保护碱基添加总结

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保护碱基

GGCGCGCC AGGCGCGCCT TTGGCGCGCCAA
Ava I
CCCCGGGG CCCCCGGGGG TCCCCCGGGGGA
BamH I
CGGATCCG CGGGATCCCG CGCGGATCCGCG
Bgl II
CAGATCTG GAAGATCTTC GGAAGATCTTCC
BssH II
GGCGCGCC AGGCGCGCCT TTGGCGCGCCAA
BstE II BstX I
GGGT(A/T)ACCC AACTGCAGAACCAATGCATTGG AAAACTGCAGCCAATGCATTGGAA CTGCAGAACCAATGCATTGGATGCAT
Cla I
CATCGATG GATCGATC CCATCGATGG CCCATCGATGGG
GGGTACCC GGGGTACCCC CGGGGTACCCCG
Mlu I Nco I Nde I
GACGCGTC CGACGCGTCG CCCATGGG CATGCCATGGCATG CCATATGG CCCATATGGG CGCCATATGGCG GGGTTTCATATGAAACCC GGAATTCCATATGGAATTCC GGGAATTCCATATGGAATTCCC
Sca I Sma I
GAGTACTC AAAAGTACTTTT CCCGGG CCCCGGGG CCCCCGGGGG TCCCCCGGGGGA
10 75 0 0 10 >90 10 10 0 0 0 0 10 >90 >90 >90 0 >90 75 75 0 10
25 75 10 10 50 >90 >90 >90 50 50 0 25 50 >90 >90 >90 0 >90 >90 >90 0 25

引物设计保护碱基列表上课讲义

引物设计保护碱基列
表
在分子克隆实验中，有时我们会在待扩增的目的基因片段两端加上特定的酶切位点，用于后续的酶切和连接反应。

由于直接暴露在末端的酶切位点不容易直接被限制性核酸内切酶切开，因此在设计PCR引物时，人为的在酶切位点序列的5‘端外侧添加额外的碱基序列，即保护碱基，用来提高将来酶切时的活性。

添加保护碱基，需要考虑两个因素：一是碱基数目，一是碱基种类。

添加保护碱基时，最关心的应该是保护碱基的数目，而不是种类。

什么样的酶切位点，添加几个保护碱基，是有数据可以参考的，见附表。

添加什么保护碱基，如果严格点，是根据两条引物的Tm值和各引物的碱基分布及GC含量。

如果某条引物Tm值偏小，GC%较低，添加时多加G或C，反之亦反。

保护碱基列表。

保护碱基列表概要

11月13日引物合成的详解1.引物是如何合成的？目前引物合成基本采用固相亚磷酰胺三酯法。

DNA合成仪有很多种，主要都是由ABI/PE公司生产，无论采用什么机器合成，合成的原理都相同，主要差别在于合成产率的高低，试剂消耗量的不同和单个循环用时的多少。

亚磷酰胺三酯法合成DNA片段，具有高效、快速的偶联以及起始反应物比较稳定的特点。

亚磷酰胺三酯法是将DNA固定在固相载体上完成DNA链的合成的，合成的方向是由待合成引物的3’端向5’端合成的，相邻的核苷酸通过3’一5’磷酸二酯键连接。

第一步是将预先连接在固相载体 CPGt的活性基团被保护的核苷酸与三氯乙酸反应，脱去其5’ -羟基的保护基团DMT获得游离的5’ -羟基。

第二步，合成DNA的原料，亚磷酰胺保护核苷酸单体，与活化剂四氮唑混合，得到核苷亚磷酸活化中间体，它的3’端被活化，5’ -羟基仍然被DMT保护，与溶液中游离的5’ -羟基发生缩合反应。

第三步，带帽（capping）反应，缩合反应中可能有极少数 5’ -羟基没有参加反应（少于2%）,用乙酸酐和1-甲基咪唑终止其后继续发生反应，这种短片段可以在纯化时分离掉。

