第四章 细胞破碎和分离技术
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《生物分离工程》课程笔记
《生物分离工程》课程笔记第一章绪论一、生物分离工程的历史及应用1. 历史生物分离工程的历史可以追溯到古代酿酒和面包制作时期，但作为一个独立领域的发展始于20世纪。
早期的生物分离技术主要依靠自然现象，如沉淀、结晶等。
随着科技的发展，尤其是生物技术的崛起，生物分离工程逐渐形成一门独立的学科，并得到了迅速发展。
2. 应用生物分离技术在医药、食品、农业、环境保护等领域有广泛的应用。
例如，在疫苗生产中，需要从细胞培养液中分离出病毒或细菌；在抗生素提取中，需要从发酵液中提取抗生素；在蛋白质纯化中，需要从混合蛋白质中分离出目标蛋白质；在果汁澄清中，需要去除果汁中的悬浮固体等。
二、生物分离过程的特点1. 复杂性生物分离过程涉及生物大分子（如蛋白质、核酸、多糖等）的分离和纯化，这些生物大分子在结构和性质上具有很高的复杂性，因此生物分离过程也具有较高的复杂性。
2. 多样性生物分离过程中，针对不同的生物大分子和混合物，需要采用不同的分离方法和工艺，因此生物分离过程具有很高的多样性。
3. 灵敏度生物大分子在分离过程中容易受到外界因素的影响，如温度、pH值、离子强度等，因此生物分离过程需要严格控制条件，具有很高的灵敏度。
4. 易失活性生物大分子在分离过程中容易发生变性、降解等失活现象，因此生物分离过程需要尽量减少这些失活现象的发生。
5. 高价值生物大分子往往具有很高的经济价值，如药物、生物制品等，因此生物分离过程需要高效、高收率地分离目标物质，以满足市场需求。
第二章过滤一、过滤基本概念及预处理1. 过滤基本概念过滤是一种基于孔径大小实现固体与流体分离的技术。
在生物分离工程中，过滤技术被广泛应用于细胞培养液、发酵液、酶反应液等混合物的初步分离和纯化。
过滤过程中，混合物通过过滤介质（如滤纸、滤膜等），固体颗粒被拦截在过滤介质上，而流体则通过过滤介质流出，从而实现分离。
2. 预处理为了提高过滤效率，通常需要对混合物进行预处理。
细胞分离与破碎bei
适用于各种不同类型的细胞，尤其是对硬质 细胞壁的破碎具有较好的效果。
04
细胞分离与破碎技术的发展 趋势
细胞分离与破碎技术的联合应用
离心分离与超声破碎的联合
通过离心分离技术将细胞从混合物中分离出来，再结合超声破碎 技术对细胞进行破碎，提高细胞内物质的提取效率。
膜过滤与化学渗透的联合
利用膜过滤技术将细胞进行分离，再通过化学渗透技术对细胞进行 破碎，适用于处理大量细胞。
砂磨机
通过砂砾与细胞之间的摩 擦和挤压实现破碎，适用 于硬质细胞壁的破碎。
珠磨法
将细胞与玻璃珠或石英砂 混合，通过振动或搅拌使 细胞破碎，适用于软质细 胞壁的破碎。
化学破碎法
酸碱处理法
非离子表面活性剂处理法
利用酸或碱溶液处理细胞，使细胞壁 溶解，适用于对酸碱耐受性较好的细 胞。
利用非离子表面活性剂处理细胞，使 细胞膜溶解，适用于对非离子表面活 性剂耐受性较好的细胞。
详细描述
细胞吸附柱分离法是一种基于细胞表面特性的分离技术，利用特定的配体与细胞 表面受体结合，实现细胞的吸附和分离。这种方法具有高选择性、高纯度、低成 本等优点，适用于稀有细胞的分离和纯化，如干细胞、肿瘤细胞等。
03
细胞破碎技术
机械破碎法
01
02
03
高速组织捣碎机
利用高速旋转的刀片将细 胞破碎，适用于较大细胞 群体的破碎。
3
光热转换技术
利用光热转换效应对细胞进行加热，通过热刺激 使细胞破碎，具有非侵入性和环保性。
细胞分离与破碎技术在生物工程领域的应用前景
生物制药生产
通过细胞分离与破碎技术提取细胞内 的药物有效成分，提高药物产量和纯 度。
基因工程
利用细胞分离与破碎技术获取细胞内 的基因物质，进行基因克隆、基因表 达和基因编辑等研究。
04
细胞分离与破碎技术的发展 趋势
细胞分离与破碎技术的联合应用
离心分离与超声破碎的联合
通过离心分离技术将细胞从混合物中分离出来，再结合超声破碎 技术对细胞进行破碎，提高细胞内物质的提取效率。
膜过滤与化学渗透的联合
利用膜过滤技术将细胞进行分离，再通过化学渗透技术对细胞进行 破碎，适用于处理大量细胞。
砂磨机
通过砂砾与细胞之间的摩 擦和挤压实现破碎，适用 于硬质细胞壁的破碎。
珠磨法
将细胞与玻璃珠或石英砂 混合，通过振动或搅拌使 细胞破碎，适用于软质细 胞壁的破碎。
化学破碎法
酸碱处理法
非离子表面活性剂处理法
利用酸或碱溶液处理细胞，使细胞壁 溶解，适用于对酸碱耐受性较好的细 胞。
利用非离子表面活性剂处理细胞，使 细胞膜溶解，适用于对非离子表面活 性剂耐受性较好的细胞。
详细描述
细胞吸附柱分离法是一种基于细胞表面特性的分离技术，利用特定的配体与细胞 表面受体结合，实现细胞的吸附和分离。这种方法具有高选择性、高纯度、低成 本等优点，适用于稀有细胞的分离和纯化，如干细胞、肿瘤细胞等。
03
细胞破碎技术
机械破碎法
01
02
03
高速组织捣碎机
利用高速旋转的刀片将细 胞破碎，适用于较大细胞 群体的破碎。
3
光热转换技术
利用光热转换效应对细胞进行加热，通过热刺激 使细胞破碎，具有非侵入性和环保性。
细胞分离与破碎技术在生物工程领域的应用前景
生物制药生产
通过细胞分离与破碎技术提取细胞内 的药物有效成分，提高药物产量和纯 度。
基因工程
利用细胞分离与破碎技术获取细胞内 的基因物质，进行基因克隆、基因表 达和基因编辑等研究。
细胞破碎和生化分离技术-PPT
