当的透明剂封装至玻璃盖片上。
以上是免疫组织化学和HE染色实验的基本步骤。
通过这些步骤，可以标记和可视化组织切片中的特定蛋白质，进而获得研究和诊断所需的信息。
免疫组化HE染色步骤
免疫组化HE染色步骤免疫组化和HE染色是在病理学中常用的技术，用于对组织样本进行分析和诊断。
下面将详细介绍免疫组化和HE染色的步骤。
免疫组化（Immunohistochemistry，IHC）是一种通过使用抗体来检测组织样本中特定抗原的技术。
它可以用于确定细胞或组织中特定蛋白质的位置和表达水平。
免疫组化主要包含以下步骤：1.取得组织样本：首先需要从患者的切除组织或活检组织中获取样本。
样本通常以固定和包埋的形式保存在蜡块中。
2. 切片：将蜡块切割成非常薄的切片（通常为4-5um）。
这些切片通常被放置在载玻片上。
3.去蜡和脱水：跳过这一步，因为该步主要是用于从蜡中去除组织样本。
已经固定在切片上的组织样本无需这一步。
4.抗原检出：在这一步中，需要使用一种抗体来标记想要检测的抗原。
这个抗体会与目标蛋白质结合，并形成一种可以用来检测的复合物。
5.清洗：使用缓冲液对切片上的抗体复合物进行清洗，以去除未结合的抗体。
6.显色：在这一步中，需要使用一种可独特识别的物质来标记已结合的抗体。
典型的显色素有DAB、VIP等。
7.顶气及封片：使用适当的溶剂和覆盖剂对切片进行顶气和封片，以保护其结构并使其可供观察。
通过观察组织样本中的抗原的显色情况，可以确定抗原在组织中的分布和表达水平。
免疫组化广泛应用于病理学诊断中，可以帮助医生进行肿瘤分类、病理分级以及预后评估等。
HE染色（Hematoxylin and Eosin staining）是一种常用的组织染色技术，主要用于病理学的初步观察和诊断。
HE染色主要包含以下步骤：1.取得组织样本：与免疫组化相同，首先需要从患者的切除组织或活检组织中获取样本。
样本通常以固定和包埋的形式保存在蜡块中。
2. 切片：将蜡块切割成非常薄的切片（通常为4-5um）。
这些切片通常被放置在载玻片上。
3.去蜡和脱水：类似于免疫组化，这一步主要用于从蜡中去除组织样本。
4.染色：在这一步中，使用两种染色剂：血红素和紫杉醇。
he染色步骤英文写法
"He"染色通常指的是免疫组化染色（Immunohistochemistry，IHC）中的一种特定技术，用于检测组织样本中的特定蛋白质。
以下是免疫组化染色的基本步骤，用英文表述：1. Sample Preparation:- Collect the tissue sample and fix it in a suitable fixative, such as formalin, for a defined period of time.- Embed the fixed tissue in a suitable matrix, such as paraffin, and section it into thin slices for staining.2. Deparaffinization and Antigen Retrieval:- Deparaffinize the tissue sections by immersing them in xylene to remove the paraffin.-Perform antigen retrieval by boiling the sections in a water bath with a suitable buffer, such as citrate buffer, to expose the antigens.3. Blocking:- Incubate the sections with a blocking solution, such as normal goat serum or bovine serum albumin, to prevent non-specific binding of the antibodies.4. Primary Antibody Incubation:- Add the primary antibody specific for the protein of interest to the sections