第四步，在氧化剂碘的作用下，亚磷酰形式转变为更稳定的磷酸三酯。

经过以上四个步骤，一个脱氧核苷酸被连接到固相载体的核苷酸上。

再以三氯乙酸脱去它的5’ -羟基上的保护基团DMT重复以上步骤，直到所有要求合成的碱基被接上去。

合成过程中可以观察TCA处理阶段的颜色判定合成效率。

通过氨水高温处理，连接在CPGL的引物被切下来，通过 OPC,PAGE? 手段纯化引物，成品引物用 C18浓缩,脱盐，沉淀。

沉淀后的引物用水悬浮，测定OD260定量，根据定单要求分装。

2.引物纯化方式有哪些，如何选择？♦C18柱脱盐：有人称其为简易反相柱，它对DNA有特异性的吸附，可以被有机溶解洗脱，但不会被水洗脱，所以能有效地去除盐分。

它不能有效去除比目的片段短的小片段。

实际上，它是一种脱盐的作用。

保护碱基

保护碱基New England Biolabs Technical Literature - UpdatedCleavage Close to the End of DNA Fragments (oligonucleotides)To test the varying requirements restriction endonucleases have for the number of bases flanking their recognition sequences, a series of short, double-stranded oligonucleotides that contain the restriction endonuclease recognition sites (shown in red) were digested. This information may be helpful when choosing the order of addition of two restriction endonucleases for a double digest (a particular concern when cleaving sites close together in a polylinker), or when selecting enzymes most likely to cleave at the end of a DNA fragment. The experiment was performed as follows: 0.1 A260 unit of oligonucleotide was phosphorylated using T4 polynucleotide kinase and g-[32P] ATP. 1 µg of 5´ [32P]-labeled oligonucleotide was incubated at 20°C with 20 units of restriction endonuclease in a buffer containing 70 mM Tris-HCl (pH 7.6), 10 mM MgCl2, 5 mM DTT and NaCl or KCl depending on the salt requirement of each particular restriction endonuclease. Aliquots were taken at 2 hours and 20 hours and analyzed by 20% PAGE (7 M urea). Percent cleavage was determined by visual estimate of autoradiographs. As a control, self-ligated oligonucleotides were cleaved efficiently. Decreased cleavage efficiency for some of the longer palindromic oligonucleotides may be caused by the formation of hairpin loops. | A | B | C | E | H | K | M | N | P | S | X | Enzyme Oligo Sequence Chain Length % Cleavage2 hr 20 hrAcc I GGTCGACC CGGTCGACCG CCGGTCGACCGG 8 10 12 0 0 0 0 0 0Afl III CACATGTG CCACATGTGG CCCACATGTGGG 8 10 12 0 >90 >90 0 >90 >90Asc I GGCGCGCC AGGCGCGCCT TTGGCGCGCCAA 8 10 12 >90 >90 >90 >90 >90 >90 Ava I CCCCGGGG CCCCCGGGGG TCCCCCGGGGGA 8 10 12 50 >90 >90 >90 >90 >90 BamH I CGGATCCG CGGGATCCCG CGCGGATCCGCG 8 10 12 10 >90 >90 25 >90 >90Bgl II CAGATCTG GAAGATCTTC GGAAGATCTTCC 8 10 12 0 75 25 0 >90 >90BssH II GGCGCGCC AGGCGCGCCT TTGGCGCGCCAA 8 10 12 0 0 50 0 0 >90BstE II GGGT(A/T)ACCC 9 0 10BstX I AACTGCAGAACCAATGCATTGG AAAACTGCAGCCAATGCATTGGAA CTGCAGAACCAATGCATTGGATGCAT 22 24 27 0 25 25 0 50 >90Cla I CATCGATG GATCGATC CCATCGATGG CCCATCGATGGG 8 8 10 12 0 0 >90 50 0 0 >90 50EcoR I GGAATTCC CGGAATTCCG CCGGAATTCCGG 8 10 12 >90 >90 >90 >90 >90 >90 Hae III GGGGCCCC AGCGGCCGCT TTGCGGCCGCAA 8 10 12 >90 >90 >90 >90 >90 >90 Hind III CAAGCTTG CCAAGCTTGG CCCAAGCTTGGG 8 10 12 0 0 10 0 0 75Kpn I GGGTACCC GGGGTACCCC CGGGGTACCCCG 8 10 12 0 >90 >90 0 >90 >90Mlu I GACGCGTC CGACGCGTCG 8 10 0 25 0 50Nco I CCCATGGG CATGCCATGGCATG 8 14 0 50 0 75Nde I CCATATGG CCCATATGGG CGCCATATGGCG GGGTTTCATATGAAACCC GGAATTCCATATGGAATTCC GGGAATTCCATATGGAATTCCC 8 10 12 18 20 22 0 0 0 0 75 75 0 0 0 0 >90 >90Nhe I GGCTAGCC CGGCTAGCCG CTAGCTAGCTAG 8 10 12 0 10 10 0 25 50Not I TTGCGGCCGCAA ATTTGCGGCCGCTTTA AAATATGCGGCCGCTATAAAATAAGAATGCGGCCGCTAAACTAT AAGGAAAAAAGCGGCCGCAAAAGGAAAA 12 16 20 24 28 0 10 10 25 25 0 10 10 90 >90Nsi I TGCATGCATGCA CCAATGCATTGGTTCTGCAGTT 12 22 10 >90 >90 >90Pac I TTAATTAA GTTAATTAAC CCTTAATTAAGG 8 10 12 0 0 0 0 25 >90Pme I GTTTAAAC GGTTTAAACC GGGTTTAAACCC AGCTTTGTTTAAACGGCGCGCCGG 8 10 12 24 0 0 0 75 0 25 50 >90Pst I GCTGCAGC TGCACTGCAGTGCA AACTGCAGAACCAATGCATTGG AAAACTGCAGCCAATGCATTGGAA CTGCAGAACCAATGCATTGGATGCAT 8 14 22 24 26 0 10 >90 >90 0 0 10 >90 >90 0Pvu I CCGATCGG ATCGATCGAT TCGCGATCGCGA 8 10 12 0 10 0 0 25 10Sac I CGAGCTCG 8 10 10Sac II GCCGCGGC TCCCCGCGGGGA 8 12 0 50 0 >90Sal I GTCGACGTCAAAAGGCCATAGCGGCCGC GCGTCGACGTCTTGGCCATAGCGGCCGCGG ACGCGTCGACGTCGGCCATAGCGGCCGCGGAA 28 30 32 0 10 10 0 50 75Sca I GAGTACTC AAAAGTACTTTT 8 12 10 75 25 75Sma I CCCGGG CCCCGGGG CCCCCGGGGG TCCCCCGGGGGA 6 8 10 12 0 0 10 >90 10 10 50 >90Spe I GACTAGTC GGACTAGTCC CGGACTAGTCCG CTAGACTAGTCTAG 8 10 12 14 100 0 >90 >90 50 50Sph I GGCATGCC CATGCATGCATG ACATGCATGCATGT 8 12 14 0 0 10 0 25 50Stu I AAGGCCTT GAAGGCCTTC AAAAGGCCTTTT 8 10 12 >90 >90 >90 >90 >90 >90 Xba I CTCTAGAG GCTCTAGAGC TGCTCTAGAGCA CTAGTCTAGACTAG 8 10 12 14 0 >90 75 75 0 >90 >90 >90Xho I CCTCGAGG CCCTCGAGGG CCGCTCGAGCGG 8 10 12 0 10 10 0 25 75Xma I CCCCGGGG CCCCCGGGGG CCCCCCGGGGGG TCCCCCCGGGGGGA 8 10 12 14 0 25 50 >90 0 75 >90 >90NEB Home Site Map Email info@ Request Info。