缺点: A、影响因素多,细胞种类、浓度和 处理时间、探头材料和形状; B、有效能量得利用率低; C、产热大,需控温; D、不易放大,仅应用于实验室规模 得细胞破碎。
机械破碎法总结
• 以上几种机械破碎法得作用机理不尽相同,有各自得适用范围 (包括菌体细胞、细胞发酵液得特性)和处理规模(实验室或工 业用)
碟片式离心机
• 就是在管式离心机得基础上发展起来得,在转鼓中加入了 许多重迭得碟片,缩短了颗粒得沉降距离,提高了分离效 率。
• 就是生物工业中应用最为广泛得一种离心机 • 有一个密封得转鼓,内装十至上百个锥顶角为60-100゜锥
形碟片。 • 碟片间得距离一般为0、5-2、5mm。
碟片式离心机工作原理
浓度。 • 微滤技术有着广泛应用和众多得优点。
微滤得操作模式
• 无流动操作模式和错流过滤操作模式
微滤设备
• 板框式膜过滤器 • 管式膜过滤器 • 中空纤维式膜分离器 • 螺旋卷式膜分离器
离心技术
• 一、离心分离得基本原理 • 二、离心机得类型 • 三、离心方法 • 四、离心条件得确定 • 五、影响离心效果得主要因素与控制
心机 • 据设备结构特点分:管式、蝶式、螺旋式……
离心机得种类与用途
按速度和离心力: 1、常速离心机 最大转速8000rpm(r/min),相对离心力(RCF)104g 以下,用于细胞、菌体和培养基残渣等分离; 2、高速(冷冻)离心机 1×104～2、5×104rpm,相对离心力104～ 105g,用于细胞碎片、较大细胞器、大分子沉淀物等分离; 3、超速离心机 转速2、5～8×104rpm,相对离心力5×105g;用于 DNA、RNA蛋白质、细胞器、病毒分离纯化;检测纯度;沉降系数 和相对分子量测定等。
机械破碎法总结
• 以上几种机械破碎法得作用机理不尽相同,有各自得适用范围 (包括菌体细胞、细胞发酵液得特性)和处理规模(实验室或工 业用)
碟片式离心机
• 就是在管式离心机得基础上发展起来得,在转鼓中加入了 许多重迭得碟片,缩短了颗粒得沉降距离,提高了分离效 率。
• 就是生物工业中应用最为广泛得一种离心机 • 有一个密封得转鼓,内装十至上百个锥顶角为60-100゜锥
形碟片。 • 碟片间得距离一般为0、5-2、5mm。
碟片式离心机工作原理
浓度。 • 微滤技术有着广泛应用和众多得优点。
微滤得操作模式
• 无流动操作模式和错流过滤操作模式
微滤设备
• 板框式膜过滤器 • 管式膜过滤器 • 中空纤维式膜分离器 • 螺旋卷式膜分离器
离心技术
• 一、离心分离得基本原理 • 二、离心机得类型 • 三、离心方法 • 四、离心条件得确定 • 五、影响离心效果得主要因素与控制
心机 • 据设备结构特点分:管式、蝶式、螺旋式……
离心机得种类与用途
按速度和离心力: 1、常速离心机 最大转速8000rpm(r/min),相对离心力(RCF)104g 以下,用于细胞、菌体和培养基残渣等分离; 2、高速(冷冻)离心机 1×104～2、5×104rpm,相对离心力104～ 105g,用于细胞碎片、较大细胞器、大分子沉淀物等分离; 3、超速离心机 转速2、5～8×104rpm,相对离心力5×105g;用于 DNA、RNA蛋白质、细胞器、病毒分离纯化;检测纯度;沉降系数 和相对分子量测定等。
微生物技术应用：第四章 微生物发酵产物的分离与纯化
三、分离纯化方法的综合运用与工艺优化
应作好工序间的衔接工作，从加工产物质量、 产物收率与纯度的平衡、时间与经济性等角度出 发，对影响工艺流程整体纯化效果的加工条件进 行优化：
1 收率与纯度之间的平衡 2 经济性考虑 3 工艺放大 4 纯化过程中对产品的检测
1 收率与纯度之间的平衡
发酵产品有效成分分离纯化过程中，产品的 纯度与产率之间是一对矛盾的关系。比如，微生 物发酵产物为药品时，其有效成分的纯度是衡量 其质量优劣的重要指标，特别是非肠道药物，其 纯度的高低直接关乎用药的安全性。纯化产品产 率的提高往往伴随着纯度的下降，反之对产品纯 度要求的提高意味着纯化成本的提高和产物收率 的降低。
微生物发酵产物的分离纯化
第二节 分离纯化技术
一、细胞破碎技术 二、沉淀分离纯化技术 三、离心分离纯化技术 四、膜分离纯化技术 五、层析分离纯化技术 六、萃取技术 七、冷冻干燥技术
第二节 分离纯化技术
一、细胞破碎技术
（一）发酵液的预处理和固液分离 目的：分离菌体和其他悬浮颗粒(细胞碎片、核 酸和蛋白质的沉淀物)；除去部分可溶性杂质和 改变滤液性质，以利于提取和精制的顺利进行。 方法：高价无机离子的去除方法，杂蛋白质的去 除，发酵液的凝聚和絮凝。
一、建立分离纯化工艺的根据
1.微生物发酵产物的特点
➢另一个特点是欲提取的生物物质通常很不 稳定，遇热、极端pH、有机溶剂会引起失 活或分解。
➢发酵或培养都是分批操作、生物变异性大， 各批发酵液不尽相同，要求下游加工有一 定的弹性。
一、建立分离纯化工艺的根据
2.原理
（1）物理性质 ① 力学性质：重力、离心力、筛分； ② 热力学性质：状态变化、相平衡； ③ 传质性质：粘度、扩散、热扩散； ④ 电磁性质：电泳、电渗析、磁化；
微生物细胞破碎
大家好
57
不同细胞可采用的化学渗透处理方式
细胞类型 变性剂 清洁剂 有机溶剂 酶 抗生素 生物试剂 螯合剂
革兰氏阴 *
可达较高破碎率，可大规模操作，不适合 丝状菌和含有包含体的基因工程菌
超声破碎法
液体剪切作用
对酵母菌效果较差，破碎过程升温剧烈， 不适合大规模操作
X-press法
固体剪切作用
破碎率高，活性保留率高，对冷冻敏感目 的产物不适合
非 酶溶法
酶分解作用
具有高度专一性，条件温和，浆液易分离，
机
溶酶价格高，通用性差
