激光共聚焦显微镜原理50页PPT
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共聚焦激光扫描PPT课件
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4
共聚焦显微镜的优点
减少由于光散射产生的图像模糊 增加有效分辨率 提高信噪比 厚标本的清楚细查 Z轴扫描 可以实现数字放大倍率的调节
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5
Wide-field microscopy
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6
Fluorescent Microscope
Objective
Arc Lamp
Excitation Diaphragm Excitation Filter
12
基于共聚焦原理的皮肤在体三维成像技术
探测器 激光束
小孔
聚焦透镜 分光器
光学扫描 物镜
组织样品
Quarter Wave Plate 窗口
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13
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14
色素痣
A
明亮的黑素细胞巢围绕真 皮乳头呈圆形或椭圆形分布， 细胞形态规则，大小及明亮度 均一。细胞间有间隔。
B
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15
对皮肤疾病的治疗与疗效评估需 要先进的皮肤诊断技术
Emission Filter
Emission Filter Emission Pinhole
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10
原理示意图
光源（激光） 二色镜。 物镜 样品 针孔 检测仪 共焦显微镜的最大优点是可以只 从一个平面收集光。 针孔同焦平面成对（即共焦）， 使得来自焦平面以外的光远离检 测仪。 激光扫描显微镜按顺序一点一点 地、一行一行地扫描样品，将象 素资料合成一个图象。通过移动 焦平面，单个图象（光限幅）可 以放在一起，形成可以以后进行 数字处理的三维栈。
Ocular
Emission Filter
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7
Confocal microscopy
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8
Confocal Principle
激光扫描共聚焦显微镜原理
激光扫描共聚焦显微镜原理
激光扫描共聚焦显微镜（LSCM）是一种高分辨率的显微镜技术，它利用激光束扫描样品表面，通过共聚焦来获得高质量的图像。
LSCM的原理是利用激光束扫描样品表面，激发样品中的荧光物质发出荧光信号，然后通过共聚焦来获得高质量的图像。
共聚焦是指将激光束聚焦到样品表面上，使得样品表面上的荧光物质只在一个非常小的区域内发出荧光信号，这样就可以获得高分辨率的图像。
LSCM的优点是可以获得高分辨率的图像，可以观察到细胞和组织的微观结构，可以进行三维成像，可以观察到活细胞的动态过程。
LSCM的应用非常广泛，可以用于生物学、医学、材料科学等领域的研究。
LSCM的操作比较复杂，需要专业的技术人员进行操作。
在操作过程中需要注意保护样品，避免样品受到损伤。
此外，还需要注意激光的功率和扫描速度，以获得高质量的图像。
激光扫描共聚焦显微镜是一种高分辨率的显微镜技术，可以获得高质量的图像，应用非常广泛。
在使用过程中需要注意保护样品，避免样品受到损伤，同时还需要注意激光的功率和扫描速度，以获得高质量的图像。
激光共聚焦技术优秀课件
荧光样品的制备要求