保护碱基

保护碱基
限制性内切酶识别特定的DNA序列，除此之外，酶蛋白还要占据识别位点两边的若干个碱基，这些碱基对内切酶稳定的结合到DNA双链并发挥切割DNA作用是有很大影响的，被称为保护碱基。

在分子克隆实验中，有时我们会在待扩增的目的基因片段两端加上特定的酶切位点，用于后续的酶切和连接反应。

其次，在分子克隆实验中选择载体的酶切位点时，相临的两个酶切位点往往不能同时使用，因为一个位点切割后留下的碱基过少以至于影响旁边的酶切位点切割。

添加原则
1、添加保护碱基，需要考虑两个因素：一是碱基数目，一是碱基种类。

2、添加保护碱基时，最关心的应该是保护碱基的数目，而不是种类。

什么样的酶切位点，
添加几个保护碱基，是有数据可以参考的，见附表。

3、添加什么保护碱基，如果严格点，是根据两条引物的Tm值和各引物的碱基分布及GC
含量。

如果某条引物Tm值偏小，GC%较低，添加时多加G或C，反之亦反。

附表一、靠近PCR片段末端识别位点的酶切效率（Fermentas）
当识别位点靠近DNA分子末端时，有些限制酶的酶切效率非常低。

表列出了Fermentas 公司限制酶的识别位点靠近PCR片段末端不同碱基数的切割效率。

（酶切时间为16小时）
2、保护碱基列表（BioLabs）。

保护碱基添加原则

0
0
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Nhe I
GGCTAGCC CGGCTAGCCG CTAGCTAGCTAG
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Not I
TTGCGGCCGCAA
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ATTTGCGGCCGCTTTA
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AAATATGCGGCCGCTATAAA
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ATAAGAATGCGGCCGCTAAACTAT
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Mlu I
GACGCGTC CGACGCGTCG
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50
Nco I
CCCATGGG CATGCCATGGCATG
0
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Nde I
CCATATGG CCCATATGGG CGCCATATGGCG GGGTTTCATATGAAACCC GGAATTCCATATGGAATTCC GGGAATTCCATATGGAATTCCC
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AAGGAAAAAAGCGGCCGCAAAAGGAAAA
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Nsi I
TGCATGCATGCA CCAATGCATTGGTTCTGCAGTT
10
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Pac I
TTAATTAA GTTAATTAAC CCTTAATTAAGG
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Pme I

保护碱基

首先要明确什么是保护碱基限制性内切酶识别特定的DNA序列，除此之外，酶蛋白还要占据识别位点两边的若干个碱基，这些碱基对内切酶稳定的结合到DNA双链并发挥切割DNA作用是有很大影响的，被称为保护碱基。

添加保护碱基的目的在分子克隆实验中，有时我们会在待扩增的目的基因片段两端加上特定的酶切位点，用于后续的酶切和连接反应。

但实验证明，大多数限制酶对裸露的酶切位点不能切断。

必须在酶切位点旁边加上一个至几个保护碱基，才能使所定的限制酶对其识别位点进行有效切断。

因此在设计PCR引物时，为保护5` 端外加的内切酶识别位点，人为地在酶切位点序列的5‘端外侧添加额外的碱基序列，即保护碱基，用来提高酶切时的活性，使酶切完全。

添加保护碱基的原则添加保护碱基，需要考虑两个因素：一是碱基数目，一是碱基种类。

添加保护碱基时，最关心的应该是保护碱基的数目，而不是种类。

什么样的酶切位点，添加几个保护碱基，是有数据可以参考的。

一般情况下，普通的内切酶只加入两个保护碱基，其内切反应就可以正常进行；而有一类，仅仅只加入两个保护碱基，其内切反应就不能正常进行，这是因为内切酶不能正常结合DNA段上。

