酵母双杂交体系Yeasttwo-hybridsystem酵母双杂交
酵母双杂交
酵母转录因子（Gal 4）
与BD-fusion ---诱饵蛋白（bait protein ） 与AD-fusion ---猎物或靶蛋白（prey or target protein）
报告基因（reporter gene）
---Lac Z（编码β -半乳糖苷酶）
报道株
经改造的、含报告基因的重组质粒的宿 主细胞。 酵母细胞作为报道株的酵母双杂交系统具有 许多优点:
酵母双杂交系统
一、酵母双杂交系统的简介
酵母双杂交系统(yeast two-hybrid system) 是由Fields和song等在1989年提出的一种在真 核模式生物酵母中进行的，研究活细胞内蛋 白质相互作用的遗传系统。 酵母双杂交系统的建立得力于对真核细 胞调控转录起始过程的认识。研究发现，许 多真核生物的转录因子都是由两个可以分开 的、功能上相互独立的结构域组成的。
DNA结合结构域(BD)
(DNA binding domain)
转录激活因子
转录激活结构域(AD) (activation domain)
•这两个结构域各具功能，互不影响,
•单独存在时都没有转录激活的功能，
•只有二者在空间上充分接近时，才表现出一个完整的
激活特定基因表达的激活因子的功能。
二、酵母双杂交系统的建立
五、酵母双杂交的应用
酵母双杂交系统是在真核模式生物酵母中进行的， 研究活细胞内蛋白质相互作用，对蛋白质之间微弱的、 瞬间的作用也能够通过报告基因的表达产物敏感地检 测得到，它是一种具有很高灵敏度的研究蛋白质之间 关系的技术。
大量的研究文献表明，酵母双杂交技术既可以用 来研究哺乳动物基因组编码的蛋白质之间的互作，也 可以用来研究高等植物基因组编码的蛋白质之间的互 作。因此，它在许多的研究领域中有着广泛的应用。
酵母双杂实验操作手册和注意事项
酵母双杂（Yeast two-hybrid）实验操作手册和注意事项一. 酵母双杂的原理1989年，Song和Field建立了第一个基于酵母的细胞内检测蛋白间相互作用的遗传系统。
很多真核生物的位点特异转录激活因子通常具有两个可分割开的结构域，即DNA特异结合域（DNA-binding domain，BD）与转录激活域（Transcriptional activation domain ，AD）。
这两个结构域各具功能，互不影响。
但一个完整的激活特定基因表达的激活因子必须同时含有这两个结构域,否则无法完成激活功能。
不同来源激活因子的BD区与AD结合后则特异地激活被BD结合的基因表达。
基于这个原理，可将两个待测蛋白分别与这两个结构域建成融合蛋白，并共表达于同一个酵母细胞内。
如果两个待测蛋白间能发生相互作用，就会通过待测蛋白的桥梁作用使AD与BD形成一个完整的转录激活因子并激活相应的报告基因表达。
通过对报告基因表型的测定可以很容易地知道待测蛋白分子间是否发生了相互作用。
酵母双杂交系统由三个部分组成：(1)与BD融合的蛋白表达载体，被表达的蛋白称诱饵蛋白(bait)。
(2)与AD融合的蛋白表达载体，被其表达的蛋白称靶蛋白(prey)。
(3)带有一个或多个报告基因的宿主菌株。
常用的报告基因有HIS3，URA3，LacZ和ADE2等。
而菌株则具有相应的缺陷型。
双杂交质粒上分别带有不同的抗性基因和营养标记基因。
这些有利于实验后期杂交质粒的鉴定与分离。
根据目前通用的系统中BD来源的不同主要分为GAL4系统和LexA系统。
后者因其BD来源于原核生物，在真核生物内缺少同源性，因此可以减少假阳性的出现。
二.所用的载体及相关信息1. pGBKT7载体的图谱和相关信息The pGBKT7 vector expresses proteins fused to amino acids 1–147 of the GAL4 DNA binding domain (DNA-BD). In yeast, fusion proteins are expressed at high levels from the constitutive ADH1promoter (PADH1); transcription is terminated by the T7 and ADH1 