1.珠磨法（Bead mill）
原理：
进入珠磨机的细胞悬浮液与极细的玻璃小珠、石英砂、氧化 铝等研磨剂（直径小于1mm）一起快速搅拌或研磨，研磨 剂、珠子与细胞之间的互相剪切、碰撞，使细胞破碎，释放 出内含物。在珠液分离器的协助下，珠子被滞留在破碎室内， 浆液流出从而实现连续操作。破碎中产生的热量一般采用夹 套冷却的方式带走。
大家好
25
2.高压匀浆法（High-pressure homogenization）
——大规模细胞破碎的常用方法
采用高压匀浆器（由高压泵和匀浆阀组成，英国APV公司和美国 Microfluidics公司均有产品出售）。
原理：
利用高压使细胞悬浮液通过针形阀，由于突然减压和高速冲 击撞击环使细胞破碎，细胞悬浮液自高压室针形阀喷出时， 每秒速度高达几百米，高速喷出的浆液又射到静止的撞击环 上，被迫改变方向从出口管流出。细胞在这一系列高速运动 过程中经历了剪切、碰撞及由高压到常压的变化，从而造成 细胞破碎。
大家好
54
（1）表面活性剂
可促使细胞某些组分溶解，其增溶作用有助于细胞的破碎。
生物分离工程 第4章-细胞的破碎-
9
细胞壁的组成与结构
微生物 壁厚/nm 层次 主要组成 革兰氏阳性 细菌 20~80 单层 肽聚糖（40 ％～90％）、 多糖、胞壁 酸、蛋白质、 脂多糖（1 ％～4％） 革兰氏阴性 细菌 10~13 多层 酵母菌 100~300 多层 霉菌 100~250 多层
肽聚糖（5 葡聚糖（30 多聚糖（80 ％～10％） ％～40％） ％～90％） 脂类、蛋白质 脂蛋白、脂 甘露聚糖 多糖（11 （30％）、 ％～22％） 蛋白质（6 磷脂、蛋白 ％～8％）、 质 脂类（8.5 ％～13.5）
n
为了研究细胞的破碎，提高其破碎率，有必要了解各种微 生物细胞壁的组成和结构。
8
第一节 细胞壁的组成与结构
微生物细胞和植物细胞外层均为细胞壁，细胞 壁里面是细胞膜，动物细胞没有细胞壁，仅有 细胞膜。 通常细胞壁较坚韧，细胞膜脆弱，易受渗透压 冲击而破碎，因此细胞破碎的阻力主要来自于 细胞壁。 不同细胞壁的结构和组成不完全相同，故细胞 壁的机械强度不同，细胞破碎的难易程度也就 不同。
在细胞内沉积。 脂类物质和一些抗生素包含在生物体中。
对于胞内产物需要收集菌体或细胞进行破碎。
5
细胞破碎的必要性
表1 胞内酶举例
酶 L-天冬酰氨酶 过氧化氢酶 胆固醇氧化酶 β-半乳糖苷酶 葡萄糖氧化酶 葡萄糖-6-磷酸脱氢酶 来源 Eruinia Caratovora Escherichia Coli Aspergillus niger Nocardia hodochrous Kluyveromyces fragilis Saccharomyces lactis Aspergillus niger Penicilluim notatum Yeast 应用范围 治疗急性淋巴癌 牛奶灭菌后H2O2的清除 胆固醇浆液分析 在牛奶/乳清中乳糖的水解 作用 葡萄糖浆液分析 食品中氧的清除 临床分析
细胞壁的组成与结构
微生物 壁厚/nm 层次 主要组成 革兰氏阳性 细菌 20~80 单层 肽聚糖（40 ％～90％）、 多糖、胞壁 酸、蛋白质、 脂多糖（1 ％～4％） 革兰氏阴性 细菌 10~13 多层 酵母菌 100~300 多层 霉菌 100~250 多层
肽聚糖（5 葡聚糖（30 多聚糖（80 ％～10％） ％～40％） ％～90％） 脂类、蛋白质 脂蛋白、脂 甘露聚糖 多糖（11 （30％）、 ％～22％） 蛋白质（6 磷脂、蛋白 ％～8％）、 质 脂类（8.5 ％～13.5）
n
为了研究细胞的破碎，提高其破碎率，有必要了解各种微 生物细胞壁的组成和结构。
8
第一节 细胞壁的组成与结构
微生物细胞和植物细胞外层均为细胞壁，细胞 壁里面是细胞膜，动物细胞没有细胞壁，仅有 细胞膜。 通常细胞壁较坚韧，细胞膜脆弱，易受渗透压 冲击而破碎，因此细胞破碎的阻力主要来自于 细胞壁。 不同细胞壁的结构和组成不完全相同，故细胞 壁的机械强度不同，细胞破碎的难易程度也就 不同。
在细胞内沉积。 脂类物质和一些抗生素包含在生物体中。
对于胞内产物需要收集菌体或细胞进行破碎。
5
细胞破碎的必要性
表1 胞内酶举例
酶 L-天冬酰氨酶 过氧化氢酶 胆固醇氧化酶 β-半乳糖苷酶 葡萄糖氧化酶 葡萄糖-6-磷酸脱氢酶 来源 Eruinia Caratovora Escherichia Coli Aspergillus niger Nocardia hodochrous Kluyveromyces fragilis Saccharomyces lactis Aspergillus niger Penicilluim notatum Yeast 应用范围 治疗急性淋巴癌 牛奶灭菌后H2O2的清除 胆固醇浆液分析 在牛奶/乳清中乳糖的水解 作用 葡萄糖浆液分析 食品中氧的清除 临床分析
第4章 微生物细胞破碎
2.植物细胞壁的化学组成和结构 植物细胞壁的化学组成和结构
成熟的植物细胞壁分为初生壁和次生壁， 成熟的植物细胞壁分为初生壁和次生壁，次 生壁是在初生壁上增厚的部分，次生壁形成时， 生壁是在初生壁上增厚的部分，次生壁形成时， 细胞不再增大。 细胞不再增大。 初生壁与次生壁的主要化学成分均为纤维素。 初生壁与次生壁的主要化学成分均为纤维素。 纤维素分子又可进一步组装成微纤丝， 纤维素分子又可进一步组装成微纤丝，微纤丝 再交织成网状，就构成细胞壁的基本骨架。 再交织成网状，就构成细胞壁的基本骨架。
（3）超声波破碎法 ）
