血栓调节蛋白在糖尿病大鼠心肌中的表达及意义

血栓调节蛋白在糖尿病大鼠心肌中的表达及意义

张

雷

董志恒

1

（北华大学基础医学院细胞生物教研室，吉林吉林132013）

〔摘要〕目的

探讨STZ 诱导的糖尿病大鼠心肌组织中血栓调节蛋白（TM ）的表达及意义，为糖尿病心肌病（DCM ）的防治提供新的靶向。

方法

从50只SD 大鼠中随机选取32只采用一次性腹腔注射链脲佐菌素（STZ ）制备糖尿病大鼠模型，剩余18只作为正常对照。每日观察大鼠进

食、饮水等一般状况，每周固定时间测量体重、血糖及尿糖。分别在2、8、12w 末分批处死一定数量两组大鼠。分别检测各批大鼠的心脏指数（HW /BW ）、血糖、血脂；采用透射电镜观察心肌组织超微结构的改变；免疫组化方法观察心肌组织中TM 的蛋白表达；通过RT-PCR 检测TM mRNA 的表达水平。结果

与正常对照组相比，2w 末模型组心脏指数无明显差异；8、12w 末心脏指数均显著增加，且12w 高于8w （P ＜0.01）。模型组各时间段

各项生化指标均高于正常对照组（P ＜0.01），各项指标变化由低到高排列顺序为2、8、12w 末。2w 末模型组大鼠未见明显病理变化；8、12w 末模型组大鼠出现心肌细胞肥大、排列紊乱、细胞外间质增多，线粒体肿胀、嵴断裂、溶解等病理变化；12w 末模型组大鼠上述病理变化较8w 末模型组更加明显。免疫组化显示，模型组TM 表达明显高于正常对照组（P ＜0.01）；组间比较阳性表达由低到高顺序依次是2、8、12w 末。与正常对照组相比，模型组大鼠心肌组织中TM mRNA 的表达明显增高（P ＜0.01），其中，12w 末表达最强，其次是8，

2w 末表达最弱。结论TM 在糖尿病大鼠心肌组

织中呈时间依赖性高表达，并与病程呈正相关，显示其可能在DCM 的发生、发展中发挥重要作用，这为该病的防治提供了新的靶向。

〔关键词〕糖尿病；心肌；血栓调节蛋白〔中图分类号〕R285.5

〔文献标识码〕A

〔文章编号〕1005-9202（2012）15-3229-04；doi ：10.3969/j.issn.1005-9202.2012.15.044

基金项目：吉林省科技厅资助（吉科合字〔2007〕第自52号）；北华大学

校管课题资助

1

病理教研室

通讯作者：董志恒（1968-），男，医学博士，教授，硕士生导师，主要从事

糖尿病慢性并发症研究。

第一作者：张

雷（1971-），女，实验师，主要从事糖尿病慢性并发症研究。

糖尿病（DM ）的慢性并发症累及全身各个系统，其中糖尿病性心肌病（DCM ）危害最大。研究显示，长期的高血糖可引起各种组织蛋白非糖氧化，脂质堆积产生的大量中间产物和自由基诱发各级血管内皮损伤

〔1〕

。糖基化终末产物的形成促使多

种细胞因子与生长因子的释放与表达，增加血管内皮细胞通透性及单核细胞趋化性，加重了管壁炎症反应和血管增生，引发了微循环障碍和心肌纤维细胞的增殖

〔2〕

。因此对于血管内皮

细胞损伤及内皮细胞释放的细胞因子的研究将为DCM 的发病机制及防治提供可靠的理论依据，其意义重大。血栓调节蛋白（TM ）是存在于内皮细胞表面的一类糖蛋白，对血管内凝血的调节起重要作用。在各种引起血管内皮损伤的病理情况下，由