如NdeI就属这类，需要加入至少6个保护碱基，常用的HindIII也要三个。

添加什么保护碱基，如果严格点，是根据两条引物的Tm值和各引物的碱基分布及GC含量。

如果某条引物Tm值偏小，GC%较低，添加时多加G或C，反之亦反。

为了解不同内切酶对识别位点以外最少保护碱基数目的要求，NEB采用了一系列含识别序列的短双链寡核苷酸作为酶切底物进行实验。

实验结果对于确定双酶切顺序将会有帮助（比如在多接头上切割位点很接近时），或者当切割位点靠近DNA末端时也很有用。

在本表中没有列出的酶，则通常需在识别位点两端至少加上6个保护碱基，以确保酶切反应的进行。

关于保护碱基

关于保护碱基1.首先要明确什么是保护碱基限制性内切酶识别特定的DNA序列，除此之外，酶蛋白还要占据识别位点两边的若干个碱基，这些碱基对内切酶稳定的结合到DNA双链并发挥切割DNA 作用是有很大影响的，被称为保护碱基。

2.添加保护碱基的目的在分子克隆实验中，有时我们会在待扩增的目的基因片段两端加上特定的酶切位点，用于后续的酶切和连接反应。

但实验证明，大多数限制酶对裸露的酶切位点不能切断。

必须在酶切位点旁边加上一个至几个保护碱基，才能使所定的限制酶对其识别位点进行有效切断。

3.添加保护碱基的原则添加保护碱基，需要考虑两个因素：一是碱基数目，一是碱基种类。

添加保护碱基时，最关心的应该是保护碱基的数目，而不是种类。

什么样的酶切位点，添加几个保护碱基，是有数据可以参考的。

如NdeI就属这类，需要加入至少6个保护碱基，常用的HindIII也要三个。

添加什么保护碱基，如果严格点，是根据两条引物的Tm值和各引物的碱基分布及GC含量。

如果某条引物Tm值偏小，GC%较低，添加时多加G或C，反之亦反。

为了解不同内切酶对识别位点以外最少保护碱基数目的要求，NEB采用了一系列含识别序列的短双链寡核苷酸作为酶切底物进行实验。

实验结果对于确定双酶切顺序将会有帮助（比如在多接头上切割位点很接近时），或者当切割位点靠近DNA末端时也很有用。

在本表中没有列出的酶，则通常需在识别位点两端至少加上6个保护碱基，以确保酶切反应的进行。

酶切位点的保护碱基原则

1 bp 2bp3bp4bp5bpAciI- + + ++ +++ AgeI+++ +++ +++ +++ +++ AgeI-HF™++ +++ +++ +++ +++ AluI- +++ +++ +++ +++ ApaI+++ +++ +++ +++ +++ AscI+++ +++ +++ +++ +++ AvrII++ ++ +++ +++ +++ Enzyme Back to top Base Pairs from end1 bp 2bp 3bp4bp5 bpBamHI+ ++ +++ +++ +++ BamHI-HF®+ + +++ +++ +++ BglII++ +++ +++ +++ +++ BmtI+++ +++ +++ +++ +++ BmtI-HF®+++ +++ +++ +++ +++ BsaI+++ +++ +++ +++ +++ BsaI-HF®+++ +++ +++ +++ +++ BsiWI++ +++ +++ +++ +++ BsmBI+++ +++ +++ +++ +++ BsrGI+++ +++ +++ +++ +++ BssHII+ +++ +++ +++ +++1 bp 2bp 3bp4bp5 bpClaI- - + +++ +++ Enzyme Back to top Base Pairs from end1 bp 2bp 3bp4bp5 bpDdeI+++ +++ +++ +++ +++ DpnI- ++ ++ nt nt DraIII+++ +++ +++ +++ +++ DraIII-HF®+++ +++ +++ +++ +++ Enzyme Back to top Base Pairs from end1 bp 2bp 3bp4bp5 bpEagI++ +++ +++ +++ +++ EagI-HF®+ +++ +++ +++ +++ EcoRI+ + ++ ++ +++ EcoRI-HF®+ + ++ +++ +++ EcoRV++ ++ ++ ++ +++ EcoRV-HF®+ ++ ++ ++ +++ Enzyme Back to top Base Pairs from end1 bp 2bp 3bp4bp5 bpFseI+ ++ +++ +++ +++ Enzyme Back to top Base Pairs from end1 bp2345 bpbp bp bpHindIII- + +++ +++ +++ HindIII-HF®- + +++ +++ +++ HpaI+++ +++ +++ +++ +++ Enzyme Back to top Base Pairs from end1 bp 2bp 3bp4bp5 bpKpnI+ +++ +++ +++ +++ KpnI-HF®+ +++ +++ +++ +++ Enzyme Back to top Base Pairs from end1 bp 2bp 3bp4bp5 bpMfeI+ ++ +++ +++ +++ MfeI-HF®+ ++ +++ +++ +++ MluI+ ++ +++ +++ +++ MseI+++ +++ +++ +++ +++ Enzyme Back to top Base Pairs from end1 bp 2bp 3bp4bp5 bpNcoI- ++ +++ +++ +++ NcoI-HF®+ ++ +++ +++ +++ NdeI+ + +++ +++ +++ NheI+ ++ +++ +++ +++ NheI-HF®++ ++ +++ +++ +++ NlaIII++ +++ +++ +++ +++NotI-HF®++ ++ ++ ++ ++ NsiI+ + +++ +++ +++ NspI- - + + +++ Enzyme Back to top Base Pairs from end1 bp 2bp 3bp4bp5 bpPacI+++ +++ +++ +++ +++ PciI+++ +++ +++ +++ +++ PmeI+++ +++ +++ +++ +++ PstI+ +++ +++ +++ +++ PstI-HF®++ +++ +++ +++ +++ PvuI+++ +++ ++ +++ +++ PvuI-HF®+++ +++ +++ +++ +++ PvuII++ ++ ++ +++ +++ PvuII-HF®- ++ ++ +++ +++ Enzyme Back to top Base Pairs from end1 bp 2bp 3bp4bp5 bpRsaI+ +++ +++ +++ +++ Enzyme Back to top Base Pairs from end1 bp 2bp 3bp4bp5 bpSacI- ++ +++ +++ +++ SacI-HF®- + +++ +++ +++SalI- ++ +++ +++ +++ SalI-HF®- ++ +++ +++ +++ SapI+++ +++ +++ +++ +++ Sau3AI+++ +++ +++ +++ +++ SbfI++ +++ +++ +++ +++ SbfI-HF®++ +++ +++ +++ +++ ScaI+++ +++ +++ +++ +++ ScaI-HF®+ +++ +++ +++ +++ SfiI+++ +++ +++ +++ +++ SmaI+++ +++ +++ +++ +++ SpeI+ ++ ++ ++ ++ SpeI-HF®+ ++ ++ ++ ++ SphI-HF®++ ++ +++ +++ +++ SphI+++ +++ +++ +++ +++ SspI+ +++ +++ +++ +++ SspI-HF®+ +++ +++ +++ +++ StuI+++ +++ +++ +++ +++ StyI+ ++ +++ +++ +++ StyI-HF®+ +++ +++ +++ +++ Enzyme Back to top Base Pairs from end1 bp 2bp 3bp4bp5 bpXbaI++ ++ ++ ++ ++XhoI++ ++ ++ +++ +++ XmaI+++ +++ +++ +++ +++。

酶切位点保护碱基表

酶切位点保护碱基表：PRC引物保护碱基的设计首先要明确什么是保护碱基限制性内切酶识别特定的DNA序列，除此之外，酶蛋白还要占据识别位点两边的若干个碱基，这些碱基对内切酶稳定的结合到DNA双链并发挥切割DNA作用是有很大影响的，被称为保护碱基。

添加保护碱基的目的在分子克隆实验中，有时我们会在待扩增的目的基因片段两端加上特定的酶切位点，用于后续的酶切和连接反应。

但实验证明，大多数限制酶对裸露的酶切位点不能切断。

必须在酶切位点旁边加上一个至几个保护碱基，才能使所定的限制酶对其识别位点进行有效切断。

添加保护碱基的原则添加保护碱基，需要考虑两个因素：一是碱基数目，一是碱基种类。

添加保护碱基时，最关心的应该是保护碱基的数目，而不是种类。

什么样的酶切位点，添加几个保护碱基，是有数据可以参考的。

如NdeI就属这类，需要加入至少6个保护碱基，常用的HindIII也要三个。

添加什么保护碱基，如果严格点，是根据两条引物的Tm值和各引物的碱基分布及GC含量。

如果某条引物Tm值偏小，GC%较低，添加时多加G或C，反之亦反。

为了解不同内切酶对识别位点以外最少保护碱基数目的要求，NEB采用了一系列含识别序列的短双链寡核苷酸作为酶切底物进行实验。

实验结果对于确定双酶切顺序将会有帮助（比如在多接头上切割位点很接近时），或者当切割位点靠近DNA末端时也很有用。

在本表中没有列出的酶，则通常需在识别位点两端至少加上6个保护碱基，以确保酶切反应的进行。

保护碱基

在引物设计时在5端添加保护碱基为什么要添加什么情况下要添加作用呢在引物设计时在5端添加保护碱基为什么要添加什么情况下要添加作用呢匿名提问2009-04-29 10:24:07 发布4个回答•回答•东少儿 | 2009-04-29 10:31:17•一般情况下，一对引物间不应多于4个连续碱基的同源性或互补性。

... 添加酶切位点是将 PCR 产物进行亚克隆使用得最多的手段。

一般酶切位点是六个碱基，另外在酶切位点 ...•skill01234 | 2009-04-29 10:36:27•引物：引物是PCR特异性反应的关键，PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。