影响超声波破碎的因素主要有超声波的声 强、频率、破碎时间、介质的离子强度、 频率、破碎时间、介质的离子强度、 pH、菌体的浓度和种类。 、菌体的浓度和种类。 一般杆菌比球菌易破碎， 细菌比G 一般杆菌比球菌易破碎，G-细菌比 +细菌 易破碎，对酵母菌的效果较差。 易破碎，对酵母菌的效果较差。超声破碎时 细胞浓度一般在20％左右。 细胞浓度一般在 ％左右。
按细胞所受作用） 第二节 常用破碎方法（按细胞所受作用）
分 类 作用机理 适应性 可达较高破碎率，可大规模操作， 可达较高破碎率，可大规模操作，不适 合丝状菌和革兰氏阳性菌 可达较高破碎率，可较大规模操作， 可达较高破碎率，可较大规模操作，大 分子目的产物易失活， 分子目的产物易失活，浆液分离困难 对酵母菌效果较差，破碎过程升温剧烈， 对酵母菌效果较差，破碎过程升温剧烈， 不适合大规模操作 破碎率较低， 破碎率较低，常与其他方法结合使用 破碎率较低， 破碎率较低，不适合对冷冻敏感目的产 物 条件变化剧烈， 条件变化剧烈，易引起大分子物质失活 破碎率高，活性保留率高， 破碎率高，活性保留率高，对冷冻敏感 目的产物不适合 具有高度专一性，条件温和， 具有高度专一性，条件温和，浆液易分 溶酶价格高， 离，溶酶价格高，通用性差 具一定选择性，浆液易分离， 具一定选择性，浆液易分离，但释放率 较低， 较低，通用性差 高压匀浆法 液体剪切作用 珠磨法 固体剪切作用
生物分离课后习题
第一章绪论1、何谓生物分离技术？2、生物分离技术特点的特点是什么？3、生物分离技术可分为几大部分，分别包括哪些单元操作？4、在设计下游分离过程前，必须考虑哪些问题方能确保我们所设计的工艺过程最为经济、可靠？5、简述生物分离工程的发展动向。
第二章细胞分离与破碎1、何谓过滤、沉降；沉降与离心的异同？2、简述过滤的基本形式。
3、凝聚和絮凝的区别有哪些？4、简述过滤、离心设备的分类及其特点。
5、简述细胞破碎的意义。
6、常用细胞破碎方法有哪些？第三章萃取1、液－液萃取的分类？2、何谓萃取的分配系数？其影响因素有哪些？3、什么是乳化现象，其产生原因是什么；如何消除乳化现象？4、何谓超临界流体萃取？其特点有哪些？5、何谓双水相萃取?常见的双水相构成体系有哪些？其成相机理如何？6、反胶团的构成以及反胶团萃取的基本原理第四章膜分离1、什么是膜？2、简述膜分离技术的分类3、基本的膜材料有哪些？4、常用的膜组件有哪些？5、何谓反渗透？实现反渗透分离的条件是什么？6、电渗析的工作原理？第五章吸附与离子交换1、什么是吸附过程？吸附的类型有哪些？它们是如何划分的？2、什么是吸附等温线？其意义何在？影响吸附过程的因素有哪些？3、什么是亲和吸附？其特点有哪些？4、什么是离子交换？离子交换的机理是什么？5、什么是离子交换树脂的交换容量，如何测定？6、基本的离子交换操作是怎样的？7、什么是离子交换的选择性？其选择性受哪些因素影响？第六章结晶1、结晶操作的原理是什么？2、饱和溶液和过饱和溶液的概念3、结晶的一般步骤是什么？4、过饱和溶液形成的方法有哪些？5、绘制饱和温度曲线和过饱和温度曲线，并标明稳定区、亚稳定区和不稳定区。
6、常用的工业起晶方法有哪些？7、重结晶的概念第七章干燥1、干燥的概念2、干燥的基本流程3、物料中所含水分的种类有哪些？平衡水分和自由水分的概念4、了解干燥曲线，并结合干燥速率曲线说明恒速干燥阶段和降速干燥阶段的特点5、干燥设备选型的原则是什么？6、常用的干燥设备有哪些？其特点是什么？友情提示：部分文档来自网络整理，供您参考！文档可复制、编制，期待您的好评与关注！。
第四章 细胞破碎和分离提取技术 PPT课件
eg.动物细胞和革兰氏阴性菌。 • 细胞于高渗介质中？脱水达到平衡后，迅速将其转置于低
渗透压的水或缓冲液中，水进入细胞使胞壁和胞膜破裂
• 2）冻结－融化法（Freezing and Thawing） • 细胞急剧冻结后在室温缓慢融化，反复操作多次使细胞破
坏，对于存在于细胞质周围靠近细胞膜的胞内产物释放较 为有效
• 原理：干扰素能刺激某些指示细胞(如人羊膜上皮细胞 Wish株、人喉癌细胞株Hep-2等)产生抗病毒蛋白，从而使 细胞免受水疱性口炎病毒(VSV)的攻击，根据待测样品不 同稀释度的保护能力，计算出干扰素生物学活性单位。
• 材料： VSV、Wish细胞、MTT、二甲亚砜(DMSO)、10 ％FCS RPMI1640、培养板、培养瓶、CO2孵箱、超净台、 酶标检测仪。
or molarity of the buffer due to common ion effects
方案2
• Choose the buffer（with a pKa as close as possible to the desired pH） • Indentify whether the buffer is made from an acid or a base（buf
珠磨法、压榨法 高压匀浆、超声破碎、撞击法
非机械法
干燥处理 溶胞作用
1）酶溶法 2）化学法 3）物理法
超临界细胞破碎
1、机械方法破碎
• 1）珠磨法（bead milling） ：细胞悬浮液与极小的研磨剂如玻 璃小珠、石英砂等一起高速搅拌，细胞与研磨剂之间相互 碰撞、剪切，使细胞达到某种程度破碎，释放内含物
• Before the protein can be isolated, it is necessary to conceive of(确定) an activity and to devise（设计） an appropriate assay.
