酵母双杂交体系Yeasttwo-hybridsystem酵母双杂交
合集下载
相关主题
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
上游更远处 增强子 统称顺式作用元件
转录因子
能直接或间接辨认和结合上游区段DNA 的蛋白质----反式作用因子. 其中能直接或间接与RNA聚合酶结合的 称为转录因子(TF). 相应于RNA聚合酶ⅠⅡⅢ的转录因子为 TF Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ 真核生物的TFⅡ又分为TFⅡ A与TFⅡ B
真核生物转录起始前复合物
酵母双杂交体系
Yeast two-hybrid system
酵母双杂交 (yeast two hybrid) 技术是利 用酵母遗传学方法分析蛋白质之间的相互作 用的技术.
背景知识
真核生物转录起始前区域结构: -25bp区有：TATA 序列 称为 Hogness盒或TATA box，为启动子核 心序列。
GAL1 UAS
（上游激活序列）
启动子
Lac Z(报告基因)
缺陷型宿主菌株
常见的有SF562和HF7c. 特点： 无表达GAL4转录激活因子的能力
载体------穿梭质粒
pGBT9, 又称DNA-BD质粒载体。靶基 因插入可与GAL4-BD形成融合蛋白Ⅰ。 pGAD424，又称AD质粒载体。靶基因 插入可与GAL4-AD形成融合蛋白Ⅱ。 二者均可在大肠杆菌和酿酒酵母中自主复 制。 两种融合蛋白可在酵母中高表达。在核定 位序列作用下，进入酵母细胞核内。
（ADH1:醇脱氢酶1）
实验程序
1 2 3 4 5
分别重组两种穿梭质粒载体。 分别导入E.coli培养。 分别提取两种质粒。 转化酵母菌 筛选阳性克隆
应用---蛋白质相互作用
筛选单抗 蛋白质-蛋白质相互作用 筛选酶抑制剂
…
GAL1 UAS
（上游激活序列） 启动子
Lac Z(报告基因)
GAL4的AD同蛋白质Y结合，形成的杂种蛋 白，未与UAS序列结合，不能启动报导基因 转录。
AD 蛋白质Y
GAL1 UAS
（上游激活序列）
启动子
Lac Z(报告基因)
通过此两个杂种蛋白中的X与Y的相互作用， 在细胞内重建了GAL4的功能，启动报导基 因表达。
TFⅡD识别TATA TFⅡD-ⅡA-ⅡB-DNA复合体 TFⅡB为桥梁并提供结合表面,促使 TFⅡF-RNA pol复合结构进入启动子核 心区TATA. TFⅡE的ATPase分解ATP,解开DNA双 螺旋. TFⅡH进入完成转录起始前复合物(PIC) 启动合成RNA第一个碱基.
ห้องสมุดไป่ตู้
真核转录因子的结构域
基本原理
DNA结合域（DNA-BD）：N端1-147 氨基酸 转录激活域（AD）：C端786-881氨基 酸
DNA-BD：识别GAL4效应基因上游的 激活序列（UAS） ，并与之结合 AD：通过同转录机制(transcription machinery)的其它成分之间的结合以启 动上游激活序列（UAS）下游的基因转录。
用DNA重组技术，将DNA-BD和AD分 开，并放在同一宿主细胞中表达。
将编码DNA-BD的基因与已知蛋白质 Bait protein的基因构建在同一个表达 载体上，在酵母中表达两者的融合蛋白 BD-Bait protein。
将编码AD的基因和cDNA文库的基
因构建在AD-LIBRARY表达载体上。
产生的GAL4 DNA-BD和AD多肽 不直接发生相互作用，不能激活相关的效 应基因进行转录
同时用上述两种载体转化改造后的酵
母，这种改造后的酵母细胞的基因组 中不能产生GAL4。
GAL4的DNA-BD和蛋白质X结合形成杂种 蛋白，与GAL1的UAS序列结合，但由于无 AD的参与，报告基因不转录。 蛋白质X DNA-BD
两个结构域
DNA结合结构域(DNA-binding domain， BD) 一个或多个与其他调控蛋白相互作用的转录激 活结构域(activation domain，AD)
酵母转录因子GAL4结构特点
GAL4包括两个彼此分离的但功能必需的 结构域. 两结构域：DNA结合域 转录激活域 特点：结构上可分开、功能上相互独立
转录因子
能直接或间接辨认和结合上游区段DNA 的蛋白质----反式作用因子. 其中能直接或间接与RNA聚合酶结合的 称为转录因子(TF). 相应于RNA聚合酶ⅠⅡⅢ的转录因子为 TF Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ 真核生物的TFⅡ又分为TFⅡ A与TFⅡ B
真核生物转录起始前复合物
酵母双杂交体系
Yeast two-hybrid system
酵母双杂交 (yeast two hybrid) 技术是利 用酵母遗传学方法分析蛋白质之间的相互作 用的技术.