transcription termination signals(TT7 & ADH1). pGBKT7 also contains the T7 promoter, a c-Myc epitope tag, and a MCS. pGBKT7replicates autonomously in both E. coli and S. cerevisiae from the pUC and 2 m ori, respectively. Thevector carries the Kan r for selection in E. coli and the TRP1 nutritional marker for selection in yeast.Yeast strains containing pGBKT7 exhibit a higher transformation efficiency than strains carrying other DNA-BD domain vectors (1).b. pGADT7载体的图谱和相关信息pGADT7-T encodes a fusion of the SV40 large T-antigen (a.a. 86–708) and the GAL4 AD (a.a. 768–881). The SV40 large T DNA (GenBank LocusSV4CG) was derived from a plasmid referenced in Li & Fields (1993) and was cloned into pGADT7 using the EcoR I and Xho I sites. pGADT7-T has not been sequenced.三．实验主要流程A.需要准备的药品和设备1.两种酵母菌种(AH109,Y187)2.酵母培养所需的药品: Yeast nitrogen base without amino acidsAgar (for plates only)sterile 10×Dropout Solution单缺-T,-L(clontech公司)二缺-T/-L (clontech公司)四缺-T/-L/-Ade/-His(clontech公司)3.酵母转化所需的药品: 10×TE buffer10×LiAc40%PEGcarrier DNA4.酵母显色所需要的药品: x- -GAL5.其他仪器设备: 30℃恒温培养箱30℃摇床.水浴锅分光光度计B．DNA-BD和DN-AD fusion protein 载体的分别构建。
酵母双杂交系统及其应用
酵母双杂交系统及其应用Yeast Two-hybrid System and Its Application1. 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的生物学特性（1）单细胞真核生物尽管酵母细胞比较简单，但它们具有所有真核生物细胞的主要特征，如含有一个独立的细胞核、多条线性染色质包装成染色体、细胞质包含了全部的细胞器和细胞骨架结果（如肌动蛋白纤维）。
（2）与其它真核生物相比，它们的基因组较小，基因数目也较少；1996 年已完成酵母全基因组测序（1.5 x 10 7 bp ），是第一个被测序的真核生物。
大约有6000个基因。
目前已经建立了一个6000 个菌株的文库，每一个菌株中只删除了一个基因。
其中5000 多株在单倍体状态时能够存活，表明大多数酵母基因时非必需的。
（3）易于培养和操作,可以在实验室快速繁殖在指数生长期每90 分钟繁殖一代，从单个细胞可以繁殖称克隆群体。
（4）单倍体和双倍体的存在使酿酒酵母便于进行遗传分析酿酒酵母可以以单倍体状态和双倍体状态生长。
单倍体和双倍体之间的转换是通过交配和孢子形成来实现的。
有两种单倍体细胞类型，分别为a 型和α型。
在一起生长时，这些细胞因交配而形成a/ α双倍体细胞。
在营养匮乏时，a/ α双倍体发生减数分裂，产生一个子囊的结构，每个子囊含有4 个单倍体孢子（两个a－孢子和两个α－孢子）。
但当生长条件改善时，这些孢子可以出芽并以单倍体细胞的形式生长或交配而重新形成双倍体。