理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。

但在设计引物时还应该遵循以下原则：①引物长度： 15-30bp，常用为20bp左右。

②引物扩增跨度：以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。

③引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。

ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。

④避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3’端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。

⑤引物3’端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。

⑥引物中有或能加上合适的酶切位点，被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好处。

⑦引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。

•edwen321 | 2009-07-30 15:20:35•一般的PCR引物不需要加保护碱基的，但是如果你是做克隆，想将扩增的目的片段连接到载体上，在酶切位点的外侧就要加保护碱基，这样是为了保证内切酶可以顺利的切割目的片段，到底要加几个保护碱基要看你用的是那个公司的酶，TAKARA的一般加两个或三个保护碱基，TAKARA目录上有详细的说明。

保护碱基

添加保护碱基的目的在分子克隆实验中，有时我们会在待扩增的目的基因片段两端加上特定的酶切位点，用于后续的酶切和连接反应。

但实验证明，大多数限制酶对裸露的酶切位点不能切断。

必须在酶切位点旁边加上一个至几个保护碱基，才能使所定的限制酶对其识别位点进行有效切断。

添加保护碱基的原则添加保护碱基，需要考虑两个因素：一是碱基数目，一是碱基种类。

添加保护碱基时，最关心的应该是保护碱基的数目，而不是种类。

什么样的酶切位点，添加几个保护碱基，是有数据可以参考的。

如NdeI就属这类，需要加入至少6个保护碱基，常用的HindIII也要三个。

添加什么保护碱基，如果严格点，是根据两条引物的Tm值和各引物的碱基分布及GC含量。

如果某条引物Tm值偏小，GC%较低，添加时多加G或C，反之亦反。

为了解不同内切酶对识别位点以外最少保护碱基数目的要求，NEB采用了一系列含识别序列的短双链寡核苷酸作为酶切底物进行实验。

实验结果对于确定双酶切顺序将会有帮助（比如在多接头上切割位点很接近时），或者当切割位点靠近DNA 末端时也很有用。

在本表中没有列出的酶，则通常需在识别位点两端至少加上6个保护碱基，以确保酶切反应的进行。

保护碱基列表

0
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GCGTCGACGTCTTGGCCATAGCGGCCGCGG
10
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ACGCGTCGACGTCGGCCATAGCGGCCGCG
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GAA
Sca I
GAGTACTC AAAAGTACTTTT
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Sma I
CCCGGG CCCCGGGG CCCCCGGGGG TCCCCCGGGGGA
4 页脚内容
Pme I
GTTTAAAC GGTTTAAACC GGGTTTAAACCC AGCTTTGTTTAAACGGCGCGCCGG
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Pst I
GCTGCAGC
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TGCACTGCAGTGCA
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AACTGCAGAACCAATGCATTGG
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AAAACTGCAGCCAATGCATTGGAA
GGCGCGCC AGGCGCGCCT TTGGCGCGCCAA
CCCCGGGG CCCCCGGGGG TCCCCCGGGGGA
CGGATCCG CGGGATCCCG CGCGGATCCGCG
CAGATCTG GAAGATCTTC GGAAGATCTTCC
GGCGCGCC AGGCGCGCCT TTGGCGCGCCAA
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分子克隆必备-保护碱基