荧光标记反应的特异性强、荧光定位准确 保持样品应有的结构形态完整性 荧光信号的响应准确、灵敏、具有可重复性 荧光强度适宜 荧光稳定性好 样品的荧光分布均匀 两种及两种以上的荧光信号之间荧光光谱交叉
可以消除 图象背景干净、干扰杂质少
荧光探针的种类及应用
原位鉴定细胞或组织内生物大分子、观察细胞及亚 细胞形态结构
图3-9 pA7-TTG1重组质粒酶切鉴定及PCR鉴定 酶切：重组质粒酶切产物；M：Marker DL 2000；PCR：重组质粒PCR产物
目的蛋白细胞器定位观察
含TTG1的瞬时表达载体转入洋葱表皮细胞
(1)将提取好的的含有目的基因的瞬时表达载体以及pA7-GFP载体约20 μL分别 加入1.5 mL离心管中，分别加入500 μL的蒸馏水，两管分别标号P1，P2。 (2) 分别取4片约1.5 cm*1.5 cm大小的洋葱表皮放入P1，P2。 (3)将P1，P2管管盖打开，用封口膜将其封上，扎两到三个小孔。 (4)将P1，P2管进行抽真空，抽到刚刚沸腾为止，一共抽三次。 (5)取MS培养基并在其上铺上一层滤纸。 (6)取出P1，P2管中的洋葱表皮，将其铺在MS培养基的滤纸上，加少量的水 培养16小时。
激光共聚焦显微镜基本操作
获取共焦图像的步骤
在 VIS 模式中观察样品 装入 LSM 配置 扫描图像 保存图像
不同厚度光切图像
Z轴扫描
Z轴扫描、时间系列扫描
时间系列扫描
Z轴扫描＋时间系列扫描
组织和细胞样品中荧光的来源
自发荧光 荧光染色 免疫荧光－荧光抗体法产生荧光 外源性荧光物质进入组织细胞内产生荧光 酶致荧光
成为形态学、分子细胞生物学、神经 科学、药理学和遗传学等领域中新的 有力研究工具。
《激光共聚焦简化》课件
显微镜设置与校准
激光器选择
根据所使用的荧光染料选 择适当的激光器波长。
滤色片配置
选择合适的滤色片以减少 背景噪声并提高信噪比。
校准与调整
确保显微镜的焦距、放大 倍数和视野等参数设置正 确，以便获得清晰的图像 。
图像采集与处理
采集模式选择
图像处理
根据观察需求选择单帧采集、多帧平 均或实时扫描模式。
技术培训
参加相关技术培训，提高操作和维护显微镜的能 力。
05 案例展示与解析
细胞生物学研究案例
细胞骨架结构观察
利用激光共聚焦显微镜技术观察细胞 骨架的动态变化，解析细胞生长、分 裂和迁移过程中的骨架重构过程。
细胞器定位与功能研究
通过共聚焦显微镜对细胞内特定细胞 器进行高分辨率成像，分析其在细胞 代谢、信号转导等方面的功能。
《激光共聚焦显微镜技术简 化操作与解析》
contents
目录
• 激光共聚焦显微镜简介 • 激光共聚焦显微镜操作流程 • 激光共聚焦显微镜解析技术 • 激光共聚焦显微镜的维护与保养 • 案例展示与解析
01 激光共聚焦显微 镜简介
定义与工作原理
定义
激光共聚焦显微镜是一种光学显微镜技术，利用激光作为光 源，通过共聚焦方式获取样品的高分辨率、高对比度图像。
优点
色彩复原技术能够提供高对比度和高 分辨率的图像，同时能够选择性地标 记和染色细胞或组织的特定结构，有 助于研究者更深入地了解细胞或组织 的生理和病理变化。
缺点
由于荧光染料可能会对细胞或组织产 生一定的毒性作用，因此需要严格控 制染料的浓度和作用时间。
定量分析技术
01 02
定量分析技术
利用激光共聚焦显微镜的定量分析软件，对获取的图像进行定量分析和 数据提取。这种技术能够提供更准确和可靠的实验数据，有助于研究者 更深入地了解细胞或组织的生理和病理变化。
激光共聚焦显微镜原理
激光共聚焦显微镜原理激光共聚焦扫描显微技术（Confocal laser scanning microscopy）是一种高分辨率的显微成像技术。
普通的荧光光学显微镜在对较厚的标本（例如细胞）进行观察时，来自观察点邻近区域的荧光会对结构的分辨率形成较大的干扰。
共聚焦显微技术的关键点在于，每次只对空间上的一个点（焦点）进行成像，再通过计算机控制的一点一点的扫描形成标本的二维或者三维图象。
在此过程中，来自焦点以外的光信号不会对图像形成干扰，从而大大提高了显微图象的清晰度和细节分辨能力。
图1. 共聚焦显微镜简化原理图图1是一般共聚焦显微镜的工作原理示意图。
