第四章 细胞破碎和分离技术

（2）有机溶剂法
有机溶剂能溶解细胞壁的脂类，从而改变细 胞通透性。
（3）表面活性物质
能溶解膜结构中的脂蛋白，使细胞通透性增加。
化学法的优缺点 优点 细胞外形保持完整，碎片少，浆液粘度低，
易于固液分离和进一步提取。
①通用性差；
缺点 ②时间长，效率低，一般胞内物质释放率
不超过 80％。 ③有些化学试剂有毒，后续工作需设法分 离除去。
第四章 细胞破碎和分离提 取技术
发酵液或培养液 预处理
固液分离（离心或过滤）
固体沉淀：胞内产物
清液：胞外产物
细胞破碎和细胞碎片分离
目标产物
本章内容
目标产物
一、细胞破碎的主要阻力：细胞壁
细胞破碎的主要目的：破坏细胞壁和细胞膜， 使细胞内物质释放出来。
各种微生物细胞壁组成与结构
二、常用细胞破碎技术及原理
（四）生物法
1、酶溶法
（1）原理：利用酶溶解细胞壁，使细胞壁受到部分 或完全破坏；
（2）常用的酶：溶菌酶、 β-1 ,3-葡聚糖酶、 β-1,6-葡聚糖酶、蛋白酶等。
其中溶菌酶主要用于细菌类，其他酶对酵母作用 较显著。
溶菌酶：能直接水解G+菌细胞壁，作用位 点是肽聚糖多肽链中的β-1，4糖甘键。
2、超临界CO2的破壁原理
CO2的临界值：31.26℃；7.38MPa 超临界CO2密度近于液体，粘度近于气体，扩 散系数为液体的100倍，因而具有惊人的溶解 能力。
超临界CO2易于渗透到细胞内，突然降压后， 因细胞内外较大的压差而使细胞急剧膨胀而 破裂。
超临界细胞破碎技术适用于各类细胞的破碎
机械法和非机械法破碎的比较
洋葱质壁分离
2、冷冻-融化法
（1）方法：将细胞放在低温下冷冻，然后在 室温中融化，反复多次而达到破壁作用。
（2）原理：一方面破坏细胞膜的通透性，另 一方面胞内水结晶，形成冰晶粒，细胞液浓度 增高引起细胞溶胀而破裂。
大肠杆菌：可用液氮/37℃反复冻融法破壁
适用于细胞壁较脆弱的菌体，需反复 多次，速率慢，产量低，在冻融过程 中可能引起某些蛋白质变性。
（三）化学法（化学渗透法）
1、碱处理 2、酸处理 3、化学试剂法
1、碱处理 pH值=11.5---12.5碱处理可导致细胞溶解。
优点：价格便宜，适于任何规模 的操作，易使蛋白使活。
2、酸热法
盐酸对细胞壁中的某些成分（主要是多糖和 蛋白质）的水解作用，使细胞壁结构变疏松， 同时经沸水浴处理，细胞吸水膨胀破裂。
（一）双水相分离技术 1、双水相体系简介
1896年，荷兰微生物学家Beijerinck发现
明胶
琼脂（或可溶性淀粉）
传统的双水相体系是指高聚物双水相体系
憎水程度有所差异
2、常用双水相体系 （1）聚乙二醇(PEG)/葡聚糖； （2）聚乙二醇(PEG)/盐相（硫酸盐或者磷酸盐）
聚乙二醇(PEG) 无毒、无刺激性，具有良好的水溶性
注意：破碎时要采取冷却措施
2、高压匀浆法
注意：团状或丝状真菌不适用
高压匀浆机
进料口
出料口
利用高压迫使悬浮液通过针形阀，由于突然减压 和高速冲撞造成细胞破裂
3、超声破碎法
原理：空化作用和搅拌作用
缺点：产生的热量不容易驱散，不适 于大规模操作，主要用于实验室。
不同机械破碎方法的比较
。
技术
原理
成本
举例
珠磨法 固体剪切作用 便宜 大规模处理
高压匀浆法 液体剪切作用 适中 大规模处理 超声波法 液体剪切作用 昂贵 小规模处理
（二）物理法 1、渗透压冲击法 2、冷冻-融化法
1、渗透压冲击法（最温和）
将细胞放在高渗溶液中（如高浓度蔗糖溶液），由 于渗透压的作用，细胞内水分便向外渗出，细胞发 生收缩，当达到平衡后，将细胞转入水或低渗缓冲 液中，由于渗透压的突然变化，胞外的水迅速渗入 胞内，引起细胞快速膨胀而破裂。 仅适用于细胞壁较脆弱的细胞。
G+菌的细胞壁
G-菌的细胞壁
2、自溶法
通过调节温度、pH等诱导细胞产生溶解自身的酶。
酵母
45-50℃ 12-24h
自溶
（五）超临界细胞破碎技术
1、超临界流体
（1）临界温度：在温度高于某一数值时，任何大的 压力均不能使该物质由气相转化为液相，此时的温 度即被称之为临界温度； （2）临界压力：临界温度下，气体能被液化的最低 压力称为临界压力。 （3）超临界流体：指温度和压力处于临界条件之上 的流体。
1、细胞的处理量 2、细胞壁的强度和结构 3、目标产物对破碎条件的敏感性 4、破碎程度
适宜的操作条件应有高的产物释放率，低 的能耗和便于后步提取这三方面进行权衡
作业与思考题
1、简要说明常用的细胞破碎方Fra Baidu bibliotek、原理及特点？
四、从发酵液直接分离产物
细胞破碎
目标产物
细胞碎片很小，很难用 过滤法除去。
细胞碎片去除和产品纯化同步的方法
缺点：破壁效果差，后续处理难除HCl。
3、化学试剂法 （1）EDTA螯合法：导致外层膜不稳定或溶解
革兰氏阳性菌 革兰氏阴性菌
革兰氏阴性菌的外层膜结构通常靠二价阳离子 Ca2+或Mg2+结合脂多糖和蛋白质来维持，一旦 EDTA将Ca2+或Mg2+ 螯合，大量的脂多糖分子将脱 落，使细胞壁外层膜出现洞穴。这些区域由内层 膜的磷脂来填补，从而导致内层膜通透性的增强。
比较项目
破碎机理 碎片大小 内含物释放
粘度 时间，效率
设备 通用性
经济 应用范围
机械法
切碎细胞 碎片细小
全部 高（核酸多） 时间短，效率高
需专用设备 强
成本低 工业规模，实验室
非机械法
溶解局部壁，膜 细胞碎片较大 部分 低（核酸少）
时间长，效率低 不需专用设备
差（专一性强） 成本高
实验室，部分工业
三、选择破碎方法的依据
（一）机械法 （二）物理法 （三）化学法 （四）生物法 （五）超临界细胞破碎技术
（一）机械法
利用高压、研磨或超声波等手段使细胞受到挤 压，剪切和撞击作用
1、珠磨法 2、高压匀浆法 3、超声破碎法
1、珠磨法
珠磨法原理：细胞悬浮液与极细的玻璃小 珠、石英砂、氧化铝等研磨剂（直径小于 1mm）一起快速搅拌或研磨，研磨剂与细 胞之间的互相剪切、碰撞，使细胞破碎， 释放出内含物。
3、双水相体系分离细胞碎片
优点：设备简单，容易放大
缺点：规模放大时，成本增加
目标产物
细胞或细胞碎片
用PEG1500/NaH2PO4体系从 Trichoderma koningii发酵液中分离纯化 β-木糖苷酶，该酶主要分配在下相，下 相酶活回收率96.3%，纯化倍数33。