and incubate them overnight or for a specified time at a suitable temperature, such as 4°C.5. Secondary Antibody Incubation:-After washing the sections to remove unbound primary antibody, add a secondary antibody conjugated to an enzyme, such as horseradish peroxidase (HRP) or alkaline phosphatase (AP), and incubate for a defined period.6. Developing the Stain:- Add the substrate for the enzyme-conjugated secondary antibody, such as diaminobenzidine (DAB) for HRP or Fast Blue for AP, and allow the stain to develop until the desired color intensity is achieved.7. Counterstaining (Optional):- If necessary, counterstain the sections with a suitable nuclear stain, such as hematoxylin, to enhance the contrast and visualize the nuclei.8. Mounting:- Wash the sections thoroughly, dry them, and mount them on glass slides using a suitable mounting medium.9. Observation and Analysis:- Examine the stained sections under a microscope and analyze the staining pattern and intensity to determine the presence and distribution of the target protein.Please note that the specific steps and reagents used may vary depending on the protocol, the type of tissue, and the antigen being targeted. It is important to follow the manufacturer's instructions and optimize the conditions for each specific application.。
组织切片HE染色与免疫组化
1 组织切片1、剪取组织,10 %甲醛固定。
2、已经固定好的组织依次在70 %、80 %、90 %、95 %、95 %、100 %的乙醇溶液中浸泡15-20 min，3、再浸入乙醇和二甲苯（1:1）的混合溶液中15-20 min，然后浸入二甲苯直到透明，将透明的组织浸入石蜡和二甲苯（1:1）的混合溶液中浸泡1 h，用石蜡进行固定。
4、包埋、切片2组织切片HE染色染色结果：细胞核呈蓝色，细胞的细胞质呈粉红色。
步骤：1、组织切片用二甲苯脱蜡15 min，再次用二甲苯进行脱蜡15 min，2、浸入二甲苯和酒精混合溶液（1:1）3 min，依次浸入100%、95 %、90%、80%、70%、50%乙醇各2 min。
3、苏木素染色5 min, 自来水冲洗3 min, 1 %盐酸2 s，自来水冲洗2 min, 依次浸入50 %、70 %、80 %乙醇2 min,伊红浸泡5 s。
4、 95 %、100 %、100 %乙醇各2 min，最后连续2次二甲苯各15 min，封片。
3 组织切片免疫组化检测1、组织切片置于58 ℃烘箱内烤片20 min, 然后取出待冷却后，进行脱蜡。