一个酵母细胞可同时兼容几种不同质粒bud，芽, 蓓蕾starvation ，饥饿, 饿死ascus，n.［微生物］子囊meiosis，n.减数分裂, 成熟分裂haploid，n.［生物］单倍体, 仅有一组染色体的细胞adj.单一的diploid ，adj.双重的, 倍数的, 双倍的n.倍数染色体ascospore，n.［植］囊孢子rupture，v.破裂, 裂开, 断绝（关系等）, 割裂。
大肠杆菌酵母双杂交系统在基因互作研究中的应用
大肠杆菌酵母双杂交系统在基因互作研究中的应用生命科学研究中，基因互作是一个重要的研究领域，对了解基因的功能，及其在生物学中的重要性具有关键性意义。
近年来，越来越多的研究者运用酵母双杂交系统来研究基因互作。
其中，大肠杆菌酵母双杂交系统在基因互作研究中的应用越来越广泛。
1. 大肠杆菌酵母双杂交系统简介酵母双杂交系统（yeast two-hybrid system）最早是由Fields与Song在1989年提出的，它是一种通过互补形成基因蛋白质互作物的方法。
大肠杆菌酵母双杂交系统（E. coli yeast two-hybrid system）是在酵母双杂交系统的基础上发展而来的。
它是通过将酵母双杂交系统中的酵母菌GAL4基因融合到大肠杆菌中的一种表达载体，并在其上构建相应的表达基因来实现的。
通过这种方法，大肠杆菌系能够鉴定出与目标蛋白质相互作用的蛋白质，并通过一些方法进行确认和鉴定。
2. 大肠杆菌酵母双杂交系统的优点（1）鉴定简单：大肠杆菌酵母双杂交系统只需要一些特定的基因表达载体，而不需要其他繁琐的操作，使其鉴定基因互作关系的过程变得更加简单。
（2）兼容成熟技术：大肠杆菌酵母双杂交系统是在酵母双杂交系统技术的基础上发展起来的，因此，其技术兼容性是酵母双杂交系统的一个很好的特点。
大肠杆菌酵母双杂交系统可以通过一定的改变来应对不同的研究需求。
（3）识别特异性高：大肠杆菌酵母双杂交系统的识别特异性非常高，能够鉴定出相互作用蛋白的特异性差异。
3. 大肠杆菌酵母双杂交系统的应用大肠杆菌酵母双杂交系统的主要应用是用于了解蛋白质之间的定向互作关系。
例如，研究一个特定的基因是如何参与一个生物功能的，就需要找到与之相关的其他基因，以了解它们之间是否发生了相互作用。
在研究基因调控的过程中也能使用它进行分析。
此外，大肠杆菌酵母双杂交系统还能运用于感染病毒的分析。
例如：通过大肠杆菌酵母双杂交系统的研究，有学者发现存在于整个病毒基因组中、并参与了其复制的两个产生蛋白质。
酵母双杂交具体实验流程
酵母双杂交具体实验流程
酵母双杂交（Yeast Two-Hybrid，Y2H）是一种常用的蛋白质相互作用分析方法，它基于酵母细胞内存在的转录激活子结合域（Transcription Activation Domain，TAD）和DNA结合域（DNA Binding Domain，DBD），通过融合特定的蛋白质序列并在酵母细
胞中共同表达，以实现筛选并鉴定蛋白质相互作用的目的。
酵母双杂交具体实验流程如下：
1.构建启动子驱动的酵母表达载体
该载体包含两部分：AD与DB，分别携带TAD和DBD结构域。
这些结构域可以具体化作为外源蛋白的两个互补部分，这样当它们相互结
合时，激活酵母内的报告基因（RLUC或LacZ）表达，并通过信号放
大器Cre的介入增强了信号。
2.构建融合基因的酵母表达载体
将想要研究的两种蛋白质的氨基酸序列分别连接到AD与DB的C端，形成融合蛋白质基因，然后将融合基因与启动子驱动的表达载体转化
入双杂交酵母细胞。
3.获得蛋白质相互作用的筛选和确认
通过对酵母双杂交转化后的细胞进行筛选，并通过对表达的信号进行观察和测量，得到蛋白质相互作用的筛选结果。
4.确定筛选结果的真实性
在确定特定蛋白质相互作用是否真实的过程中，通常会进行一些补充实验。
例如，可以通过分析生化反应，并利用免疫共沉淀等方法验证筛选结果的可靠性。
总的来说，酵母双杂交是一种常用的蛋白质相互作用分析方法，它可以快速、可靠地鉴定蛋白质相互作用，从而帮助研究者更深入地探究蛋白质的功能和作用机制。
酵母双杂交技术1
发展背景
酵母双杂交系统是由Fields等在1989年提出的一种在活细 胞中鉴定蛋白质相互作用的遗传系统。
酵母双杂交系统的建立得力于对真核细胞调控转录起始