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保护碱基添加原则

保护碱基添加原则一、什么是保护碱基呀？保护碱基就是在进行基因克隆等操作时，添加在限制酶识别位点外侧的一些碱基。

它们就像是小保镖一样，能保护限制酶的识别位点不被破坏呢。

这是因为在一些酶切反应或者连接反应中，如果没有这些保护碱基，识别位点可能会受到影响，导致反应不能很好地进行。

比如说，我们就想象它是给识别位点穿上了一层铠甲，让它在复杂的反应环境里能够稳稳当当的。

二、添加保护碱基的一些基本考虑因素1. 酶的特性不同的限制酶对保护碱基的需求是不一样的。

有些酶比较“挑剔”，需要特定的保护碱基组合，而有些酶可能相对“随和”一点。

就像人一样，有的人口味很独特，只吃特定的几种食物，而有的人啥都能吃一点。

例如，某些酶可能需要 2 - 3个特定的保护碱基才能高效地工作。

2. 连接效率我们添加保护碱基也是为了提高连接效率。

如果没有合适的保护碱基，在连接反应中，DNA片段就可能不能很好地连接起来。

这就好比我们拼图的时候，如果边缘不整齐或者少了几块，就很难拼成功。

合适的保护碱基能让DNA片段的末端更利于连接，就像把拼图的边缘打磨得更光滑一样。

3. 基因表达的影响有时候添加保护碱基还会对基因表达产生影响呢。

如果保护碱基添加得不合适，可能会影响到基因转录或者翻译的过程。

这就像是一个小小的改变，可能会在整个基因表达的大工厂里引起连锁反应。

比如说，可能会让基因表达的量变多或者变少，甚至可能让基因表达出完全不同的产物。

三、如何确定要添加的保护碱基1. 查阅资料最靠谱的方法之一就是查阅相关的科学文献或者实验手册。

这些资料就像是前人留下的宝藏地图，里面有很多关于不同酶需要何种保护碱基的详细信息。

比如说，在一些专业的分子生物学实验手册里，会清楚地列出各种常见限制酶对应的推荐保护碱基。

2. 参考经验向有经验的实验室师兄师姐或者老师请教也是个好办法。

他们在实验室里摸爬滚打了很久，肯定遇到过各种各样关于保护碱基添加的问题。

他们的经验就像是一把把钥匙，可能会帮我们打开关于保护碱基添加的正确大门。

保护碱基添加总结

酶切位点保护碱基表6PCR引物设计原则信息来源：本站原创更新时间：2004-12-21 0:44:00PCR引物设计的目的是为了找到一对合适的核苷酸片段，使其能有效地扩增模板DNA序列。

因此，引物的优劣直接关系到PCR的特异性与成功与否。

要设计引物首先要找到DNA序列的保守区。

同时应预测将要扩增的片段单链是否形成二级结构。

如这个区域单链能形成二级结构，就要避开它。

如这一段不能形成二级结构，那就可以在这一区域设计引物。

现在可以在这一保守区域里设计一对引物。

一般引物长度为15~30碱基，扩增片段长度为100~600碱基对。

让我们先看看P1引物。

一般引物序列中G+C含量一般为40%~60%。

而且四种碱基的分布最好随机。

不要有聚嘌呤或聚嘧啶存在。

否则P1引物设计的就不合理。

应重新寻找区域设计引物。

同时引物之间也不能有互补性，一般一对引物间不应多于4个连续碱基的互补。

引物确定以后，可以对引物进行必要的修饰，例如可以在引物的5′端加酶切位点序列；标记生物素、荧光素、地高辛等，这对扩增的特异性影响不大。

但3′端绝对不能进行任何修饰，因为引物的延伸是从3′端开始的。

这里还需提醒的是3′端不要终止于密码子的第3位，因为密码子第3位易发生简并，会影响扩增的特异性与效率。

综上所述我们可以归纳十条PCR引物的设计原则：①引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。

②产物不能形成二级结构。

③引物长度一般在15~30碱基之间。

④G+C含量在40%~60%之间。

⑤碱基要随机分布。

⑥引物自身不能有连续4个碱基的互补。

⑦引物之间不能有连续4个碱基的互补。

⑧引物5′端可以修饰。

⑨引物3′端不可修饰。

⑩引物3′端要避开密码子的第3位。

PCR引物设计的目的是找到一对合适的核苷酸片段，使其能有效地扩增模板DNA序列。

如前述，引物的优劣直接关系到PCR的特异性与成功与否。

对引物的设计不可能有一种包罗万象的规则确保PCR的成功，但遵循某些原则，则有助于引物的设计。

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酶切位点保护碱基表6
PCR引物设计原则
信息来源：本站原创更新时间：2004-12-21 0:44:00
PCR引物设计的目的是为了找到一对合适的核苷酸片段，使其能有效地扩增模板DNA序列。