2、连续2次二甲苯脱蜡各15 min，依次浸入100 %、95 %、80 %乙醇、蒸馏水各2 min。
3、高压抗原修：将3 L柠檬酸盐缓冲液注入不锈钢压力锅中加热至沸腾。
切片置于切片架上，放入锅内，使切片位于液面以下，盖高压锅压阀。
当压力锅开始慢慢喷气时（加热5-6 min）计时1-2 min，然后将压力锅端离热源，冷水冲至室温后，蒸馏水冲洗，PBS洗，片子室温冷却20 min，再次PBS洗。
4、免疫组化具体方法参照SP试剂盒（福州迈新）：1、室温，正常非免疫动物血清封闭30 min；2、一抗4 ℃ 12 h；3、用PBS清洗两次，每次2 min；4、室温，内源性过氧化物酶阻断1 h；用PBS清洗三次，每次2 min；5、室温，生物素标记的二抗30 min；用PBS清洗三次，每次2 min；6、室温，链霉菌抗生物素蛋白-过氧化酶30 min，7、DAB显色5 min，蒸馏水冲洗；8、Gill’s苏木素复染3 min；9、自来水流水冲洗5 min；依次95 %、100 %的乙醇脱水3 min；10、最后用二甲苯透明，封片，镜检，拍照。
石蜡切片、HE、免疫组化步骤
石蜡切片、HE、免疫组化实验一：取材及石蜡切片的制作（本次取材为小肠、膀胱、子宫、宫颈）①取材：小鼠脱颈处死后，应立即找到自己所需的组织器官，用一张滤纸将所需器官放在其上（可以加一些生理盐水在上面，防止干了），修去多余的脂肪、系膜等不要的组织，根据不同器官切成合适大小的形状（如小肠应切成1cm长度的长柱形）。
将切好的组织装于冻存管中，加入4%的PFA（PFA的作用是保护蛋白，防止蛋白降解）固定过夜（固定时间不能超过24h，如果24h后不能完成脱水工作，可以先50%、70%酒精脱水后，置于4℃冰箱保存。
）②脱水（目的是为了使组织从水相置换到有机相）（根据不同的组织，脱水时间不同）：将PFA中的组织取出，放入组织盒（组织盒子应尽量选择小格子，防止组织脱水过程中掉出来），一个组织盒可以放4~8个组织小块，切一张与格子大小合适的纸条一并装入，做好标签，防止后期辨认不出具体组织（只能用铅笔写，中性笔会被酒精脱去）。
使用自动脱水机进行脱水，设定程序为：酒精50%、70%、80%、90%（各20min）、无水乙醇（30min/次，两次）、酒精二甲苯混合物（1：1）20min、二甲苯20min（两次）、二甲苯石蜡混合物（1：1）30min、石蜡Ⅰ1h；脱水结束后，取出组织盒，置于石蜡Ⅱ中1h（石蜡应提前融化，且不能凝固，放在70℃烘箱中）。
③包埋：用4X6cm的小纸条根据小木块形状，叠成盒子（盒子最好四边叠平，不要左右不平，便于放融化的蜡进去后能得到比较好的形状，最好不要漏），取一个盒子，将融化的石蜡Ⅱ倒入，在其快要凝固的时候，将组织按照所需的形状，摆正（如小肠切成的小柱子应立起来，便于后面切片的时候，可以切到所需的形状），再用做好标记的长纸条贴着盒子壁固定（为了包埋后识别组织，且不能将纸条放在蜡块中央，后期不好取出，会损坏刀片），倒蜡之前，可以将盒子放在铁皮或小铁块上（能够让石蜡更快凝固。
），每次用镊子拿组织或摆正组织之前，先烧一下（能够更好摆正组织块，可以随时调整组织位置）。
HE染色方法与步骤吐血整理
HE染色试剂配置A：0.5~1%的伊红酒精溶液：称取伊红Y0.5~1g，加少量蒸馏水溶解后，再滴加冰醋酸直至浆糊状。
以滤纸过滤，将滤渣在烘箱中烤干后，以95%酒精（即工业酒精，如果不怕浪费，用无水乙醇配制也可）100毫升溶解。
B：苏木素染液配方：(配制3000ml，可按比列减少)苏木精6g无水乙醇100ml硫酸铝钾150g蒸馏水2000ml碘酸钠1.2g冰醋酸120ml甘油900ml配制方法：将苏木素溶于无水乙醇，再将硫酸铝钾溶于蒸馏水，溶解后将甘油倾入一起混合，最后加入冰醋酸和碘酸钠。
C：1%盐酸酒精分化液：将1毫升浓盐酸加入99毫升70%酒精中即可。