过程的认识。研究发现，许多真核生物的转录因子都是由 两个可以分开的、功能上相互独立的结构域组成的。
酵母双杂交系统是一种在酵母细胞内分析 蛋白质相互作用的技术。 它可用于： 检验蛋白质间的相互作用； 分析蛋白质相互作用的结构域； 发现新的作用蛋白质。
酵母双杂交技术的原理
基于对真核生物基因调控转录起始过程的认识。 基因转录不仅需要有特定的DNA顺式序列结构，而且也需 要有反式转录激活因子的参与。 转录激活因子往往由两个或两个以上相互独立的结构域构 成,其中有DNA结合结构域(DNA binding domain, DB)和转录激活 结构域(activation domain, AD), 它们都是能激活基因转录，但不同转录激活因子 的DB和AD形成的杂合蛋白仍然具有正常的激活转录的功能。
酵母双杂交操作主要流程
1. 2. 3. 4. 5. 6. 分别构建BD和AD融合蛋白载体 分别将重组载体转化酵母菌细胞 对酵母转化子进行自激活检测 将重组载体共转化酵母菌细胞 检测报告基因表达产物 分析酵母双杂交实验结果
酵母双杂交技术的优点：
1. 是一种细胞内蛋白质相互作用研究技术，比体外的蛋白 质相互作用技术更接近生物体内的真实情况。
如果要研究两个蛋白之间有无相互作用，可以把这两 个蛋白分别与DB和AD形成的融合蛋白。 与DB 融合的蛋白称为“诱饵”(bait)， 与AD融合的蛋白称为“猎物”(prey)。 如果这两个蛋白能发生相互作用, 这两个融合蛋白上的 DB和AD就能重新形成有活性的转录激活因子, 从而激活报告 基因(reporter gene)的转录与表达。通过检测报告基因的 表达产物, 可判别“诱饵”和“猎物”这两个蛋白质之间是 否存在相互作用。
酵母双杂交检测（Yeast
酵母双杂交检测（Yeast Two酵母双杂交检测（Yeast Two-Hybrid Assay）产品专题检测原理：酵母双杂交系统（Yeast two-hybrid assay）是⽤于体内研究蛋⽩相互作⽤的⼀种⾮常便利的⼯具，常⽤的如GAL4为基础的系统，使⽤酵母转录因⼦GAL4来检测转录激活后的蛋⽩相互作⽤。
某些转录因⼦（如GAL4）由两个可以分开，功能上相互独⽴的结构域组成，N端有⼀个147个氨基酸组成的DNA结合域（DNA binding domain，BD），C端有⼀个由113个氨基酸组成的转录激活域（transcription activation domain，AD）。
BD可以和上游激活序列（UAS）结合，⽽AD能激活UAS下游基因进⾏转录。
单独的BD或AD不能激活基因转录，两者只有通过某种⽅式结合在⼀起形成完整的转录激活因⼦的功能【见图1】。
酵母双杂交系统主要利⽤酵母GAL4的这个特性通过两个杂交蛋⽩在酵母细胞中的相互结合及对报告基因的转录激活来研究活细胞内蛋⽩质的相互作⽤，对蛋⽩质之间微弱、瞬间的作⽤都能通过报告基因敏感的检测到。
酵母双杂交系统应⽤：1）对新的与已经蛋⽩相互作⽤的鉴定2）对预测蛋⽩相互作⽤的确认3）对蛋⽩相互作⽤区域的鉴定双杂交检测原理图。
两个蛋⽩分别表达，⼀个（诱饵蛋⽩bait protein）融合到Gal4 DNA 图1.双杂交检测原理图。
结合域表达，另⼀个（诱捕蛋⽩prey protein）融合到Gal4转录激活结构域（AD）表达。
在Y2HGold酵母菌株中，只有当两个蛋⽩之间相互作⽤并结合到Gal4反应性启动⼦上才能活化报告基因（AUR1-C, ADE2, HIS3, 和MEL1）的表达。
酵母双杂交系统重要元件介绍（以Matchmarker GAL4-based two hybrid assay为例）诱饵（the bait）⼀、⼀、诱饵（为了建⽴GAL4 DNA-BD/bait融合蛋⽩，推荐使⽤质粒pGBKT7；要调查三元蛋⽩复合物，推荐使⽤含2个MCS区域的三杂交载体，能表达GAL4 DNA-BD/bait融合蛋⽩和第⼆个感兴趣蛋⽩，在bait和prey蛋⽩之间发挥桥梁作⽤。
酵母双杂交的原理
酵母双杂交的原理
酵母双杂交(YeastTwo-hybridSystem，Y2H)是一种具有实验性方法的蛋白质相互作用实验，它可以用来验证和确定两个蛋白在体内及体外之间存在相互作用。