用于激发荧光的激光束(Laser)透过入射小孔(light source pinhole)被二向色镜(Dichroic mirror)反射，通过显微物镜(Objective lens)汇聚后入射于待观察的标本(specimen)内部焦点(focal point)处。
激光照射所产生的荧光(fluorescence light)和少量反射激光一起，被物镜重新收集后送往二向色镜。
其中携带图像信息的荧光由于波长比较长，直接通过二向色镜并透过出射小孔(Detection pinhole)到达光电探测器(Detector)（通常是光电倍增管（PMT）或是雪崩光电二极管（APD）），变成电信号后送入计算机。
而由于二向色镜的分光作用，残余的激光则被二向色镜反射，不会被探测到。
图2. 探测针孔的作用示意图图2解释了出射小孔所起到的作用：只有焦平面上的点所发出的光才能透过出射小孔；焦平面以外的点所发出的光线在出射小孔平面是离焦的，绝大部分无法通过中心的小孔。
因此，焦平面上的观察目标点呈现亮色，而非观察点则作为背景呈现黑色，反差增加，图像清晰。
在成像过程中，出射小孔的位置始终与显微物镜的焦点(focal point)是一一对应的关系（共轭conjugate）,因而被称为共聚焦（con-focal）显微技术。
激光扫描共聚焦显微镜技术讲座 ppt课件
量、细胞膜流动性测量、膜电位测定) 细胞间隙连接的细胞间通讯
荧光探针的选择
合适的荧光探针是有效地进行实验并获取理想实 验结果的保障。
(1)现有仪器所采用的激光器 (2)荧光探针的光稳定性和光漂白性 (3)荧光的定性或定量
定性:单波长激发探针 定量:双波长激发比率探针 (4)荧光探针的特异性和毒性。 (5)荧光探针适用的pH
LSCM 的发展 1957年 提出了共聚焦显微镜技术的某些基本原理，并获
得了美国的专利。
1967年 成功的应用共聚焦显微镜产生了一个光学横面。 1970年 牛津和阿姆斯特丹同时向科学界推荐了一种新型
的扫描共聚焦显微镜。
1984年 Bio-Rad公司推出了世界第一台共聚焦显微镜品。 1987年 White和Amos在英国《自然》杂志发表了“共聚焦
2、球差：
由主轴上某一物点向光学系
统发出的单色圆锥形光束，经该 光学系列折射后， 不能聚焦成 一点,使成像模糊不清,形成一弥 散光斑(俗称模糊圈)，则此光学 系统的成像误差称为球差。
3、色差： 由白色物点向光学系统发出一束
白光，经该光学系列折射后，组成该 束白光的红、橙、黄、绿、青、蓝、 紫等各色光，不能会聚于同一点，即 白色物点不能结成白色像点，而结成 一彩色像斑的成像误差，称为色差。
*
不同的荧光探针在不同标本的效果常有差
异，故除综合考虑以上因素以外，有条件者应进
行染料的筛选，以找出最适的荧光探针。
*
许多荧光探针是疏水性的，很难或不能进
入细胞，需使荧光探针与AM（乙酰羟甲基酯）
结合后变成不带电荷的亲脂性化合物方易于通过
质膜进入细胞，在细胞内荧光探针上的AM被非
特异性酯酶水解，去掉AM后的荧光探针不仅可
荧光探针的选择
合适的荧光探针是有效地进行实验并获取理想实 验结果的保障。
(1)现有仪器所采用的激光器 (2)荧光探针的光稳定性和光漂白性 (3)荧光的定性或定量
定性:单波长激发探针 定量:双波长激发比率探针 (4)荧光探针的特异性和毒性。 (5)荧光探针适用的pH
LSCM 的发展 1957年 提出了共聚焦显微镜技术的某些基本原理，并获
得了美国的专利。
1967年 成功的应用共聚焦显微镜产生了一个光学横面。 1970年 牛津和阿姆斯特丹同时向科学界推荐了一种新型
的扫描共聚焦显微镜。
1984年 Bio-Rad公司推出了世界第一台共聚焦显微镜品。 1987年 White和Amos在英国《自然》杂志发表了“共聚焦
2、球差：
由主轴上某一物点向光学系
统发出的单色圆锥形光束，经该 光学系列折射后， 不能聚焦成 一点,使成像模糊不清,形成一弥 散光斑(俗称模糊圈)，则此光学 系统的成像误差称为球差。
3、色差： 由白色物点向光学系统发出一束