染色流程(1)二甲苯（Ⅰ）15min(2)二甲苯（Ⅱ）15min（3）二甲苯：无水乙醇=1:12min(4)100%乙醇（Ⅰ）5min(5)100%乙醇（Ⅱ）5min(6)80%乙醇5min(7)蒸馏水5min(8)苏木精液染色5min(9)流水稍洗去苏木精液1-3s(10)1%盐酸乙醇1-3s(11)稍水洗10-30s(12)蒸馏水过洗1-2s(13)0.5%伊红液染色1-3min(14)蒸馏水稍洗1-2s(15)80%乙醇稍洗1-2s(16)95%乙醇（Ⅰ）2-3s(17)95%乙醇（Ⅱ）3-5s(18)无水乙醇5-10min(19)石炭酸二甲苯5-10min(20)二甲苯（Ⅰ）2min(21)二甲苯（Ⅱ）2min(22)二甲苯（Ⅲ）2min(23)中性树胶封固注：①第（11）、（12）步可省去，（13）步冲水时间需延长至20-30min。
②第（21）步如果不用石炭酸二甲苯，可改用无水乙醇。
*冷冻切片HE染色步骤：（1）冰冻切片固定10～30s（2）稍水洗1～2s（3）苏木精液染色（60℃）30～60s（4）流水洗去苏木精液5～10s（5）1%盐酸乙醇1～3s（6）稍水洗1～2s（7）促蓝液返蓝5～10s（8）流水冲洗15～30s（9）0.5%曙红液染色30～60s（10）蒸馏水稍洗1～2s（11）80%乙醇1～2s（12）95%乙醇1～2s（13）无水乙醇1～2s（14）石炭酸二甲苯2～3s（15）二甲苯（Ⅰ）2～3s（16）二甲苯（Ⅱ）2～3s（17）中性树胶封固。
免疫组织化学及HE染色实验步骤
免疫组织化学及HE染色实验步骤1.取得组织标本：首先需要从患者或动物身上获得组织标本。
在手术过程中或尸检后，将组织标本取出并固定。
2.标本处理：将取出的组织标本进行固定处理，常用的固定剂有10%的中性缓冲甲醛。
需要将标本完全浸泡在固定液中，并确保标本完整。
3.嵌入和切片：将固定处理后的组织标本进行脱水和透明处理，然后用蜡块将其嵌入。
嵌入后的标本可以使用旋转式微切机进行切片，切片厚度通常为4-6微米。
4.脱蜡：将蜡包围的组织切片放入脱蜡剂中，蜡会被溶解并去除，以使细胞可被染色剂染色。
5.抗原检出：用特异性抗体结合试剂来检测组织中的特定抗原。
将切片在温床上恢复，然后用蛋白酶消化膜蛋白，以增强抗原的敏感性。
之后，使用特定的一抗（主抗体）与待检测的抗原结合，形成特异性抗原-抗体复合物。
6.二抗检出：使用特异性标记的二抗来检测抗原-抗体复合物。
通常，二抗为小鼠单克隆抗体，与抗体结合后，可通过酶标记法、光学染色或荧光染色等方法来检测二抗信号。
7.显色和镜检：通过给予染色剂，如DAB和H2O2溶液，产生可见的显色反应。
显色后的标本可以用显微镜进行观察和评估。
HE染色实验步骤：1.取得组织标本：与免疫组织化学实验类似，首先需要从患者或动物身上获得组织标本。
2.标本处理：将取出的组织标本进行固定处理，使用10%的中性缓冲甲醛溶液进行固定。
需要将标本完全浸泡在固定液中，并确保标本完整。
3.组织处理：将固定处理后的组织标本进行脱水，以至能够与石蜡亲和。
4.嵌入和切片：将脱水的组织标本注入熔化的石蜡中，以便于嵌入。
然后，使用旋转式微切机将嵌入后的标本切为薄片，厚度通常为4-6微米。
5. 脱蜡和染色：将蜡包围的组织切片放入脱蜡剂中，蜡会被溶解并去除，以使细胞可被染色剂染色。
接下来，将切片放入hematoxylin染色剂中，染出细胞核的蓝色。
6. 酸性染色：将切片转移到eosin染色剂中，以染出细胞质和胞外基质的红色。
7.脱水和渗透：将染色后的切片依次浸泡在动物级乙醇溶液中，然后放入橄榄油中进行清晰度处理。
HE染色和免疫组化步骤
二十四、HE染色：1›伊红染液配方：称取伊红2 g，溶于5 ml 蒸馏水，逐滴加入冰醋酸，边加边搅拌至糊状，再加入数毫升蒸馏水，继续滴加冰醋酸至沉淀不再增加，过滤，将沉淀和滤纸一起置于50-60℃温箱中烘干，溶于400 ml 95%的酒精中。
2›苏木精染液配方：A液：苏木精2 g ；无水乙醇250 ml 。
B液：钾矾（硫酸铝钾）17.6 g；水750mL 。
具体步骤：分别按以上配方配好A液和B液，并混合后加入碘酸钠0.2g，冰醋酸20mL染液配好后，将瓶口用裹着棉花的纱布塞紧，放在暗处通风的地方，并经常摇动以促进它的成熟。
成熟时间约1个月。
此染液需要提前1个月配置好，备用，如果想要促进它的成熟，可在染液里加入0.2 g碘酸钠。
此染液染核效果良好，染色均匀，不会发生沉淀，而且可以长期稳定保存。
此染液可同时与伊红等进行细胞的染色。
整个染色过程包括五个内容：脱蜡复水、染色、脱水、透明和封片。