这种蛋白质相互作用可以发生在体内，也可以发生在体外。
在这种实验中，使用的物质是由两个融合的蛋白质组成的双融合蛋白，一个蛋白是结合调控区或结合位点，另一个蛋白质是响应元件，它可以检测到调控区里结合的物质的存在，从而启动一系列的反应，其结果是显示双杂交蛋白中调控区是否与响应元件相结合。
二、酵母双杂交的原理
酵母双杂交的基本原理源于酵母菌的基因调控机制。
它的基本原理是，将一个结合调控区的蛋白（称为“结合蛋白”）与一个响应元件（称为“受体蛋白”）结合起来，当结合蛋白结合到调控区并激活响应元件时，酵母细胞就会对外在的细胞因子做出反应。
当结合蛋白结合调控区并激活响应元件时，酵母细胞就会产生一种光变化，从而表明蛋白质之间存在相互作用。
简单地说，酵母双杂交的原理是利用双融合蛋白将一个结合调控区的蛋白和一个响应元件结合在一起，当结合调控区的蛋白结合到结合调控区时，响应元件就会激活，酵母细胞就会产生一些外在细胞因子，如光变化。
从而可以检测到蛋白质之间发生相互作用。
三、酵母双杂交的应用
酵母双杂交技术的应用非常广泛，可以用来验证和确定蛋白质之
间的相互作用，也可以用来研究蛋白的结构和功能，并有助于发现新的药物靶标。
此外，它也可以用于研究基因调控机制，研究染色体的结构，以及研究蛋白质和核酸之间的相互作用等。
蛋白质相互作用的研究技术
蛋白质相互作用的研究技术蛋白质相互作用是生物学研究中非常重要的一部分，因为它们决定了生命体系的许多方面，包括代谢、信号传递、免疫系统等等。
我们现在已经掌握了许多研究蛋白质相互作用的技术，下面我将向大家介绍其中一些最常用的技术。
1. Yeast two-hybrid 系统其中一个最经典的技术是酵母双杂交（yeast two-hybrid）系统。
这个技术建立在分离的DNA结合因子的研究的基础上，可以用于鉴定在活菌中两个蛋白质之间的相互作用。
这个系统包含了两个向量，各自含有一个蛋白质位（bait）和一个激活域（activation domain）。
在酵母细胞内，如果两个蛋白相互作用，那么它们就会与两个向量中的蛋白位结合并激活报告基因。
这个系统的优点是可以用来筛选大量蛋白相互作用，但是它也存在着很多技术限制，包括许多假阳性结果以及只能够进行体外实验等。
2. 活细胞荧光共振能量转移在本世纪初，生物学家们提出了一种新的相互作用检测技术——活细胞荧光共振能量转移（FRET）方法。
这个技术允许研究者在活细胞内非破坏性地观察蛋白质相互作用。
FRET基于感应荧光转移的原理，其中某种荧光染料（典型地是青蛋白和黄蛋白的荧光蛋白）被用作捕捉分子，取代了盈余的分子。
如果这两种染料接近，捕捉的黄色荧光就会受到蓝色荧光的兴奋态激发，并且可见光释放出能量变为绿色光。
这个方法可以通过光学显微镜来观察细胞中光谱成分的变化，从而证明有哪些分子相互作用。
由于活细胞荧光共振能量转移可以在细胞内部进行，使其具有无与伦比的优势，尤其是在体内试验中获得成功。
3. 质谱相互作用分析质谱相互作用分析（mass spectrometry-based interactomics）相对于其他无损方法更微不足道，它可以检测和鉴定蛋白之间的相互作用。
质谱相互作用分析就是要首先在细胞质中富集出一个基因编码的蛋白复合物，再将这个复合物分离开来，通过蒸馏、凝胶过滤等技术将它们分离成单独的蛋白质单元，然后将它们进行电泳，然后通过质谱仪来分析，这个技术在体外实验中被广泛使用。
一 酵母双杂交系统原理 (Yeast Two-hybrid System)
t r a n s c r i p t i o n a c t i v a t o r
a c t i v a t i o n d o m a i n
D N A b i n d i n g d o m a i n
U A S ( u p s t r e a m a c t i v a t i o n s e q u e n c e )
His, β-gal
Y
t h u s f o r m i n g a f u n c t i o n a l t r a n s c r i p t i o n a c t i v a t o r . . . X
Y
do we get expression of the reporter?