白光，经该光学系列折射后，组成该 束白光的红、橙、黄、绿、青、蓝、 紫等各色光，不能会聚于同一点，即 白色物点不能结成白色像点，而结成 一彩色像斑的成像误差，称为色差。
*
不同的荧光探针在不同标本的效果常有差
异，故除综合考虑以上因素以外，有条件者应进
行染料的筛选，以找出最适的荧光探针。
*
许多荧光探针是疏水性的，很难或不能进
入细胞，需使荧光探针与AM（乙酰羟甲基酯）
结合后变成不带电荷的亲脂性化合物方易于通过
质膜进入细胞，在细胞内荧光探针上的AM被非
特异性酯酶水解，去掉AM后的荧光探针不仅可
激光扫描共聚焦显微镜教学课件
扫描速度与分辨率设置
根据实验需求，调整扫描速度和分辨率以确 保图像质量。
图像采集
校准
确保显微镜处于校准状态，避 免图像出现畸变或失真。
采集参数设置
设置合适的曝光时间、增益和 数字位数等参数，以确保图像 质量。
多区域采集
如需观察大范围样品，可设置 多个采集区域，并确保各区域 间无缝拼接。
实时预览
在采集过程中实时预览图像， 确保图像质量满足要求。
特点
高分辨率、高对比度、高灵敏度 、无损检测、能够观察活细胞等 。
工作原理
01
激光束通过显微物镜照 射到样品上，形成光斑 ；
02
光斑通过扫描器在样品 表面进行扫描，同时收 集反射光或荧光；
03
反射光或荧光通过共聚 焦系统汇聚到光电倍增 管上，转换成电信号；
04
电信号经过处理后形成 图像，显示在计算机屏 幕上。
根据实验需求设置采集参数，如曝光 时间、增益等，以获取高质量的图像 。
CHAPTER 04
激光扫描共聚焦显微镜实验 案例
细胞膜流动性研究
总结词
通过观察细胞膜荧光标记物的扩散和 分布，了解细胞膜的流动性。
详细描述
利用荧光染料标记细胞膜，在激光扫 描共聚焦显微镜下观察标记物的动态 变化，通过分析荧光强度和分布的变 化，可以了解细胞膜的流动性。
高速成像
研发更快的扫描速度和数据处理能力，实现实时动态观察 ，缩短实验时间，提高实验效率。
多维成像
拓展激光扫描共聚焦显微镜的成像维度，从二维平面扩展 到三维立体成像，甚至包括时间序列的四维成像，以更全 面地揭示细胞活动和分子交互过程。
应用领域的拓展
临床诊断
将激光扫描共聚焦显微镜应用于 临床诊断，通过观察活体组织样 本，为疾病诊断和治疗提供更准
根据实验需求，调整扫描速度和分辨率以确 保图像质量。
图像采集
校准
确保显微镜处于校准状态，避 免图像出现畸变或失真。
采集参数设置
设置合适的曝光时间、增益和 数字位数等参数，以确保图像 质量。
多区域采集
如需观察大范围样品，可设置 多个采集区域，并确保各区域 间无缝拼接。
实时预览
在采集过程中实时预览图像， 确保图像质量满足要求。
特点
高分辨率、高对比度、高灵敏度 、无损检测、能够观察活细胞等 。
工作原理
01
激光束通过显微物镜照 射到样品上，形成光斑 ；
02
光斑通过扫描器在样品 表面进行扫描，同时收 集反射光或荧光；
03
反射光或荧光通过共聚 焦系统汇聚到光电倍增 管上，转换成电信号；
04
电信号经过处理后形成 图像，显示在计算机屏 幕上。
根据实验需求设置采集参数，如曝光 时间、增益等，以获取高质量的图像 。
CHAPTER 04
激光扫描共聚焦显微镜实验 案例
细胞膜流动性研究
总结词
通过观察细胞膜荧光标记物的扩散和 分布，了解细胞膜的流动性。
详细描述
利用荧光染料标记细胞膜，在激光扫 描共聚焦显微镜下观察标记物的动态 变化，通过分析荧光强度和分布的变 化，可以了解细胞膜的流动性。
高速成像
研发更快的扫描速度和数据处理能力，实现实时动态观察 ，缩短实验时间，提高实验效率。
多维成像
拓展激光扫描共聚焦显微镜的成像维度，从二维平面扩展 到三维立体成像，甚至包括时间序列的四维成像，以更全 面地揭示细胞活动和分子交互过程。
应用领域的拓展
临床诊断
将激光扫描共聚焦显微镜应用于 临床诊断，通过观察活体组织样 本，为疾病诊断和治疗提供更准
《激光共聚焦技术》课件
多模态成像技术结合
将激光共聚焦技术与其它成像技术（如超声、MRI等）相 结合，可以实现多模态、多尺度的成像，为科学研究提供 更多信息。
人工智能与大数据分析