因此，引物的优劣直接关系到PCR的特异性与成功与否。

要设计引物首先要找到DNA序列的保守区。

同时应预测将要扩增的片段单链是否形成二级结构。

如这个区域单链能形成二级结构，就要避开它。

如这一段不能形成二级结构，那就可以在这一区域设计引物。

现在可以在这一保守区域里设计一对引物。

一般引物长度为15~30碱基，扩增片段长度为100~600碱基对。

让我们先看看P1引物。

一般引物序列中G+C含量一般为40%~60%。

而且四种碱基的分布最好随机。

不要有聚嘌呤或聚嘧啶存在。

否则
P1引物设计的就不合理。

应重新寻找区域设计引物。

同时引物之间也不能有互补性，一般一对引物间不应多于4个连续碱基的互补。

引物确定以后，可以对引物进行必要的修饰，例如可以在引物的5′端加酶切位点序列；标记生物素、荧光素、地高辛等，这对扩增的特
异性影响不大。

但3′端绝对不能进行任何修饰，因为引物的延伸是从3′端开始的。

这里还需提醒的是3′端不要终止于密码子的第3位，因为密码子第3位易发生简并，会影响扩增的特异性与效率。

综上所述我们可以归纳十条PCR引物的设计原则：
①引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。

②产物不能形成二级结构。

③引物长度一般在15~30碱基之间。

④G+C含量在40%~60%之间。

⑤碱基要随机分布。

⑥引物自身不能有连续4个碱基的互补。

⑦引物之间不能有连续4个碱基的互补。

⑧引物5′端可以修饰。

⑨引物3′端不可修饰。

⑩引物3′端要避开密码子的第3位。

PCR引物设计的目的是找到一对合适的核苷酸片段，使其能有效地扩增模板DNA序列。

如前述，引物的优劣直接关系到PCR的特异性与成功与否。

对引物的设计不可能有一种包罗万象的规则确保PCR 的成功，但遵循某些原则，则有助于引物的设计。

1.引物的特异性
引物与非特异扩增序列的同源性不要超过70%或有连续8个互补碱基同源。

2.避开产物的二级结构区
某些引物无效的主要原因是引物重复区DNA二级结构的影响，选择扩增片段时最好避开二级结构区域。

用有关计算机软件可以预测估计mRNA的稳定二级结构，有助于选择模板。

实验表明，待扩区域自由能（△G°）小于58.6lkJ/mol时，扩增往往不能成功。

若不能避开这一区域时，用7-deaza-2′-脱氧GTP取代dGTP对扩增的成功是有帮助的。

3.长度
寡核苷酸引物长度为15~30bp，一般为20~27mer。

引物的有效长度：Ln=2（G+C）+（A+T+，Ln值不能大于38，因为>38时，最适延伸温度会超过Taq DNA聚合酶的最适温度（74℃),不能保证产物的特异性。

4.G+C含量
G+C含量一般为40%~60%。

其Tm值是寡核苷酸的解链温度，即
在一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度，有效启动温度，一般高于Tm值5~10℃。

若按公式Tm=4（G+C）+2（A+T）估计引物的Tm值，则有效引物的Tm为55~80℃，其Tm值最好接近72℃以使复性条件最佳。

5.碱基础随机分布
引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。

尤其3′端不应超过3个连续的G或C，因这样会使引物在G+C富集序列区错误引发。

6.引物自身
引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹状结构牙引物本身复性。

这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。

若用人工判断，引物自身连续互补碱基不能大于3bp。

7.引物之间
两引物之间不应不互补性，尤应避免3′端的互补重叠以防引物二聚体的形成。

一对引物间不应多于4个连续碱基的同源性或互补性。

8.引物的3′端
引物的延伸是从3′端开始的，不能进行任何修饰。

3′端也不能有形成任何二级结构可能，除在特殊的PCR（AS-PCR）反应中，引物3′端不能发生错配。

在标准PCR反应体系中，用2U Taq DNA聚合酶和800μmol/L dNTP （四种dNTP各200μmol/L）以质粒（103拷贝）为模板，按95℃，25s；55℃，25s；72℃，1min的循环参数扩增HIV-1 gag基因区的条件下，引物3′端错配对扩增产物的影响是有一定规律的。

A∶A错配使产量下降至1/20，A∶G和C∶C错七下降至1/100。

引物A：模板G与引物G：模板A错配对PCR影响是等同的。

9.引物的5′端
引物的5′端限定着PCR产物的长度，它对扩增特异性影响不大。

因此，可以被修饰而不影响扩增的特异性。

引物5′端修饰包括：加酶切位点；标记生物素、荧光、地高辛、Eu3+等；引入蛋白质结合DNA 序列；引入突变位点、插入与缺失突变序列和引入一启动子序列等。

10.密码子的简并
如扩增编码区域，引物3′端不要终止于密码子的第3位，因密码子的第3位易发生简并，会影响扩增特异性与效率。

特殊目的的引物设计将在有关章节讨论。

随着人们对引物的认识，一些引物的计算机设计程序也应运而生，下面将讨论有关引物计算机设计方法。

PCR参数设定的基本原则
PCR知识一个PCR反应开始，首先是双链DNA解离为单链，使之有利于与引物结合过程可以通过加热来完成。

在90—95℃条件下，即使复杂的DNA分子，如人基因组DNA也可变性成单链，根据模板DNA复杂程度，可以调整变性温度和时间。

一般情况下选择94…C、30s可使各种复杂DNA分子完全变性。

过高温度或持续时间过长，对TaqDNA聚合酶活性和dNTP分子都会造成损害。

变性后的DNA很快冷却至40～60℃，即可使引物和模板DNA发生结合。

这是由于模板DNA结构比引物复杂得多，引物和模板之间碰撞的机会大大高于模板互补链之间的碰撞。

复性温度的选择，可以根据引物的长度和其G-+-C含量确定。

引物长度为15～25bp时，退火温度可通过Tm＝4X(G+C)+2X (Ad-T)计算得到。

在Tm允许的温度范围内，选择较高的退火温度可大大减少引物和模板之间的非特异结合，提高
PCR的特异性。

退火时间设置为30s，足以使引物和模板之间完全结合。

PCR反应的延伸温度为70—75℃，此时，TaqDNA聚合酶具有最高活性。

引物在16个核苷酸以下时，过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。

可采用反应温度缓慢升高到70～75℃的方法。

因为在最初较低温度下，DNA聚合酶已催化延伸反应开始，随后的较高温度不会对“延长”过的引物和DNA模板的结合发生影响。

PCR延伸反应的时间，可根据待扩增片段的长度而定。

一般lkb以内的片段，延伸时间lmin足够。

扩增片段在lkb
以上则需增加延伸时间。

以上参数确定后，PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度。

理论上20～25次循环后，PCR产物的积累即可达到最大值。

实际操作中由于每步反应的产率不可能达到完全，因此不管模板浓度多少，20～30次是比较合理的循环次数。

循环反应的次数越多，非特异性产物的量也会增加。