渗透压的水或缓冲液中，水进入细胞使胞壁和胞膜破裂
• 2）冻结－融化法（Freezing and Thawing） • 细胞急剧冻结后在室温缓慢融化，反复操作多次使细胞破
坏，对于存在于细胞质周围靠近细胞膜的胞内产物释放较 为有效
• 原理：干扰素能刺激某些指示细胞(如人羊膜上皮细胞 Wish株、人喉癌细胞株Hep-2等)产生抗病毒蛋白，从而使 细胞免受水疱性口炎病毒(VSV)的攻击，根据待测样品不 同稀释度的保护能力，计算出干扰素生物学活性单位。
• 材料： VSV、Wish细胞、MTT、二甲亚砜(DMSO)、10 ％FCS RPMI1640、培养板、培养瓶、CO2孵箱、超净台、 酶标检测仪。
or molarity of the buffer due to common ion effects
方案2
• Choose the buffer（with a pKa as close as possible to the desired pH） • Indentify whether the buffer is made from an acid or a base（buf
珠磨法、压榨法 高压匀浆、超声破碎、撞击法
非机械法
干燥处理 溶胞作用
1）酶溶法 2）化学法 3）物理法
超临界细胞破碎
1、机械方法破碎
• 1）珠磨法（bead milling） ：细胞悬浮液与极小的研磨剂如玻 璃小珠、石英砂等一起高速搅拌，细胞与研磨剂之间相互 碰撞、剪切，使细胞达到某种程度破碎，释放内含物
• Before the protein can be isolated, it is necessary to conceive of(确定) an activity and to devise（设计） an appropriate assay.
细胞的破碎与分离课件
2)目的产物测定法 蛋白质量或酶的活力
• 细胞破碎后，测定悬浮液中细胞内含 物的增量来估算破碎率。 • 通常将破碎后的细胞悬浮液离心，测 定上清液中蛋白质的含量或酶的活力 ，并与 100% 破碎所获得的标准值直接 比较。
3)导电率测定法
• 细胞破碎后，大量带电荷的内含物被释放 到水相，使导电率上升。
大多数情况下，抗生素，胞外酶，一些多糖 ，及氨基酸等目标产物存在于发酵液中。 有些目标产物存在于生物体中。
尤其是由基因工程菌产生的大多数蛋白质
是在细胞内沉积。
脂类物质和一些抗生素包含在生物体中。
1 概述
• 胞外产品：各种胞外酶、胞外多糖、细胞代 谢物如氨基酸、抗生素 • 细胞本身： 单细胞蛋白 如面包酵母 • 胞内产品： 各种胞内酶、基因工程产物
不同机械破碎方法的比较
技术 原理 效果 成本 适中 举例 细胞悬浮液大规模 处理 细胞悬浮液和植物 细胞的大规模处理 细胞悬浮液小规模 处理 匀 浆 法 ( 须 使 细 胞 通 过 的 小 剧烈 孔型) 孔，使细胞受到剪 切力而破碎 珠 磨 破 细 胞 被 玻 璃 珠 或 铁 剧烈 碎法 珠捣碎 超 声 波 用 超 声 波 的 空 穴 作 适中 法 用使细胞破碎
1）-3 X－挤压器法 X-press法
• 改进的高压方法：将浓缩的菌体悬浮液冷却至 25℃形成冰晶体，利用500MPa以上的高压冲击， 使冷冻细胞从高压阀小孔中挤出。 • 细胞破碎是由于冰晶体的磨损，使包埋在冰中的 微生物变形而引起的。
• 此法主要用于实验室，适应范围广、破碎率高、 细胞碎片粉碎程度低及活性保留率高等优点，但 不适应于对冷冻敏感的生化物质。
JY92-II D超声波 细胞粉碎机
超声波法Ultrasonication
生物分离工程第四章细胞破碎课件ppt
通过破碎细胞，可以释放 细胞内的蛋白质，便于后 续的提取和纯化。
药物生产
在制药工业中，细胞破碎 技术可用于生产各种药物， 如抗生素、疫苗等。
基因工程
细胞破碎是基因工程中的 重要步骤，通过破碎细胞， 可以分离出基因表达产物。
在食品工业领域的应用
பைடு நூலகம்食品添加剂
利用细胞破碎技术，可以 从天然原料中提取出食品 添加剂，如植物色素、天 然香料等。
低温破碎法
总结词
利用低温下细胞膜的通透性增加和脆性增加而破碎
详细描述
低温破碎法是在低温下进行细胞破碎的方法。在低温下，细胞膜的通透性增加， 脆性也增加，因此容易受到外力的破碎。该方法对细胞内物质损伤较小，但需要 控制好温度和时间，以避免对细胞内物质造成不良影响。
03
非机械法细胞破碎
渗透压冲击法
压差循环破碎法
总结词
利用压力差使细胞通过狭窄通道时受到 挤压而破碎
VS
详细描述
压差循环破碎法是利用压力差使细胞通过 狭窄的通道或阀门时受到挤压而破碎。在 高压下，细胞受到较大的流体剪切力和挤 压力，导致细胞壁破裂。该方法破碎效率 较高，适用于大规模生产，但对细胞内物 质损伤较大，且需要针对不同细胞类型选 择合适的压力和循环速度。
化学法
总结词
利用化学试剂与细胞膜发生反应的方法
详细描述
通过使用某些化学试剂，如酸、碱、有机溶剂等，与细胞膜 发生反应，破坏细胞膜的结构和功能，从而使细胞内容物释 放。化学法具有操作简便、适用范围广等优点，但可能会对 细胞造成一定的损伤。
04
细胞破碎的应用
在生物制药领域的应用
01
02
03
蛋白质提取
与纳米技术的结合
药物生产
在制药工业中，细胞破碎 技术可用于生产各种药物， 如抗生素、疫苗等。
基因工程
细胞破碎是基因工程中的 重要步骤，通过破碎细胞， 可以分离出基因表达产物。
在食品工业领域的应用
பைடு நூலகம்食品添加剂
利用细胞破碎技术，可以 从天然原料中提取出食品 添加剂，如植物色素、天 然香料等。
低温破碎法
总结词
利用低温下细胞膜的通透性增加和脆性增加而破碎