r e p o r t e r g e n e
一. 酵母双杂交系统原理
(Yeast Two-hybrid System)
生物谷谷友：jnulynnem:
a genetic assay for detecting protein-protein interactions
Suppose we have two proteins...
X
Y
and the question, do these two protein bind each other?
One way of answering this question is to use the yeast two hybrid method.
To understand the method we must first consider how gene expression is regulated in yeast......
酵母双杂交体系Yeasttwo-hybridsystem酵母双杂交
转录因子
能直接或间接辨认和结合上游区段DNA 的蛋白质----反式作用因子. 其中能直接或间接与RNA聚合酶结合的 称为转录因子(TF). 相应于RNA聚合酶ⅠⅡⅢ的转录因子为 TF Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ 真核生物的TFⅡ又分为TFⅡ A与TFⅡ B
真核生物转录起始前复合物
GAL1 UAS
（上游激活序列）
启动子
Lac Z(报告基因)
缺陷型宿主菌株
常见的有SF562和HF7c. 特点： 无表达GAL4转录激活因子的能力
载体------穿梭质粒
pGBT9, 又称DNA-BD质粒载体。靶基 因插入可与GAL4-BD形成融合蛋白Ⅰ。 pGAD424，又称AD质粒载体。靶基因 插入可与GAL4-AD形成融合蛋白Ⅱ。 二者均可在大肠杆菌和酿酒酵母中自主复 制。 两种融合蛋白可在酵母中高表达。在核定 位序列作用下，进入酵母细胞核内。
用DNA重组技术，将DNA-BD和AD分 开，并放在同一宿主细胞中表达。
将编码DNA-BD的基因与已知蛋白质 Bait protein的基因构建在同一个表达 载体上，在酵母中表达两者的融合蛋白 BD-Bait proteiRARY表达载体上。
基本原理
DNA结合域（DNA-BD）：N端1-147 氨基酸 转录激活域（AD）：C端786-881氨基 酸
DNA-BD：识别GAL4效应基因上游的 激活序列（UAS） ，并与之结合 AD：通过同转录机制(transcription machinery)的其它成分之间的结合以启 动上游激活序列（UAS）下游的基因转录。
酵母双杂交 Yeast Two hybrids
反向酵母双杂交的例子：
1）酵母URA3基因表达产物是尿嘧啶合成所必需的 ， 同时它又可催化5-氟乳清酸(5-FOA)转化为有毒 物质。Vidal等构建了一酵母细胞株， 其URA3的表 达由含GAL4结合位点的启动子严密控制。 2）在缺乏尿嘧啶的培养基中，细胞培育需要GAL4 激活结构域(GAD)和GAL4 DNA结合结构域(GBD) 的融合蛋白的相互作用的表达。而在含5-FOA的完 全培养基中则受GAD和GBD融合蛋白相互作用的 抑制。因此可通过筛选5-FOA抗性克隆从随机突变 库中鉴定阻断蛋白相互作用的突变体。
免疫共沉淀的一般流程： 在细胞裂解液中加入抗兴趣蛋白的抗体，孵 育后再加入与抗体Fc段特异结合的结合于 Agarose珠上的Protein A或G，若细胞中有与 兴趣蛋白结合的目的蛋白，就可以形成这样 一种复合物：“目的蛋白—兴趣蛋白—抗兴 趣蛋白抗体—Protein A或G”，经变性聚丙烯 酰胺凝胶电泳，复合物又被分开。然后经免 疫印迹或质谱检测目的蛋白。
You can use the system to: Test for interactions between two proteins for which you have the genes. Screen a protein from a expression library which interacts with a protein you have.