损伤的血管内皮细胞释放TM ，因此TM 被认为是血管内皮细胞损伤的一个分子标志物

〔3〕

。国外有研究〔4〕

提出血糖水平的

波动与血管内皮损伤显著相关，同时研究表明2型DM 患者

TM 水平显著升高，TM 的水平与病情呈正相关〔5〕

。国内学者研

究发现

〔6〕

，TM 在DM 出现并发症时显著升高，随病情进展，血

管内皮损伤的加重，TM 大量释放入血，而凝血功能严重障碍加重了DM 并发症。虽然目前TM 在DCM 时的作用尚不清楚。基于以上所述，本实验以TM 为研究指标，通过观察TM 在DM 大鼠心肌组织中的表达，初步探讨其在DCM 发生、发展过程中的可能作用，为进一步阐明DCM 发病机制提供理论依据和防治的新靶标。1材料与方法1.1

实验动物

选用普通级、健康SD 雄性大鼠50只，

6周龄，体重（220ʃ20）g ，由吉林大学动物实验中心提供。大鼠精神状态良好，

反应灵敏，皮毛光泽，饮食正常。大鼠在通风及光线良好、环境卫生、温湿度适宜的饲养环境下适应性喂养1w 后，进入实验。实验期间动物饲料为鼠用常规饲料

。

1.2方法

1.2.1试剂与仪器链脲佐菌素（STZ）为美国Sigma公司产品。乐康全血糖检测仪及试纸条为德国罗氏诊断公司生产。血糖高灵敏度试剂盒采用长春汇力生物工程技术开发中心生产的试剂盒。Whatman PCR扩增仪为德国产品。引物序列由上海生工生物工程有限公司合成。免疫试剂盒为北京中杉生物技术公司提供。逆转录酶试剂盒由Invitrogen公司生产。DNA Marker（DL-2000）由Takara公司提供。

1.2.2模型的制备与分组50只健康SD雄性大鼠适应性喂养1w后随机分为正常对照组（C组）及糖尿病组（DM组），其中C组18只，DM组32只。DM组大鼠禁食12h后，按55mg/kg一次性腹腔注射STZ溶液（临用前用0.1mol/L、pH4.2枸橼酸缓冲液溶解），C组腹腔注射等量0.1mol/L枸橼酸缓冲液。72h后测定空腹血糖及尿糖定性，空腹血糖≥16.7mmol/L，尿糖定性≥ ，动物多饮、多食、多尿者确定为DM模型。造模完成后，除去造模失败及死亡大鼠共20只造模成功大鼠完成实验。分别于2、8、12w末将大鼠分批处死：2w 末（模型组7只、正常组6只）；8w末（模型组7只、正常组6只）；12w末（模型组6只、正常组6只）。每日观察大鼠进食、饮水、毛色等一般情况，每周固定时间测量体重、血糖、尿糖。1.2.3标本采集及制备

1.2.3.1光镜标本分别在2、8、12w末进行标本收集。在标本收集前两组大鼠禁食、禁水12h，处死前称体重。所有大鼠乙醚麻醉处死，眶后静脉采血后，开胸取心脏，用生理盐水清洗吸干称重后，将留取的光镜标本立即置入10%中性甲醛液固定48h，常规制备石蜡切片。连续4μm切片，进行HE、PAS及免疫组化染色。

1.2.3.2电镜标本将留取的小块心肌在0.2mol/L二甲砷酸钠缓冲液（pH7.4，含2.5%戊二醛）中细切，4%戊二醛前固定，1%锇酸后固定1h，包埋、聚合后制备成超薄切片，电子染色，透射电镜观察心肌超微结构，摄片。

1.2.4血糖及血脂测定采用葡萄糖氧化酶法测定血糖；采用日立7150型自动生化分析仪测定血清总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白（HDL）和低密度脂蛋白（LDL）含量。

1.2.5心脏指数将两组大鼠心脏称重。计算公式如下：心脏指数=心脏重量/体重。

1.2.6TM mRNA测定取速冻大鼠心肌组织约100mg，按Trizol试剂说明书方法提取心肌组织总RNA。取其中1μg，进行RT-PCR反应。TM引物序列分别为：上游5'-CGGCTTC-CAGTGGGTTAC-3'；下游5'-TTCCCGAGTCCAGTGTCT-3'，扩增产物片段长度为401bp。同时扩增β-actin，其引物序列分别为：上游5'-ACAACCGTCATCGCCCACAT-3'；下游5'-ACTTC-CCTGACCTTGCTAGT-3'，扩增产物片段长度为540bp。PCR变性、退火和延伸温度分别为94ħ、55ħ和72ħ，反应时间分别为45、45和60s，共进行30个循环。循环完毕再72ħ延伸10min。PCR产物用2%琼脂凝胶电泳分析，电泳后在紫外灯下拍摄照片，然后用凝胶成像处理系统对每一标本的PCR产物扩增的特异性片段进行灰度扫描，以β-actin密度作为参考定量标准，数值以两者之积分吸光度的比值表示，以对照组的比值作为标准1.0。