1›脱蜡复水：a. 65℃温箱烤片30min后, 石蜡切片经二甲苯Ⅰ、Ⅱ脱蜡各5~10min,b. 石蜡切片依次各级浓度酒精复水：经100%酒精→100%酒精→95%酒精→80%酒精→70%酒精→50%酒精→蒸馏水，各1-2 min。
2›染色：a. 苏木精染色约4min。
染色时间主要根据染色剂的成熟度以及室温高低，可以适当缩短或延长（现在的成熟度4min左右）。
b. 水洗5-10minc. 脱水Ⅰ切片经50%乙醇→70%乙醇→80%乙醇→95%乙醇，各1-2 min。
d. 复染伊红染色10s-20s ，着色以较浅为宜。
3›脱水Ⅱ：用95%乙醇洗去切片多余的红色，然后放入100%无水乙醇两次各1.5 min，共3min。
4›透明：切片依次经乙醇-二甲苯等量混合液1.5min、纯二甲苯Ⅰ5min、Ⅱ5min。
二甲苯要定期更换，切片如在二甲苯中出现白雾现象，说明脱水未尽，应退回乙醇中重新脱水，否则切片难以镜检。
5›封片滴加中性树胶，注意组织不能有气泡。
免疫组化HE染色FISHISH演示文稿
抗体的穿透性，染色均匀一致。
4、组织的固定：4%多聚甲醛固定一般1-2小时。固定后经充分的流水冲 洗后进行脱水包埋。
5、组织脱水：主要用不同梯度的酒精进行脱水。一般情况下，组织经过 70％，80％，90％，95％，以至无水酒精的脱水程序，即可达到脱 水的要求。但是为了能使大量的组织块同时进行脱水，则要求保持液 体的浓度以保证脱水的作用，最好是以两次95％酒精，两次100％酒 精重复进行脱水，以保证组织的水分脱净。
3、弹性纤维的染色方法 ：维格特氏雷锁辛品红法 、Gomori‘s醛品红法 、 地衣红技术、费尔霍夫氏酒精苏木素技术。
二、Masson染色
Masson染色,用于显示组织中纤维的染色方法之一。一般的Masson 染色用的是三色法，苯胺蓝染液使胶原纤维、粘液、软骨呈蓝色(如 光绿液染色为绿色)，Masson 丽春红酸性复红液使胞浆、肌肉、纤维 素、神经胶质呈红色，Regaud 氏苏木精染液使细胞胞核黑蓝色。
2、弹性纤维染色的临床应用 1）用于区别正常的动脉和静脉以及观察动脉有病变时血管壁各层的情况，
如动脉粥样硬化时的各类变化。 2）用于区别观察各种疾病对弹性纤维的影响及变化，如原发性或继发性
高血压可见主动脉弹力纤维增生，老年弹力纤维增多症。心内膜弹力 纤维增生症常都可见到弹力纤维断裂，梅毒性主动脉炎和皮肤的环状 肉芽肿，动脉粥样硬化均可见到裂解，崩解的弹力纤维。 3）用于弹力纤维性假黄瘤的诊断。该病镜下见真皮中下部结缔组织变性， 呈团块状或条索状，弱嗜碱性用弹力纤维染色法可以鉴别。
3、免疫组化过程中抗原修复有高压修复法、酶修复、微波修复，其中 微波修复抗原对提高免疫组化阳性检出率非常有效。
免疫组织化学及HE染色实验步骤
免疫组织化学（immunohistochemistry）1组织脱水、包埋及切片（1）将剥离出瘤组织切成合适大小的组织块放于4%多聚甲醛中固定2天，固定时间最长不能超过1个月；（2）将组织块从固定液中取出，PBS漂洗1h，然后开始进行组织脱水，程序如下：70%乙醇浸泡30min—80%乙醇浸泡30min—90%乙醇浸泡30min—95%乙醇I浸泡30min—95%乙醇II浸泡30min—无水乙醇I浸泡30min—无水乙醇II浸泡30min—无水乙醇III浸泡30min—二甲苯I浸泡30min—二甲苯II浸泡30min；（3）将组织块完全浸泡在蜡液中60℃过夜；（4）打开包埋仪器，设置相应参数，2h后将蜡液中的组织块取出放入包埋机的蜡缸中，将包埋所用铁槽清理干净放入蜡缸，用镊子将组织块放于铁槽正中央，取出铁槽接取少量蜡液使凹槽填满，将包埋盒倒置卡在铁槽上，放于低温工作台上冷却凝固，待其完全凝固后，取下包埋好的蜡块；（5）在切片前，先将蜡块表面修平，切成连续的厚度为5µm的切片，放入冷水中展片，用刀片将连续蜡带分开，然后放入40℃水浴锅中，用防脱载玻片捞出目的蜡带，放入烤片机上过夜，组织切片4℃保存。