结合人工智能和大数据分析技术，对激光共聚焦图像进行 深度挖掘和定量分析，提高实验结果的可靠性和可重复性 。
05
实验操作与注意事项
实验前的准备
实验材料
将激光束转换为扫描线，并控 制显微镜的X和Y轴移动。
检测器
用于检测荧光信号，并将信号 转换为电信号。
激光器
用于产生激发光，常用波长为 405nm、488nm、561nm和 640nm。
物镜
用于将激光束聚焦到样品上， 并收集荧光信号。
计算机
用于控制扫描头、物镜和检测 器，并收集和处理荧光信号。
性能指标
光漂白与光毒性
强激光束可能会引起荧光分子的光漂 白和光毒性，影响实验结果和细胞活 性。
未来发展与展望
提高成像速度
未来可以通过改进扫描技术和提高探测器性能来提高激光 共聚焦技术的成像速度，以适应更多动态观察的需求。
拓展应用领域
随着技术的进步和应用需求的增加，激光共聚焦技术有望 在更多领域得到应用，如医学诊断、药物研发等。
细胞生物学研究
细胞形态与结构研究
利用激光共聚焦技术观察细胞形态、细胞器结构以及细胞骨架等，有助于深入 了解细胞生物学特性。
细胞分子定位与相互作用
通过荧光标记技术，对特定分子进行定位和追踪，研究分子在细胞内的分布、 动态变化以及与其他分子的相互作用。
医学诊断与治疗
疾病诊断
利用激光共聚焦技术对活体组织进行无创检测，有助于早期发现和诊断肿瘤、炎 症等疾病。
显微镜设置
根据实验需求，设置 激光波长、扫描速度 、分辨率等参数。
激光共聚焦技术PPT课件
科学、药理学和遗传学等领域中新的
有力研究工具。
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3
激光共聚焦显微镜在生物学中的应用
原位鉴定细胞或组织内生 活体细胞或组织功能的实
物大分子、观察细胞及亚 时动态监测
细胞形态结构
实时定量测定细胞内Ca2+变
检测核酸
化
检测蛋白质细胞定位
测定细胞内pH变化
检测细胞凋亡
检测膜电位变化
细胞器的观察及测定 检测细胞融合 观察细胞骨架 检测细胞间缝隙连接通讯 检测细胞内脂肪
另外Fluo 3对于紫外光照射下可裂解的螯合钙或其 它形式的钙也有作用。
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15
Projection
save “projection”
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16
图7～10. 7. 连续降温下生成 Ca2 + 荧光随时间变化的曲线 同时记录的荧光图像, 显示冬 小麦胞内荧光有相同的变化趋 势。8. 连续降温下生成Ca2 + 荧光随时间变化的曲线同时记 录的荧光图像, 显示春小麦胞 内荧光有相同的变化趋势。9. Fluo-3/ AM染色后,静息态下冬 小麦原生质体的三维重组图像。 10. Fluo-3/ AM染色后,静息态 下春小麦原生质体的三维重组 图像。
图3-9 pA7-TTG1重组质粒酶切鉴定及PCR鉴定 酶切：重组质粒酶切产物；M：Marker DL 2000；PCR：重组质粒PCR产物
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目的蛋白细胞器定位观察
含TTG1的瞬时表达载体转入洋葱表皮细胞
(1)将提取好的的含有目的基因的瞬时表达载体以及pA7-GFP载体约20 μL分别 (2)加入1.5 mL离心管中，分别加入500 μL的蒸馏水，两管分别标号P1，P2。 (2) 分别取4片约1.5 cm*1.5 cm大小的洋葱表皮放入P1，P2。 (3)将P1，P2管管盖打开，用封口膜将其封上，扎两到三个小孔。 (4)将P1，P2管进行抽真空，抽到刚刚沸腾为止，一共抽三次。 (5)取MS培养基并在其上铺上一层滤纸。 (6)取出P1，P2管中的洋葱表皮，将其铺在MS培养基的滤纸上，加少量的水 培养16小时。
激光共聚焦显微镜原理
激光共聚焦显微镜原理
激光共聚焦显微镜是一种利用激光光源和光学系统进行成像的显微镜。
它可以实现高分辨率、高对比度的三维图像获取。