1.3统计学处理数据用xʃs表示，采用SPSS1

2.0软件进行方差分析。

2结果

2.1一般状态及心脏指数

2.1.1大鼠一般情况观察正常对照组大鼠精神状况良好，毛色白、有光泽，反应灵敏、动作自如，饮食水正常，实验期间未有死亡。模型组大鼠逐渐出现精神萎靡，多饮、多食、多尿等典型糖尿病症状。前期（2w）模型组与正常组相比饮水量并无明显变化，后期（8、12w）模型组每只大鼠每天饮水量多于120ml，每天需换垫料一两次。模型组早期多动，后期反应迟钝，动作迟缓，弓背曲体，毛竖无光泽，部分出现烂尾、烂趾、白内障等症状。整个实验过程中3只大鼠造模失败被淘汰，9只模型组大鼠（1w3只，4w1只，11w2只，12w3只）死亡。2.1.2大鼠心脏指数变化与相应C组相比，2w末DM组大鼠心脏指数无统计学差异（P＞0.05）；8、12w末DM组大鼠心脏指数明显增加（P＜0.01）。与2w末DM组大鼠比较，8、12w末DM组大鼠心脏指数差异显著（P＜0.01）。12w末与8w末DM 组相比，心脏指数显著增加（P＜0.01）。上述结果提示，8、12w 末DM组大鼠已经出现心肌纤维化，心肌肥厚，见表1。

表1各时段各组大鼠心重、体重、心脏指数比较（xʃs）

组别n心重（g）体重（g）心脏指数

C26 1.21ʃ0.02224.22ʃ3.03 2.74ʃ0.03

C86 1.36ʃ0.03243.13ʃ2.46 2.73ʃ0.02

C126 1.52ʃ0.02266.31ʃ3.14 2.75ʃ0.03

DM27 1.21ʃ0.02228.06ʃ6.01 2.74ʃ0.03

DM87 1.06ʃ0.031）2）184.80ʃ4.741）2） 3.80ʃ0.451）2）DM1260.79ʃ0.031）2）3）164.00ʃ1.671）2）3） 4.22ʃ0.271）2）3）

与相应C组比较：1）P＜0.01；与2w末DM组比较：2）P＜0.01；与8w末DM组比较：3）P＜0.01

2.2大鼠生化指标的变化与C组比较，DM组血糖、血清TC、TG、LDL均显著升高，而HDL降低（P＜0.01），提示DM组大鼠伴有明显的糖、脂代谢紊乱，见表2。

2.3形态学观察

2.3.1HE染色显示正常对照组大鼠心肌细胞排列整齐，横纹清晰，细胞核呈椭圆形，大小均一，位于中央，胞浆染色均匀，闰盘未见异常。2w末模型组未见明显病理改变。8、12w末模型组心肌细胞肥大、排列紊乱，胞浆疏松化，细胞核大小不甚规则，细胞外间质增多。8w末较12w末病理变化略轻。

2.3.2电镜下正常对照组大鼠心肌细胞排列整齐，细胞连接清晰，肌丝排列规整，明暗带清晰；细胞核呈卵圆形，核仁清晰可见；线粒体结构清晰，异染色质成簇状聚集，细胞间质可见少量胶原纤维。2w末模型组未见明显病理变化。8、12w末模型组心肌细胞排列紊乱，肌丝溶解、断裂、稀疏，线粒体肿胀、变形，嵴排列紊乱，部分线粒体破裂，肌浆网扩张，闰盘扭曲模糊

·

0323

·中国老年学杂志2012年8月第32卷