详细描述
低温破碎法是在低温下进行细胞破碎的方法。在低温下，细胞膜的通透性增加， 脆性也增加，因此容易受到外力的破碎。该方法对细胞内物质损伤较小，但需要 控制好温度和时间，以避免对细胞内物质造成不良影响。
03
非机械法细胞破碎
渗透压冲击法
压差循环破碎法
总结词
利用压力差使细胞通过狭窄通道时受到 挤压而破碎
VS
详细描述
压差循环破碎法是利用压力差使细胞通过 狭窄的通道或阀门时受到挤压而破碎。在 高压下，细胞受到较大的流体剪切力和挤 压力，导致细胞壁破裂。该方法破碎效率 较高，适用于大规模生产，但对细胞内物 质损伤较大，且需要针对不同细胞类型选 择合适的压力和循环速度。
化学法
总结词
利用化学试剂与细胞膜发生反应的方法
详细描述
通过使用某些化学试剂，如酸、碱、有机溶剂等，与细胞膜 发生反应，破坏细胞膜的结构和功能，从而使细胞内容物释 放。化学法具有操作简便、适用范围广等优点，但可能会对 细胞造成一定的损伤。
04
细胞破碎的应用
在生物制药领域的应用
01
02
03
蛋白质提取
与纳米技术的结合
4第四章 细胞破碎、过滤离心与膜分离设备
26
管式膜分离器
管式膜分离器的结构类似管壳式换热器，如图所示。其
结构主要是把膜和多孔支撑体均制成管状，使两者装在一起，
管状膜可以在管内侧，也可以在管外侧。加压的料液从管内 流过，透过膜的渗透液在管外被收集。对外压式膜组件膜则
被浇注在多孔支撑管外侧面。加压的料液从管外侧流过，渗
透液则由管外侧渗透通过膜进入多孔支撑管内。无论是内压 式还是外压式，都可以根据需要设计成串联或并联装置。
板框式过滤机是由许多块滤板和滤框交替排列而 成。一端固定另一端可以让板框移动。板和框之间隔 有滤布，用压紧装置自活动端方向压紧或拉开。滤板 和滤框多做成正方形，数目从10-60不等，每机的滤 板和滤框数目，由生产能力和等组成。
滤板：凹凸不平的表面，凸部用来支撑滤布，凹槽是滤
动盘
料浆槽 搅拌器
金属网； 滤布； 滤浆槽。
定盘
转筒真空过滤机结构示意图
12
第三节 离心分离设备
实现离心分离操作的机械称为离心机或离心分离设备。 它是通过高速回转部件产生的离心力实现悬浮液、乳浊液 的分离和固相浓缩、液相澄清的分离机械。 按离心分离过程的进行方式分为：间歇式和连续式。 按操作性质分为：过滤式和沉降式离心机。 按结构分为上悬式、三足式、碟片式和管式离心机。
27
中空纤维式膜分离器
中空纤维式膜分离器的结构类似管壳式换热器。中空纤 维式膜分离器的组装是把大量（有时是几十万或更多）的中
空纤维膜装入圆筒耐压容器内。通常纤维束的一端封住，另
一端固定在用环氧树脂浇铸的管板上。使用时加压的料液由 膜件的一端进入壳侧，在向另一端流动的同时，渗透组分经
纤维管壁进入管内通道，经管板放出，截流物在容器的另一
9
真空过滤设备
第四章 细胞破碎和分离技术
（2）有机溶剂法
有机溶剂能溶解细胞壁的脂类，从而改变细 胞通透性。
（3）表面活性物质
能溶解膜结构中的脂蛋白，使细胞通透性增加。
化学法的优缺点 优点 细胞外形保持完整，碎片少，浆液粘度低，
易于固液分离和进一步提取。
①通用性差； 缺点 ②时间长，效率低，一般胞内物质释放率 不超过 80％。 ③有些化学试剂有毒，后续工作需设法分 离除去。
纳豆激酶
1980年，日本心脑血管专家须见洋行博士， 从事溶解血栓药物研究工作
“下午两点半”实验 下午两点半：纳豆提取物加入到人工 血栓中；
下午五点半：血栓溶解2厘米
纳豆的制作
1、泡豆蒸豆
大豆，加水浸泡一夜后，蒸烂。
2、接种纳豆菌
纳豆菌用热水溶解后，加入到大豆中，搅拌均匀，分装。
3、在恒温下发酵14-36小时 4、后熟（活菌低温休眠）
洋葱质壁分离
2、冷冻-融化法
（1）方法：将细胞放在低温下冷冻，然后在 室温中融化，反复多次而达到破壁作用。 （2）原理：一方面破坏细胞膜的通透性，另 一方面胞内水结晶，形成冰晶粒，细胞液浓度 增高引起细胞溶胀而破裂。
大肠杆菌：可用液氮/37℃反复冻融法破壁
适用于细胞壁较脆弱的菌体，需反复 多次，速率慢，产量低，在冻融过程 中可能引起某些蛋白质变性。
（二）膨胀床分离技术
1、膨胀床的定义
（1）固定床：又称填充床，填充的固体物通常呈 颗粒状，堆积成一定高度的床层。床层静止不动， 流体通过床层进行分离纯化。 （2）流化床：当流体通过床层的速度逐渐提高到 某值时，填料颗粒出现松动，颗粒间空隙增大，床 层体积出现膨胀，但是颗粒仍逗留在床层内而不被 流体带出。床层的这种状态和液体相似称为流化床
（5）柱床的再生和清洗
第四章细胞破碎和分离技术
如Streamline介质：在石英砂外表面包裹了一层琼脂
糖
琼脂糖上的功能基团可以被修饰， 提高目标产物的吸附容量
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4、膨胀床的操作(cāozuò)（5个 步骤）
（1）平衡(pínghéng)：用平衡(pínghéng)缓冲液让膨 胀床达到平衡(pínghéng)，保持一定的膨胀率。
膨胀2倍，吸附性能最好
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（二）膨胀(péng zhàng)床 分离技术 1、膨胀(péng zhàng)床的定义 （1）固定床：又称填充床，填充的固体物通常呈 颗粒状，堆积成一定高度的床层。床层静止不动，
流体通过床层进行分离纯化。
（2）流化床：当流体通过床层的速度逐渐提高到某值时， 填料颗粒出现松动，颗粒间空隙增大，床层体积出现膨
超临界细胞破碎技术适用于各类细胞的破碎