激光共聚焦显微镜的原理是基于共聚焦的概念。
其核心部件是激光扫描系统和探测器。
激光扫描系统由激光器、扫描镜和一系列聚焦镜组成。
激光器发出一束光，经过扫描镜反射和聚焦镜的调节，使得光束能够在样品上形成一个聚焦点。
在样品上的聚焦点处，光与样品发生相互作用，一部分光被样品吸收、散射或荧光激发，另一部分光经过样品的透射或反射。
探测器是用来收集经过样品的光信号。
常用的探测器包括光电二极管和光电倍增管。
收集到的光信号经过增强处理和放大后，转化为电信号。
这些信号经过处理后，可以生成二维或三维的图像。
激光共聚焦显微镜具有许多优点。
首先，它具有非常高的分辨率，在亚细胞水平上可以观察到细胞和组织结构。
其次，它可以实现非侵入性的成像，即无需染色和切片处理，就可以观察到活细胞的结构和功能。
此外，激光共聚焦显微镜还可以捕捉到高质量的图像和进行实时观察，对于研究生物学、医学和材料科学等领域具有重要的应用价值。
总之，激光共聚焦显微镜运用激光光源和光学系统，通过共聚焦原理实现高分辨率的三维图像获取，具有广泛的应用前景。
荧光共聚焦 激光扫描共聚焦ppt课件
7
只要载物台沿着Z轴上下移动，将样品新的一个层面移动 到共焦平面上，样品的新层面又成像在显色器上。
分辨率：0.18μm
点照明，具有照明点和探测点，具有扫描系统，逐点扫描 成像
具有四个荧光通道，可同时探测多个被标记物，一个透射 光道，同时采集透射光图像（非共焦图像）
8 8
弧灯 膜
目镜
孔
9
02 应用
4
荧光显微镜
• 利用一定波长的光使样品受到激发，产生不同颜色的荧光，以用来观察和 分辨样品中某些化学成分和细胞组分的一种显微镜。
• 自发荧光：组织，细胞不经荧光色素染色，在紫外光照射下，某些成分所 呈现的荧光。
• 继发性荧光：组织，细胞经荧光色素染色，由于荧光色素和组织细胞内的 某种成分结合后而呈现的荧光。
荧光共聚焦显微镜
激光扫描共聚焦荧光显微镜 (laser scanning confocal microscopy,LSCM)
1
2
目录
01 原理 02 应用
2
01 原理
3
4
荧光，又作“萤光”，是指一种光致发光的冷发光现象。 当某种常温物质经某种波长的入射光（通常是紫外线或X射 线）照射，吸收光能后进入激发态，并且立即退激发并发 出比入射光的的波长长的出射光（通常波长在可见光波 段）；很多荧光物质一旦停止入射光，发光现象也随之立 即消失。具有这种性质的出射光就被称之为荧光。
17
18
Conversion of azide to primary amine via Staudinger
reaction in metal-organic fracile conversion of azide to primary amine in metalorganic frameworks (MOFs) was accomplished by Staudinger reduction. After the reaction, MOFs retained high crystallinity confirmed by X-ray diffraction patterns, meaning a high usability of this method for postsynthetic modification of MOFs. Bulky phosphine groups provided surface-selective modification of MOFs via a reaction between resulting amine groups of MOF and activated ester with fluorescein, illustrated by confocal laser scanning microscope (CLSM) observation. This method opens up new possibilities for the preparation of MOFs having core-shell structures.
