牙鲆单倍体_三倍体_雌核发育二倍体和普通二倍体胚胎发育的比较

第23卷第3期大连水产学院学报Vol.23No.3 2008年6月JOURNAL OF DAL I A N F I SHER I ES UN I V ERSI TY Jun.2008

文章编号:1000-9957(2008)03-0161-07牙鲆单倍体、三倍体、雌核发育二倍体

和普通二倍体胚胎发育的比较

刘海金1,　王常安2、3,　朱晓琛2、3,　刘永新4,

　张晓彦4,　侯吉伦4,　唐　楠4

(1.中国水产科学研究院,北京100039; 2.大连水产学院生命科学与技术学院,辽宁大连116023;3.中国水产科学研究院

黑龙江水产研究所,黑龙江哈尔滨150070; 4.东北农业大学动物科学与技术学院,黑龙江哈尔滨150030)

摘要:在水温为(1610±015)℃、pH为810～813、盐度为3012的条件下,对牙鲆Paralichthys olivaceus单

倍体、三倍体和雌核发育二倍体胚胎发育的过程与普通二倍体牙鲆的发育进行了比较。结果表明:单倍体

胚胎脊柱弯曲,器官分化不全,受精率低,畸形率高,出膜率低;三倍体和雌核发育二倍体胚胎与普通二

倍体牙鲆的发育时序基本相同,受精卵经过卵裂、囊胚、原肠胚、神经胚、卵黄栓胚、克氏囊胚、尾芽

胚、心跳胚、出膜期等阶段孵化出膜,各阶段除发育时间不同外,发育特征与发育分期没有明显差别;普

通二倍体胚胎约61h孵化出膜,而三倍体和雌核发育二倍体分别经66h30m in和67h50m in孵化出膜,

孵化时间比普通二倍体牙鲆长约10%。其中,卵裂期三倍体和雌核发育二倍体在细胞分裂阶段发育特别缓

慢,发育时间比普通二倍体长约25%。单倍体出膜率为(1615±212)%,畸形率为(9712±116)%;雌核

发育二倍体出膜率为(8516±310)%,畸形率为(1312±213)%;三倍体出膜率为(8213±311)%,畸形

率为(1613±215)%。与普通二倍体牙鲆相比,三倍体和雌核发育二倍体胚胎出膜率低,仔鱼畸形率高。

关键词:牙鲆;单倍体;三倍体;雌核发育;二倍体;胚胎发育

中图分类号:Q13214 文献标志码:A

牙鲆Paralichthys olivaceus为冷温性底层海水鱼类,主要分布于俄罗斯远东地区、日本、朝鲜半岛和中国海域。牙鲆生长快、个体大,且肉嫩、味美、营养价值高,很受消费者青睐,已成为海水养殖的主要对象。牙鲆的养殖开始于20世纪60年代[1],在解决了从孵化到变态的培育技术后,日本开展了规模化育苗和放流增殖[2-3]。20世纪90年代,国内牙鲆的人工育苗和养殖技术逐渐成熟,现已取得了巨大的经济效益[4]。

关于牙鲆的胚胎发育,据安永义畅[5]报道,牙鲆卵的直径约019mm,有1个油球,围卵腔较窄;在水温10～20℃,盐度26～50下可以正常发育,最适水温为15℃,盐度为34;10℃水温下孵化时间约165h,20℃时约33h。田永胜等[6]的观察结果表明,牙鲆在14～16℃下发育93h出膜。张榭令等[7]报道,牙鲆在水温1416～1515℃下,胚胎发育经63h30m in进入孵化期。关于牙鲆胚胎发育的时序关系还缺乏精确的定量研究。

牙鲆雌性个体比雄性大,为了发挥雌性生长快的优势,作者在进行人工诱导牙鲆雌核发育研究的同时,对单倍体、三倍体和雌核发育二倍体的胚胎发育进行了观察,并与普通二倍体牙鲆的发育过程作了比较,以期为牙鲆遗传育种提供基础资料,亦为牙鲆苗种培育提供科学依据。

1　材料和方法

111　材料和试验条件

试验分别于2005年5月和2006年5月在中国水产科学研究院北戴河中心实验站进行。试验亲鱼为该站人工养殖的牙鲆,真鲷Pagroso m us m ajor为福建网箱养殖的商品鱼经人工养殖成为亲鱼。雌性牙鲆亲鱼体重约2500g,雄性牙鲆亲鱼体重约1000g,雄性真鲷体重约1200g。牙鲆产卵水温

　收稿日期:2007-09-25

　基金项目:科技支撑计划项目(2006BAD01A1207);农业科技跨越计划项目(2006跨18);农业成果转化资金项目(2006G B23260365)　作者简介:刘海金(1951-),男,研究员。E-mail:liuhaijin2005@1261com

约15℃,真鲷养殖水温约18℃。在牙鲆产卵期进行人工挤卵,干法授精,孵化水温为(16±015)℃,pH为810～813,盐度为3012。在Motic BA300显微镜下观察并连续拍摄胚胎发育情况。

