免疫组织化学染色技术PPT
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上述的各种染色方法只能在细胞水平上显示组织结构的形 态改变。
三、超微结构的观察
光线波长的限制，光学显微镜的分辨率极限为0.2m 有效放大倍数最高不超过2000倍。
电镜的分辨率最佳可达0.14nm，放大倍率最高可达100万倍 。
第二节 免疫组织化学染色技术
Immunohistochemical technique
免疫组织化学染色的反应原理及显色原理
1. 免疫组织化学染色的反应原理 染色反应的最基本原理是抗原抗体的反应。
通过对针对标本中相应抗原的抗体上标记某种 发色剂或酶类，再通过激发发色剂或使用某种显 色剂，在显微镜下使标本中抗原抗体反应的部位 产生肉眼可观察到的颜色以确定所要检测的抗原 是否存在。
通过免疫组织化学染色技术，在光学显微镜下 即可检测到所要研究的蛋白分子类物质的存在与 否。
目的：主要用于心、肝、肾脂肪变性，动脉粥样 硬化大体标本的染色
试剂：苏丹Ⅲ或苏丹Ⅳ 结果：病变处脂肪组织呈橙黄色 ➢早期心肌梗死染色法 目的：显示早期心肌梗死的区域 试剂：0.1% NBT(硝基四唑蓝) / 0.2 mol / L PBS
(pH 7.6) 方法：将2-3 mm 厚新鲜心肌大片放入试剂中，37 °C
HRP + D + 2H2O
HRP催化的酶促反应第一步是特异的，其余反应是 非特异的，因此，可选用各种供氢体作为显色剂，可使 反应的终产物呈现不同的颜色，如：
CN为蓝色 TMB为深蓝色 AEC为红色 DAB为棕色
碱性磷酸酶 (alkaline phosphatase, ALP)
以 AS-Mx （ 色 酚 AS-MX 磷 酸 盐 ） 为 底 物 ， FB/FR (Fast blue/Fast red)为发色剂，生成蓝色 / 红色不容性沉淀物。
ALP标记的抗体主要用于内源性过氧化物酶含量较高的 血细胞、淋巴细胞等的ICC染色。
由于组织细胞内含有内源性ALP，在显色液中需加入终 浓度为2-4mol/L的左旋咪唑 (levamisole)，大多数内源性ALP 活性可被抑制。
葡萄糖氧化酶 (glucose oxidase，GOD )
该技术主要是用于研究和观察细胞中的某些结构 或分子物质和组织细胞间的成分，因此现又称为免疫 细胞化学技术。
根据标记物的不同，免疫细胞化学技术可分为： 1. 免疫酶细胞化学技术 2. 免疫荧光细胞化学技术 3. 免疫铁蛋白技术 4. 免疫金-银细胞化学技术 5. 免疫电子显微镜技术
一、免疫组织化学染色方法的原理
孵育20 min。 结果：正常心肌呈蓝色，早期心肌梗死区、纤维结缔
组织、瘢痕组织呈浅蓝色或不显色。 注意 ：新鲜标本，尸检心肌不超过6小时。
二、光学显微镜下的组织学染色方法
常规HE染色（hematoxylin and eosin staining） 组织学特殊染色
1. Mallory 三染色、Masson三染色 2. 神经纤维的镀银染色 3. 其他的特殊染色，包括钙、铁、铅、铜、黑色素和脂褐素 、细胞DNA和RNA的染色等
2. 抗原的分类
完全抗原、半抗原 免疫学分类
胸腺依赖抗原与非依赖抗原
临床分类
外源性抗原：微生物、花粉等 内源性抗原：隐蔽的自身抗原、肿
瘤相关抗原等 同种异型抗原：人类白细胞抗原、
血型抗原 异嗜性抗原：人与其他动物、植物
等之间存在的共同抗原
抗体（antibody）
1. 定义：机体受到抗原刺激后，通过体液免疫应答 ，B淋巴细胞活化、增殖，分化为浆细胞，由浆细 胞合成并分泌的仅与该抗原发生特异性反应的球蛋 白，称为抗体。
间接法中所用的一抗是针对组织或细胞中某种抗原的特 异性抗体，多数抗体是由家兔制备的多克隆抗体或由小鼠 制备的单克隆抗体。
第二抗体是第一抗体的抗体，所以只要不同的 第一抗体均来自同一种属动物，与标记的第二抗 体结合就能用来显示不同特异性抗原的存在。这 样可避免直接法中标记每一种第一抗体的麻烦。 通过某种技术增加第二抗体上标记酶的含量， 可提高免疫组织化学染色的敏感度。