背景知识
真核生物转录起始前区域结构: -25bp区有：TATA 序列 称为 Hogness盒或TATA box，为启动子核 心序列。
GAL1 UAS
（上游激活序列）
启动子
Lac Z(报告基因)
缺陷型宿主菌株
常见的有SF562和HF7c. 特点： 无表达GAL4转录激活因子的能力
载体------穿梭质粒
pGBT9, 又称DNA-BD质粒载体。靶基 因插入可与GAL4-BD形成融合蛋白Ⅰ。 pGAD424，又称AD质粒载体。靶基因 插入可与GAL4-AD形成融合蛋白Ⅱ。 二者均可在大肠杆菌和酿酒酵母中自主复 制。 两种融合蛋白可在酵母中高表达。在核定 位序列作用下，进入酵母细胞核内。
（ADH1:醇脱氢酶1）
实验程序
1 2 3 4 5
分别重组两种穿梭质粒载体。 分别导入E.coli培养。 分别提取两种质粒。 转化酵母菌 筛选阳性克隆
应用---蛋白质相互作用
筛选单抗 蛋白质-蛋白质相互作用 筛选酶抑制剂
…
GAL1 UAS
（上游激活序列） 启动子
Lac Z(报告基因)
GAL4的AD同蛋白质Y结合，形成的杂种蛋 白，未与UAS序列结合，不能启动报导基因 转录。
AD 蛋白质Y
GAL1 UAS
（上游激活序列）
启动子
Lac Z(报告基因)
通过此两个杂种蛋白中的X与Y的相互作用， 在细胞内重建了GAL4的功能，启动报导基 因表达。
TFⅡD识别TATA TFⅡD-ⅡA-ⅡB-DNA复合体 TFⅡB为桥梁并提供结合表面,促使 TFⅡF-RNA pol复合结构进入启动子核 心区TATA. TFⅡE的ATPase分解ATP,解开DNA双 螺旋. TFⅡH进入完成转录起始前复合物(PIC) 启动合成RNA第一个碱基.
ห้องสมุดไป่ตู้
真核转录因子的结构域
基本原理
DNA结合域（DNA-BD）：N端1-147 氨基酸 转录激活域（AD）：C端786-881氨基 酸
DNA-BD：识别GAL4效应基因上游的 激活序列（UAS） ，并与之结合 AD：通过同转录机制(transcription machinery)的其它成分之间的结合以启 动上游激活序列（UAS）下游的基因转录。
用DNA重组技术，将DNA-BD和AD分 开，并放在同一宿主细胞中表达。
将编码DNA-BD的基因与已知蛋白质 Bait protein的基因构建在同一个表达 载体上，在酵母中表达两者的融合蛋白 BD-Bait protein。
将编码AD的基因和cDNA文库的基
因构建在AD-LIBRARY表达载体上。
产生的GAL4 DNA-BD和AD多肽 不直接发生相互作用，不能激活相关的效 应基因进行转录
同时用上述两种载体转化改造后的酵
母，这种改造后的酵母细胞的基因组 中不能产生GAL4。
GAL4的DNA-BD和蛋白质X结合形成杂种 蛋白，与GAL1的UAS序列结合，但由于无 AD的参与，报告基因不转录。 蛋白质X DNA-BD
两个结构域
DNA结合结构域(DNA-binding domain， BD) 一个或多个与其他调控蛋白相互作用的转录激 活结构域(activation domain，AD)
酵母转录因子GAL4结构特点
GAL4包括两个彼此分离的但功能必需的 结构域. 两结构域：DNA结合域 转录激活域 特点：结构上可分开、功能上相互独立