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机械法和非机械法破碎的比较
比较项目
破碎机理 碎片大小 内含物释放
粘度 时间，效率
设备 通用性
经济 应用范围
机械法
切碎细胞 碎片细小
全部 高（核酸多） 时间短，效率高
需专用设备 强
成本低 工业规模，实验室
非机械法
溶解局部壁，膜 细胞碎片较大 部分 低（核酸少）
明胶
琼脂（或可溶性淀粉）
传统的双水相体系是指高聚物双水相体系
憎水程度有所差异
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2、常用(chánɡ yònɡ) 双水相体系 （1）聚乙二醇(PEG)/葡聚糖； （2）聚乙二醇(PEG)/盐相（硫酸盐或者(huòzhě)磷 酸盐）
聚乙二醇(PEG) 无毒、无刺激性，具有良好的水溶性
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其中溶菌酶主要用于细菌类，其他酶对酵母作用 较显著。
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糖
琼脂糖上的功能基团可以被修饰， 提高目标产物的吸附容量
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4、膨胀床的操作(cāozuò)（5个 步骤）
（1）平衡(pínghéng)：用平衡(pínghéng)缓冲液让膨 胀床达到平衡(pínghéng)，保持一定的膨胀率。
膨胀2倍，吸附性能最好
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（二）膨胀(péng zhàng)床 分离技术 1、膨胀(péng zhàng)床的定义 （1）固定床：又称填充床，填充的固体物通常呈 颗粒状，堆积成一定高度的床层。床层静止不动，
流体通过床层进行分离纯化。
（2）流化床：当流体通过床层的速度逐渐提高到某值时， 填料颗粒出现松动，颗粒间空隙增大，床层体积出现膨
超临界细胞破碎技术适用于各类细胞的破碎
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机械法和非机械法破碎的比较
比较项目
破碎机理 碎片大小 内含物释放
粘度 时间，效率
设备 通用性
经济 应用范围
机械法
切碎细胞 碎片细小
全部 高（核酸多） 时间短，效率高
需专用设备 强
成本低 工业规模，实验室
非机械法
溶解局部壁，膜 细胞碎片较大 部分 低（核酸少）
明胶
琼脂（或可溶性淀粉）
传统的双水相体系是指高聚物双水相体系
憎水程度有所差异
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2、常用(chánɡ yònɡ) 双水相体系 （1）聚乙二醇(PEG)/葡聚糖； （2）聚乙二醇(PEG)/盐相（硫酸盐或者(huòzhě)磷 酸盐）
聚乙二醇(PEG) 无毒、无刺激性，具有良好的水溶性
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其中溶菌酶主要用于细菌类，其他酶对酵母作用 较显著。
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《细胞破碎分离》ppt课件
4. 微生物不同细胞壁的组成和构造
微生 物
革兰氏 阳性细菌
革兰氏 阴性细菌
酵母菌
真霉菌
壁厚 2200--8800 nnmm
1100--1133 nnmm
110000--330000nnmm 1001-0205-0nm
层次
单层
多层
多层
25多0层nm
层 主次要 肽聚糖单(4层0-90%) 肽聚糖多(层5-10%) 葡聚糖多(层30-40%) 多聚多糖层
• 通常细胞壁较坚韧，细胞膜脆弱，易受浸透压冲击而破碎，因此细 胞破碎的阻力主要来自于细胞壁。
• 不同细胞壁的构造和组成不完全一样，故细胞壁的机械强度不同， 细胞破碎的难易程度也就不同。
1. 细菌细胞壁构造
组成成分： 肽聚糖〔peptidoglycan〕:主要成分组，它是难溶性的聚
糖链；相邻聚糖链上的短肽又交叉相联，构成了细胞壁 的三维网状构造，包围在细胞周围； 氨基酸：D,L-丙氨酸；D-谷氨酸；L-赖氨酸 磷壁酸：醛糖磷酸酯的聚合物；仅在革兰氏阳性菌中存在； 糖：葡萄糖，半乳糖，甘露糖等 脂质：不多，仅在于革兰氏阴性菌中 破碎细菌的主要阻力：是来自于肽聚糖的网状构造。
溶菌酶〔lysozyme)能专注性地分解细胞壁上肽聚糖分子 的β-1,4糖苷键，因此主要用于细菌类细胞壁的裂解。
革兰氏阳性菌悬浮液中参与溶菌酶，很快就产生溶壁景 象。
放线菌的细胞壁构造类似于革兰氏阳性菌，以肽聚糖为 主要成分，所以也能采用溶菌酶，
酵母和真菌由于细胞壁的组分主要是纤维素、葡聚糖、 几丁质等，常用蜗牛酶、纤维素酶、多糖酶等。
植物细胞壁的主要成分是纤维素，常采用纤维素酶和半 纤维素酶裂解。
有时采用几种酶的混合物会产生更好的效果，参与 时需确定相应的次序。
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（一）双水相分离技术 1、双水相体系简介
1896年，荷兰微生物学家Beijerinck发现
明胶
琼脂（或可溶性淀粉）
传统的双水相体系是指高聚物双水相体系
憎水程度有所差异
2、常用双水相体系 （1）聚乙二醇(PEG)/葡聚糖； （2）聚乙二醇(PEG)/盐相（硫酸盐或者磷酸盐）
聚乙二醇(PEG) 无毒、无刺激性，具有良好的水溶性
洋葱质壁分离
2、冷冻-融化法