2免疫组化染色（1）首先，用二甲苯脱蜡，然后用梯度酒精和水使切片充分复水，详细流程为：二甲苯I浸泡10min—二甲苯II浸泡10min—无水乙醇I浸泡5min—无水乙醇II浸泡5min—90%乙醇浸泡5min—80%乙醇浸泡5min—自来水冲洗5min；（2）抗原修复：微波炉中火预热配制好的枸橼酸缓冲液3min，将切片浸入修复液内，用微波炉中火加热3min，在此过程中注意不要让修复液溢出，以免切片变干，加热后室温冷却5min，加热冷却过程重复3次，修复完成后自然冷却至室温，用PBS清洗3次，每次5min；（3）滴加适量的3% H2O2覆盖组织，室温孵育10min，以阻断内源性过氧化物酶的活性，摇床上PBS清洗3次，每次5min；（4）用PBS配制5%的山羊血清，滴加适量至组织上封闭1h；（5）封闭结束后，甩干载玻片，用吸水纸吸去残留液体，将载玻片放人湿盒内，滴加由5%山羊血清稀释的一抗，一抗液体要完全覆盖组织，放入4℃冰箱内孵育过夜；（6）将组织切片从冰箱中取出，放于室温静置至室温，用PBS摇床清洗3次，每次10min，用5%山羊血清稀释生物素标记的二抗覆盖组织表面，室温孵育45min，PBS摇床洗3次，每次10min；（7）组织表面滴加适量亲和素标记的辣根过氧化物酶，室温孵育30min，PBS洗3次，每次5min；（8）DAB显色：配制DAB显色液，滴加至组织表面，在显微镜下观察着色，待出现明显棕色且背景无明显着色时放于自来水中终止显色；（9）苏木素染核1-2min，用自来水冲洗终止染色；（10）将组织依次放入80%乙醇、90%乙醇、95%乙醇、无水乙醇I、无水乙醇II各5min，再放入二甲苯I 10min，二甲苯II 10min，完成组织脱水和透明；（11）滴加一滴中性树胶封片，显微镜下观察并拍照，室温保存。
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骨组织石蜡切片制作
步骤：
1.固定：切取骨缺损出的骨组织，用PBS冲洗，放入4%多聚甲醛缓
冲液内固定12—24h。
2.脱钙：将固定好的骨组织放入脱钙液中侵泡脱钙24h.
3.脱水：将固定好的骨组织用蒸馏水冲洗3次，再用50%的酒精冲洗2 次，常规脱水，70%酒精（60min），80%酒精（40min）,95%酒精（30min）,100%酒精1（25min）,100%酒精II（25min）。
4.透明：二甲苯I(35min)，二甲苯II（35min）。
5.包埋：将透明处理后的骨组织依次侵入石蜡I 1小时，石蜡II 1小时。
6.切片：包埋后的组织块经修理后，用切片机切成4um的石蜡带，将组织石蜡块在50℃温水中展片，然后用干净的载玻片捞片。
7.烤片：将切好的组织片放入63℃恒温箱中烤片2小时。
免疫组化检测
步骤：
1.脱蜡：将组织切片放入62℃恒温箱中烘烤20min 二甲苯
1（10min）二甲苯2（10min）。
2.水化：100%酒精1（2min） 100%酒精（2min）95%酒精（2min）80%酒精（2min）70%酒精(2min) 。
3.PBS冲洗3次，每次5min.。
4.抗原修复：将组织片置0.01M的柠檬酸缓冲液（PH6.0）中煮沸
15min ,自然冷却至室温。
5.PBS冲洗3次，每次5min。
6.阻断：3%去离子水37℃孵育10min,以灭活内源性过氧化物酶活
性。
7.PBS冲洗3次，每次5min。
8.滴加1抗（GFP 1：100稀释, 4℃过夜）
9.PBS冲洗3次，每次5min。
10.滴加二步法免疫组化检测试剂的试剂1，37℃孵育,20min, PBS
冲洗3次，每次5min。
11. 滴加二步法免疫组化检测试剂的试剂2，37℃孵育,20min, PBS
冲洗3次，每次5min。
12.DAB显色5min。
13.自来水冲洗10min。
14.苏木精复染2min,盐酸酒精分化。
15.自来水冲洗10min。
16.常规脱水，透明，封片，镜检。
组织切片HE染色
步骤
1、将烘烤后的组织切片依次侵入二甲苯1，二甲苯II进行脱蜡各10min。
2、脱蜡后的组织切片依次浸入无水乙醇I、无水乙醇II、95%酒精、80%酒精、70%酒精中各2 min，PBS冲洗2次，每次5min。
3、苏木素染色3 min, 自来水冲洗3 min, 1 %盐酸酒精分色2 s，自来水冲洗2 min, 依次浸入50 %、70 %、80 %的酒精中各2 min,伊红浸泡5 s，自来水冲洗3min。
4、再将组织切片依次侵入95 %酒精、无水乙醇I、无水乙醇II中各3min，最后再依次侵入二甲苯I,二甲苯II各5min。
5.中性树胶封片，镜检。