GST Pull down 原理示意图
GST Pull down 中的实验对照
GST-Pull down的应用：
1）确定融合（或探针）蛋白与未知（或 靶）蛋白间的新的相互作用 2）证实探针蛋白与已知蛋白质间可疑的 相互作用
2） Co-Immunoprecipitation
博士硕士研究生入学考试-细胞生物学-简答论述及参考答案
1.简述酵母双杂交系统原理及应用答：酵母双杂交系统（yeast two-hybrid system）是在酵母体内分析蛋白质-蛋白质相互作用的基因系统，也是一个基于转录因子模块结构的遗传学方法。
酵母双杂交系统的建立得力于对真核细胞调控转录起始过程的认识。
许多真核生物的转录激活因子都是由两个可以分开的、功能上相互独立的结构域(domain)组成的。
例如，酵母的转录激活因子GAL4，在N端有一个由147个氨基酸组成的DNA结合域(DNA binding domain,BD)，C端有一个由113个氨基酸组成的转录激活域(transcription activation domain,AD)。
GAL4分子的DNA结合域可以和上游激活序列(upstream activating sequence，UAS)结合，而转录激活域则能激活UAS下游的基因进行转录。
但是，单独的DNA结合域不能激活基因转录，单独的转录激活域也不能激活UAS的下游基因，它们之间只有通过某种方式结合在一起才具有完整的转录激活因子的功能。
酵母双杂交系统正是利用了GAL4的功能特点，通过两个杂交蛋白在酵母细胞中的相互结合及对报告基因的转录激活来捕获新的蛋白质。
2.miRNA、siRNA、dsRNA、shRNA的区别和联系答：miRNA，siRNA，dsRNA和shRNA都是RNA干扰技术中用到的小分子RNA，其不同之处在miRNA 是单链RNA，其余均为双链RNA；siRNA和dsRNA相似；shRNA需通过载体导入细胞后，然后利用细胞内的酶切机制得到siRNA而最终发挥RNA干扰作用。
3.试述磷酸酰肌醇双信号通路的基本内容及功能答：在这一信号转导途径中,膜受体与其相应的第一信使分子结合后，激活膜上的Gp蛋白(一种G蛋白),然后由Gq蛋白激活磷酸脂酶Cβ (phospholipase Cβ, PLC), 将膜上的脂酰肌醇4,5-二磷酸(phosphatidylinositol biphosphate, PIP2)分解为两个细胞内的第二信使：二酰甘油( diacylglycerol, DAG)和1,4,5-三磷酸肌醇(IP3)。
酵母双杂交体系
酵母双杂交系统
技术步骤
应用
酵母双杂交系统能在体内测定蛋白质的结合作用，具有高度敏感性。
主要是由于：
①采用高拷贝和强启动子的表达载体使杂合蛋白过量表达。
②信号测定是在自然平衡浓度条件下进行，而如免疫共沉淀等物理方法为达到此条件需进行多次洗涤，降低了信号强度。
③杂交蛋白间稳定度可被激活结构域和结合结构域结合形成转录起始复合物而增强，后者又与启动子DNA结合，此三元复合体使其中各组分的结合趋于稳定。
④通过mRNA产生多种稳定的酶使信号放大。
同时，酵母表型， X-Gal及HIS3蛋白表达等检测方法均很敏感。
酵母双杂交实验原理及具体步骤
酵母双杂交原理：酵母双杂交（Yeast two-hybrid，Y2H）是一种常用的蛋白质相互作用研究技术，用于检测蛋白质间的物理相互作用关系。
其原理基于转录因子的两个功能域的可拆分性。
①转录因子可拆分性：构建酵母诱饵（bait）和猎物（prey）表达载体：将目标蛋白分别将其编码序列分别克隆到两个表达载体中。
其中，诱饵载体通常包含一个“催化域”（activation domain，AD），用于连接目标蛋白和转录激活子域；猎物载体通常包含一个“DNA结合域”（DNA binding domain，BD），与转录因子的靶位点序列结合。
通过将目标蛋白的相互作用引入到转录因子中，可以重新组装功能域并激活报告基因表达。
②目标蛋白的诱饵和猎物构建：将目标蛋白分别克隆到诱饵载体和猎物载体中。