（1）方法：将细胞放在低温下冷冻，然后在 室温中融化，反复多次而达到破壁作用。
（2）原理：一方面破坏细胞膜的通透性，另 一方面胞内水结晶，形成冰晶粒，细胞液浓度 增高引起细胞溶胀而破裂。
大肠杆菌：可用液氮/37℃反复冻融法破壁
适用于细胞壁较脆弱的菌体，需反复 多次，速率慢，产量低，在冻融过程 中可能引起某些蛋白质变性。
举例
珠磨法 固体剪切作用 便宜 大规模处理
高压匀浆法 液体剪切作用 适中 大规模处理 超声波法 液体剪切作用 昂贵 小规模处理
（二）物理法 1、渗透压冲击法 2、冷冻-融化法
1、渗透压冲击法（最温和）
将细胞放在高渗溶液中（如高浓度蔗糖溶液），由 于渗透压的作用，细胞内水分便向外渗出，细胞发 生收缩，当达到平衡后，将细胞转入水或低渗缓冲 液中，由于渗透压的突然变化，胞外的水迅速渗入 胞内，引起细胞快速膨胀而破裂。 仅适用 2、酸处理 3、化学试剂法
1、碱处理 pH值=11.5---12.5碱处理可导致细胞溶解。
优点：价格便宜，适于任何规模 的操作，易使蛋白使活。
2、酸热法
盐酸对细胞壁中的某些成分（主要是多糖和 蛋白质）的水解作用，使细胞壁结构变疏松， 同时经沸水浴处理，细胞吸水膨胀破裂。
缺点：破壁效果差，后续处理难除HCl。
3、化学试剂法 （1）EDTA螯合法：导致外层膜不稳定或溶解
革兰氏阳性菌 革兰氏阴性菌
革兰氏阴性菌的外层膜结构通常靠二价阳离子 Ca2+或Mg2+结合脂多糖和蛋白质来维持，一旦 EDTA将Ca2+或Mg2+ 螯合，大量的脂多糖分子将脱 落，使细胞壁外层膜出现洞穴。这些区域由内层 膜的磷脂来填补，从而导致内层膜通透性的增强。
3、双水相体系分离细胞碎片
优点：设备简单，容易放大
缺点：规模放大时，成本增加
目标产物
细胞或细胞碎片
用PEG1500/NaH2PO4体系从 Trichoderma koningii发酵液中分离纯化 β-木糖苷酶，该酶主要分配在下相，下 相酶活回收率96.3%，纯化倍数33。
第四章 细胞破碎和分离提 取技术
发酵液或培养液 预处理
固液分离（离心或过滤）
固体沉淀：胞内产物
清液：胞外产物
细胞破碎和细胞碎片分离
目标产物
本章内容
目标产物
一、细胞破碎的主要阻力：细胞壁
细胞破碎的主要目的：破坏细胞壁和细胞膜， 使细胞内物质释放出来。
各种微生物细胞壁组成与结构
二、常用细胞破碎技术及原理
比较项目
破碎机理 碎片大小 内含物释放
粘度 时间，效率
设备 通用性
经济 应用范围
机械法
切碎细胞 碎片细小
全部 高（核酸多） 时间短，效率高
需专用设备 强
成本低 工业规模，实验室
非机械法
溶解局部壁，膜 细胞碎片较大 部分 低（核酸少）
时间长，效率低 不需专用设备
差（专一性强） 成本高
实验室，部分工业
三、选择破碎方法的依据
2、超临界CO2的破壁原理
CO2的临界值：31.26℃；7.38MPa 超临界CO2密度近于液体，粘度近于气体，扩 散系数为液体的100倍，因而具有惊人的溶解 能力。
超临界CO2易于渗透到细胞内，突然降压后， 因细胞内外较大的压差而使细胞急剧膨胀而 破裂。
超临界细胞破碎技术适用于各类细胞的破碎
机械法和非机械法破碎的比较
1、细胞的处理量 2、细胞壁的强度和结构 3、目标产物对破碎条件的敏感性 4、破碎程度
适宜的操作条件应有高的产物释放率，低 的能耗和便于后步提取这三方面进行权衡
作业与思考题
1、简要说明常用的细胞破碎方法、原理及特点？
四、从发酵液直接分离产物
细胞破碎
目标产物
细胞碎片很小，很难用 过滤法除去。
细胞碎片去除和产品纯化同步的方法
（四）生物法
1、酶溶法
（1）原理：利用酶溶解细胞壁，使细胞壁受到部分 或完全破坏；
（2）常用的酶：溶菌酶、 β-1 ,3-葡聚糖酶、 β-1,6-葡聚糖酶、蛋白酶等。
其中溶菌酶主要用于细菌类，其他酶对酵母作用 较显著。
溶菌酶：能直接水解G+菌细胞壁，作用位 点是肽聚糖多肽链中的β-1，4糖甘键。
（一）机械法 （二）物理法 （三）化学法 （四）生物法 （五）超临界细胞破碎技术
（一）机械法
利用高压、研磨或超声波等手段使细胞受到挤 压，剪切和撞击作用
1、珠磨法 2、高压匀浆法 3、超声破碎法
1、珠磨法
珠磨法原理：细胞悬浮液与极细的玻璃小 珠、石英砂、氧化铝等研磨剂（直径小于 1mm）一起快速搅拌或研磨，研磨剂与细 胞之间的互相剪切、碰撞，使细胞破碎， 释放出内含物。
（2）有机溶剂法
有机溶剂能溶解细胞壁的脂类，从而改变细 胞通透性。
（3）表面活性物质
能溶解膜结构中的脂蛋白，使细胞通透性增加。
化学法的优缺点 优点 细胞外形保持完整，碎片少，浆液粘度低，
易于固液分离和进一步提取。
①通用性差；
缺点 ②时间长，效率低，一般胞内物质释放率
不超过 80％。 ③有些化学试剂有毒，后续工作需设法分 离除去。
注意：破碎时要采取冷却措施
2、高压匀浆法
注意：团状或丝状真菌不适用
高压匀浆机
进料口
出料口
利用高压迫使悬浮液通过针形阀，由于突然减压 和高速冲撞造成细胞破裂
3、超声破碎法
原理：空化作用和搅拌作用
缺点：产生的热量不容易驱散，不适 于大规模操作，主要用于实验室。
不同机械破碎方法的比较
。
技术
原理
成本
G+菌的细胞壁
G-菌的细胞壁
2、自溶法
通过调节温度、pH等诱导细胞产生溶解自身的酶。
酵母
45-50℃ 12-24h
自溶
（五）超临界细胞破碎技术
1、超临界流体
（1）临界温度：在温度高于某一数值时，任何大的 压力均不能使该物质由气相转化为液相，此时的温 度即被称之为临界温度； （2）临界压力：临界温度下，气体能被液化的最低 压力称为临界压力。 （3）超临界流体：指温度和压力处于临界条件之上 的流体。