只要载物台沿着Z轴上下移动，将样品新的一个层面移动 到共焦平面上，样品的新层面又成像在显色器上。
分辨率：0.18μm
点照明，具有照明点和探测点，具有扫描系统，逐点扫描 成像
具有四个荧光通道，可同时探测多个被标记物，一个透射 光道，同时采集透射光图像（非共焦图像）
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弧灯 膜
目镜
孔
9
02 应用
4
荧光显微镜
• 利用一定波长的光使样品受到激发，产生不同颜色的荧光，以用来观察和 分辨样品中某些化学成分和细胞组分的一种显微镜。
• 自发荧光：组织，细胞不经荧光色素染色，在紫外光照射下，某些成分所 呈现的荧光。
• 继发性荧光：组织，细胞经荧光色素染色，由于荧光色素和组织细胞内的 某种成分结合后而呈现的荧光。
荧光共聚焦显微镜
激光扫描共聚焦荧光显微镜 (laser scanning confocal microscopy,LSCM)
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目录
01 原理 02 应用
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01 原理
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荧光，又作“萤光”，是指一种光致发光的冷发光现象。 当某种常温物质经某种波长的入射光（通常是紫外线或X射 线）照射，吸收光能后进入激发态，并且立即退激发并发 出比入射光的的波长长的出射光（通常波长在可见光波 段）；很多荧光物质一旦停止入射光，发光现象也随之立 即消失。具有这种性质的出射光就被称之为荧光。
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Conversion of azide to primary amine via Staudinger
reaction in metal-organic fracile conversion of azide to primary amine in metalorganic frameworks (MOFs) was accomplished by Staudinger reduction. After the reaction, MOFs retained high crystallinity confirmed by X-ray diffraction patterns, meaning a high usability of this method for postsynthetic modification of MOFs. Bulky phosphine groups provided surface-selective modification of MOFs via a reaction between resulting amine groups of MOF and activated ester with fluorescein, illustrated by confocal laser scanning microscope (CLSM) observation. This method opens up new possibilities for the preparation of MOFs having core-shell structures.
共聚焦激光扫描显微术ppt课件-PPT精选文档
思考题： 1. 结合1-2个例子，简述激光共聚焦扫描显微
镜技术在生物医学中的应用。
名词解释：
1. 荧光漂白恢复技术(Fluorescent Redistribution After Photobleaching,FRAP)
2. 光笼锁（caged）化合物技术
Thanks for your attention!
红色荧光蛋白(RFP)是从海产的IndoPacific
sea anemone relative Discoma Striiata 中分 离的一种独特的显示红色荧光的蛋白质，故又名 为DsRed。
五、在神经生物学的应用
1.神经细胞参数测定及三维重建 • 细胞外形 • 浦肯野氏细胞及其突起的投射 • 神经细胞轴突走向及神经支配的研究 • 神经骨架重组的研究
二、基本原理
1.光学成像
激光器产生的激光经物镜聚焦到样品上 反射光或荧光经目镜汇聚于探测器 探检测器前有一小孔(Pinhole)汇聚光束
2.成像保存 以电信号形式储存， 可以进行图象分析（参数、 伪彩、值等）。
3.共轭(confocal) 是指光源孔和检测针孔对 物镜焦平面是共轭的。
宽场照明显微镜和共聚焦图象比较
笼锁神经递质、调质及抗体
例：光照解笼锁 NPE-氨甲酰胆碱→血管平滑肌收缩（氨
甲酰释放） Caged入Cell途径：诱入法，酯化法，电
极导入法，膜片钳全细胞方式导入法
CLSM的优点
1.激光是单色光、LM观察、荧光观察 2.推进器步距达0.1um（“显微CT”） 3.图象以电信号形式记录、储存，可修饰
转染pEGFP载体后24h可见神经干细胞集落内 有少量GFP阳性细胞。 (荧光+普通光相差显微镜×100倍)
激光扫描共聚焦显微镜.完整版PPT资料
细胞膜静息膜电位容易与线粒体亲和，为线粒体膜电位探针
五.荧光漂白恢复(FRAP: Fluorescence Recover after
photobleaching）
%F
Intense laser Beam
Bleaches Fluorescence
20.00
0.00
200.00
Physiology Chart (Time: 11:40:49)
400.00
600.00
800.00
1000.00
1200.00
s
400.00
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s
•程序化测量：用timelapse中的编程按钮可进行不同时间
•序列的扫描测量
测多个被标记物
Fluorescent Microscope Confocal Microscope
Arc Lamp
Laser
Excitation Diaphragm Excitation Filter
Ocular
Excitation Pinhole
Excitation Filter PMT
Objective
线粒体膜电位：-150mV
3D reconstruction
Bleaches Fluorescence
光学显微镜分辨率：0.