免疫组织化学染色技术
第一节 常规组织学染色技术概述
宏观 微观 超微结构 基因水平 组织形态学研究技术的种类：
一、病理大体组织标本的染色方法
在标本制作中，为了某种特殊目的，突出显示标 本的重要部分，借助组织切片的特殊染色方法对标本 进行染色，将病变器官及不同组织成分用染料染成不 同的颜色，以便于区分大体标本的不同成分和病变特 点，如： ➢ 脂肪组织染色法
大部分抗体电泳后位于区带，1972年国际免疫 学联合会正式将化学结构相同或相似的一类球蛋白 分子统一命名为免疫球蛋白(immunoglobin，Ig)。
2. 抗体的种类: 五类，即IgA、IgD、IgE、IgG、IgM 免疫组织化学染色技术中，使用的抗体主要是
IgG，个别情况下使用IgG的亚型，多为IgG1。
IHC技术中，绝大多数以间接法为常用。
（2）显色的基本程序 1抗孵育切片或细胞涂片 2抗（酶标抗体）
孵育切片 发色剂显色 （核复染）
（3）酶标抗体法的显色原理及显色剂
辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP ）
HRP + H2O2
HRP ·H2O2
HRP ·H2O2 + DH2
2. 免疫组织化学染色的显色原理
(1) 基本原理 荧光标记或酶标抗体的染色分为直接法和间接法。其中
以酶标抗体法应用最为广泛。
直接法：是将酶直接标记在第一抗体上，用酶标抗体与 切片上待检测的组织或细胞中抗原反应，再用底物显色， 显示出所检测的目的抗原的部位。
间接法：是将酶标记在第二抗体或与第二抗体具有亲和 性的某种分子上，检测组织或细胞内的特异性抗原物质。
抗原（antห้องสมุดไป่ตู้gen）
1. 定义：是一类在适合条件下能激发机体免疫系统 发生免疫应答，并能与免疫应答产生的效应物质 （抗体和效应细胞）在体内或体外发生特异性结 合反应的物质。抗原具有两种性能：
（1）免疫原性（immunogenicity） 指抗原分子具 有诱导机体产生免疫应答的特性。
（2）反应原性（reactogenicity）指抗原分子与抗 体或效应 T 细胞等免疫应答产物发生特异性反应的 特性。
三、超微结构的观察
光线波长的限制，光学显微镜的分辨率极限为0.2m 有效放大倍数最高不超过2000倍。
电镜的分辨率最佳可达0.14nm，放大倍率最高可达100万倍 。
第二节 免疫组织化学染色技术
Immunohistochemical technique
免疫组织化学染色的反应原理及显色原理
1. 免疫组织化学染色的反应原理 染色反应的最基本原理是抗原抗体的反应。
通过对针对标本中相应抗原的抗体上标记某种 发色剂或酶类，再通过激发发色剂或使用某种显 色剂，在显微镜下使标本中抗原抗体反应的部位 产生肉眼可观察到的颜色以确定所要检测的抗原 是否存在。
通过免疫组织化学染色技术，在光学显微镜下 即可检测到所要研究的蛋白分子类物质的存在与 否。
目的：主要用于心、肝、肾脂肪变性，动脉粥样 硬化大体标本的染色
试剂：苏丹Ⅲ或苏丹Ⅳ 结果：病变处脂肪组织呈橙黄色 ➢早期心肌梗死染色法 目的：显示早期心肌梗死的区域 试剂：0.1% NBT(硝基四唑蓝) / 0.2 mol / L PBS
(pH 7.6) 方法：将2-3 mm 厚新鲜心肌大片放入试剂中，37 °C
HRP + D + 2H2O
HRP催化的酶促反应第一步是特异的，其余反应是 非特异的，因此，可选用各种供氢体作为显色剂，可使 反应的终产物呈现不同的颜色，如：
CN为蓝色 TMB为深蓝色 AEC为红色 DAB为棕色
碱性磷酸酶 (alkaline phosphatase, ALP)
以 AS-Mx （ 色 酚 AS-MX 磷 酸 盐 ） 为 底 物 ， FB/FR (Fast blue/Fast red)为发色剂，生成蓝色 / 红色不容性沉淀物。
ALP标记的抗体主要用于内源性过氧化物酶含量较高的 血细胞、淋巴细胞等的ICC染色。
由于组织细胞内含有内源性ALP，在显色液中需加入终 浓度为2-4mol/L的左旋咪唑 (levamisole)，大多数内源性ALP 活性可被抑制。