112　牙鲆试验胚胎的获得

精子紫外线灭活方法及冷休克方法参照山本荣一[8]的方法进行,即精子经稀释后在紫外线灯(东芝15W,2支)下照射60s,灯管距精子液面约30c m。普通二倍体胚胎,是用牙鲆精子与卵子人工干法授精获得,作为对照组;单倍体胚胎,是由紫外线照射后的真鲷精子激活牙鲆卵子而获得;三倍体胚胎,是用正常牙鲆精子与卵子受精经冷休克而获得;雌核发育二倍体胚胎,是用紫外线照射后的真鲷精子激活牙鲆卵子,经冷休克处理而获得。

113　牙鲆胚胎发育观察

胚胎获得后分别置入1000L玻璃钢水族箱(直径90c m,水深45c m)中孵化。每个试验组设3个重复,每个重复均取50个卵进行胚胎发育观察,当其中80%发育至某期的时间即作为该期的胚胎发育时间。

114　牙鲆胚胎倍性鉴定

各试验组胚胎孵化出膜后,分别取样10尾,置于体积分数为70%的乙醇中保存,用流式细胞仪(Beckman Coulter,US A)测定每尾细胞DNA的相对含量,以确定胚胎染色体的倍性。

115　统计分析

统计各组的受精率、出膜率和初孵仔鱼畸形率时,每个重复取300个受精卵,盛放受精卵的烧杯(1L)置于恒温培养箱中保持温度。受精率为原肠期的正常胚胎数与受精总卵数之比;出膜率为孵化个体数与原肠期正常胚胎数之比;畸形率为畸形个体数与孵化个体数之比。本研究中以统计软件SPSS1310进行单因素方差分析,用Duncan法进行多重比较。

2　结果

211　诱导鱼的染色体倍性

对普通二倍体的仔鱼以及诱导的单倍体、三倍体和雌核发育二倍体的仔鱼,用流式细胞仪测定其DNA相对含量,单倍体率、雌核发育二倍体率和三倍体率均在85%以上(结果另文发表)。

212　普通二倍体、单倍体、三倍体和雌核发育二倍体牙鲆的胚胎发育过程

普通二倍体、单倍体、三倍体和雌核发育牙鲆的胚胎发育时序见表1,其具体过程如下。

21211　卵裂期　牙鲆受精卵(图1-A)直径为(0192±0102)mm(n=30)。各试验组受精卵在受精后30m in形成胚盘(图1-B),并开始均等分裂,经过2细胞、4细胞、8细胞、l6细胞、32细胞、64细胞期,然后进入多细胞期(图1-C～I),细胞数量继续增加,呈桑椹状(图1-J)。该阶段各试验组发育形态相似,但发育速度明显不同,经冷休克处理的三倍体和雌核发育二倍体组发育缓慢。各组发育速度依次为单倍体>普通二倍体>三倍体>雌核发育二倍体。

21212　囊胚期　牙鲆受精卵胚盘的细胞分裂在层次上有所增加,胚盘明显突出于卵黄上,可以见到模糊的细胞界限;囊胚隆起明显,进入高囊胚腔时期(图1-K)。囊胚细胞继续分裂、扩展,囊胚层变低,进入低囊胚期(图1-L);胚盘继续分裂的结果使得胚盘铺展呈帽状盖在卵黄上。胚胎表面由于分裂球很小而显得平滑,细胞界限不够清楚。进入低囊胚期以后,单倍体受精卵发育速度开始变缓,三倍体和雌核发育二倍体发育仍旧缓慢,但3组与普通二倍体相比,形态上差别不大,但发育时间差异均显著(P<0105)。各组发育速度依次为单倍体>普通二倍体>三倍体>雌核发育二倍体。21213　原肠期(图1-M～T)　原肠初期,细胞向胚盘边缘流动,在胚盘四周边缘的细胞越堆越多,形成外包;胚盘外包1/2时,开始内卷,在胚胎边缘出现一圈比较透明的胚环。胚环继续加宽,逐渐隆起形成胚盾。到原肠中期,胚盘包被整个胚胎近3/5。隆起的胚盾继续发育至胚盘下包整个胚胎2/3以上时出现胚体,但雏形比较模糊。此阶段,普通二倍体、三倍体和雌核发育二倍体胚胎在形态上没有显著区别,而单倍体的胚环比较单薄,形状很不规则,胚环上凹凸不平。单倍体胚胎出现胚体雏形时,胚体比较模糊。各组发育速度依次为普通二倍体>单倍体>三倍体>雌核发育二倍体。21214　神经胚期(图1-U、V)　胚盘继续外包及胚体不断伸展,胚盾变细而长,形成了较清晰的胚体雏形。头突出现,胚盘几乎包被整个胚胎。随着发育,头的两侧突出一对视囊(眼芽)。此时,体

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