荧光能量共振转移的条件
•相对 测量
Channel 1
Int.
160.00
120.00
80.00
40.00
0.00
200.00
Channel 2
Int.
80.00
60.00
共聚焦激光荧光显微镜简介以及原理ppt课件
;
• 〔2〕多光束扫描
;
• 奥林巴斯Fluo View300 激光共聚焦扫描系统
强度调整密度塔
激发发 射和射 柱准直 仪
光电倍增器
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ电源
双色镜
X-Y检流计镜扫描 控制器
激发和 发射滤 波滑动 器
出入口透 镜系统
;
同样可以实现 X—Z轴，Y—Z轴扫描
;
• 通常的方法是经过计算机控制的马达以预 先设定的步距挪动显微镜的镜台然后采集 图像。
配置照明效率低，而且扫描速度更快。其中旋 转盘扫描仪有数百个孔，其功能作为照明和探 测的针孔。由于磁盘扫描显微镜构成的实像， 可以直接位于CCD照相机的图像平面中。虽然 这方面的优势，它允许实时聚焦和成像的动态 过程，有几个缺陷限制了磁盘扫描共聚焦系统 的实践成效。其中最严重的是典型的依赖于传 统的广谱光源，和在磁盘发生极端的光损失。
共聚焦激光扫描荧光显微镜 〔LaserscanningConfocalMicrosco py，LSCM 〕
以激光作为光源，采用光源针孔 共与聚检焦系测统针孔共轭聚焦技术，对样本进 展细断胞层CT 扫描，以获得高分辨率光学切 片的荧光显微镜系统
;
荧光和荧光显微镜
一、荧光的根底术语 荧光物质：
488nm 520nm
双色镜：双色分光镜；反射短波长，透过长波长。
488nm
520nm
阻断滤镜：多为长通滤色镜；LP490
;
450nm
490nm
FITC
荧光显微镜的缺乏:
1.无法实现对荧光,透射光的同时采集,无法实 现多重荧光的同时采集及共定位。
2.荧光散射光太强，呵斥实践分辨率的大大下 降。
3.荧光漂白及对细胞组织的照射损伤。 4.无法对样品进展断层扫描,完成3D的任务。 5.滤镜对荧光信号衰减大,灵敏度—荧光强度
• 〔2〕多光束扫描
;
• 奥林巴斯Fluo View300 激光共聚焦扫描系统
强度调整密度塔
激发发 射和射 柱准直 仪
光电倍增器
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ电源
双色镜
X-Y检流计镜扫描 控制器
激发和 发射滤 波滑动 器
出入口透 镜系统
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同样可以实现 X—Z轴，Y—Z轴扫描
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• 通常的方法是经过计算机控制的马达以预 先设定的步距挪动显微镜的镜台然后采集 图像。
配置照明效率低，而且扫描速度更快。其中旋 转盘扫描仪有数百个孔，其功能作为照明和探 测的针孔。由于磁盘扫描显微镜构成的实像， 可以直接位于CCD照相机的图像平面中。虽然 这方面的优势，它允许实时聚焦和成像的动态 过程，有几个缺陷限制了磁盘扫描共聚焦系统 的实践成效。其中最严重的是典型的依赖于传 统的广谱光源，和在磁盘发生极端的光损失。
共聚焦激光扫描荧光显微镜 〔LaserscanningConfocalMicrosco py，LSCM 〕
以激光作为光源，采用光源针孔 共与聚检焦系测统针孔共轭聚焦技术，对样本进 展细断胞层CT 扫描，以获得高分辨率光学切 片的荧光显微镜系统
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荧光和荧光显微镜
一、荧光的根底术语 荧光物质：
488nm 520nm
双色镜：双色分光镜；反射短波长，透过长波长。
488nm
520nm
阻断滤镜：多为长通滤色镜；LP490
;
450nm
490nm
FITC
荧光显微镜的缺乏:
1.无法实现对荧光,透射光的同时采集,无法实 现多重荧光的同时采集及共定位。
2.荧光散射光太强，呵斥实践分辨率的大大下 降。
3.荧光漂白及对细胞组织的照射损伤。 4.无法对样品进展断层扫描,完成3D的任务。 5.滤镜对荧光信号衰减大,灵敏度—荧光强度