葡萄糖氧化酶 (glucose oxidase，GOD )
该技术主要是用于研究和观察细胞中的某些结构 或分子物质和组织细胞间的成分，因此现又称为免疫 细胞化学技术。
根据标记物的不同，免疫细胞化学技术可分为： 1. 免疫酶细胞化学技术 2. 免疫荧光细胞化学技术 3. 免疫铁蛋白技术 4. 免疫金-银细胞化学技术 5. 免疫电子显微镜技术
一、免疫组织化学染色方法的原理
孵育20 min。 结果：正常心肌呈蓝色，早期心肌梗死区、纤维结缔
组织、瘢痕组织呈浅蓝色或不显色。 注意 ：新鲜标本，尸检心肌不超过6小时。
二、光学显微镜下的组织学染色方法
常规HE染色（hematoxylin and eosin staining） 组织学特殊染色
1. Mallory 三染色、Masson三染色 2. 神经纤维的镀银染色 3. 其他的特殊染色，包括钙、铁、铅、铜、黑色素和脂褐素 、细胞DNA和RNA的染色等
2. 抗原的分类
完全抗原、半抗原 免疫学分类
胸腺依赖抗原与非依赖抗原
临床分类
外源性抗原：微生物、花粉等 内源性抗原：隐蔽的自身抗原、肿
瘤相关抗原等 同种异型抗原：人类白细胞抗原、
血型抗原 异嗜性抗原：人与其他动物、植物
等之间存在的共同抗原
抗体（antibody）
1. 定义：机体受到抗原刺激后，通过体液免疫应答 ，B淋巴细胞活化、增殖，分化为浆细胞，由浆细 胞合成并分泌的仅与该抗原发生特异性反应的球蛋 白，称为抗体。
间接法中所用的一抗是针对组织或细胞中某种抗原的特 异性抗体，多数抗体是由家兔制备的多克隆抗体或由小鼠 制备的单克隆抗体。
第二抗体是第一抗体的抗体，所以只要不同的 第一抗体均来自同一种属动物，与标记的第二抗 体结合就能用来显示不同特异性抗原的存在。这 样可避免直接法中标记每一种第一抗体的麻烦。 通过某种技术增加第二抗体上标记酶的含量， 可提高免疫组织化学染色的敏感度。
免疫组织化学染色技术
第一节 常规组织学染色技术概述
宏观 微观 超微结构 基因水平 组织形态学研究技术的种类：
一、病理大体组织标本的染色方法
在标本制作中，为了某种特殊目的，突出显示标 本的重要部分，借助组织切片的特殊染色方法对标本 进行染色，将病变器官及不同组织成分用染料染成不 同的颜色，以便于区分大体标本的不同成分和病变特 点，如： ➢ 脂肪组织染色法
大部分抗体电泳后位于区带，1972年国际免疫 学联合会正式将化学结构相同或相似的一类球蛋白 分子统一命名为免疫球蛋白(immunoglobin，Ig)。
2. 抗体的种类: 五类，即IgA、IgD、IgE、IgG、IgM 免疫组织化学染色技术中，使用的抗体主要是
IgG，个别情况下使用IgG的亚型，多为IgG1。
IHC技术中，绝大多数以间接法为常用。
（2）显色的基本程序 1抗孵育切片或细胞涂片 2抗（酶标抗体）
孵育切片 发色剂显色 （核复染）
（3）酶标抗体法的显色原理及显色剂
辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP ）
HRP + H2O2
HRP ·H2O2
HRP ·H2O2 + DH2
2. 免疫组织化学染色的显色原理
(1) 基本原理 荧光标记或酶标抗体的染色分为直接法和间接法。其中
以酶标抗体法应用最为广泛。
直接法：是将酶直接标记在第一抗体上，用酶标抗体与 切片上待检测的组织或细胞中抗原反应，再用底物显色， 显示出所检测的目的抗原的部位。
间接法：是将酶标记在第二抗体或与第二抗体具有亲和 性的某种分子上，检测组织或细胞内的特异性抗原物质。
抗原（antห้องสมุดไป่ตู้gen）
1. 定义：是一类在适合条件下能激发机体免疫系统 发生免疫应答，并能与免疫应答产生的效应物质 （抗体和效应细胞）在体内或体外发生特异性结 合反应的物质。抗原具有两种性能：
（1）免疫原性（immunogenicity） 指抗原分子具 有诱导机体产生免疫应答的特性。
（2）反应原性（reactogenicity）指抗原分子与抗 体或效应 T 细胞等免疫应答产物发生特异性反应的 特性。