诱饵载体中的目标蛋白与BD结合，形成诱饵蛋白-BD复合物；猎物载体中的目标蛋白与AD结合，形成猎物蛋白-AD复合物。
③互补的转录因子和报告基因：将诱饵和猎物载体转化到同一酵母细胞中，诱饵蛋白与猎物蛋白发生相互作用后，诱饵蛋白的BD域与猎物蛋白的AD域重新组装为完整的转录因子。
该转录因子能够结合到特定的报告基因启动子上，激活报告基因的表达。
④报告基因表达和筛选：通过培养在所选的选择性培养基上，只有发生了特定蛋白相互作用的酵母细胞才能生长。
选择性培养基可能缺乏某些必需营养物质，当酵母菌株与目标蛋白质发生相互作用时，新的遗传特征和功能产物的表达则能够弥补酵母细胞在选择性培养基上的缺陷。
例如，当使用缺乏组氨酸（histidine）的培养基时，只有酵母菌株表达了完整的转录因子，才能够合成组氨酸并正常生长。
⑤结果验证：据此可以筛选出具有蛋白相互作用的酵母突变株。
验证通常通过进一步的亲和试验（如共免疫沉淀）或其他技术（如荧光共定位）来确认蛋白质相互作用的可靠性。
总体来说，酵母双杂交实验通过利用转录因子可拆分性的原理来检测蛋白质的相互作用。
酵母双杂交原理
酵母双杂交原理酵母双杂交原理（Yeasttwo-hybridsystem）是由Levinthal和Briggs于1993年提出，用于发掘蛋白质们之间的相互作用的一种方法。
它运用一种特殊的载体来拆分蛋白质，再将其放入酵母菌中，使得蛋白质能够彼此结合成复合物。
事实上，酵母双杂交原理可以揭示特定蛋白质之间的非结构化但重要的功能关系，它是生物学研究工作中非常有用的工具。
酵母双杂交原理的主要原理酵母双杂交原理的主要原理是将两个蛋白质分别放入一个载体中，然后将该载体放入到酵母菌中进行杂交。
其中，一个蛋白质被称为“bait”，另外一个被称为“prey”。
接着，这些杂交菌就会分泌两个蛋白质，这就产生了蛋白质结合的可能性。
如果两个蛋白质能够结合在一起，就可以通过一定的实验手段来证明它们之间有相互作用。
酵母双杂交原理的研究和应用自酵母双杂交原理被提出以来，它已经被广泛应用于生物学研究中，包括蛋白质结构功能的发现，以及调控细胞过程的研究。
例如，可以使用酵母双杂交技术来研究两个蛋白质之间的相互作用，以确定其中一个蛋白质是如何影响另一个蛋白质的表达和活性的，以及揭示蛋白质在细胞中所扮演的角色。
除此之外，酵母双杂交原理也用于药物开发中，如通过这种方法可以确定蛋白质之间的作用以及药物靶点，进而开发新的抗病毒药物。
此外，酵母双杂交也可以用于研究提供最终产物的基因，以及了解某种特定基因表达所需的调控因子。
结论总之，酵母双杂交原理是一种可以检测不同蛋白质间功能关系的分子生物学技术，目前它已被广泛应用于分子生物学研究和药物开发中，以及研究调控细胞过程。
未来，这种技术将会进一步完善，为生物学研究和药物开发带来更多的希望和机遇。
酵母双杂交系统(参考资料)
GENBANK序号 序号
NM_003282
P1 P5 P6 P1
16
800.000 700.000 β-G al Ac tivi ty ( Unit) 600.000 500.000 400.000 300.000 200.000 100.000 0.000 E1 E4 E8 E9 E11 E15 E17 E21 E22
10
11
以粒pGBT9-ERRα1/LBD的准备
DBD
LBD
PCR
ERRα1/LBD
13
14
2. 结果 2.1 酵母双杂交试验结果
A
A：在SD/-Leu/-Trp平板上接种的24个His+阳性克隆
B
15
B：菌落滤膜影印后X-gal/Z 缓冲液显色法共有17个克隆在8h之内变蓝
克隆序号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12. 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24
克隆编号 E1-3* E2-2 E2-5 * E4-1 * E8-1 * E9-3 * E10-2* E11-3 * E11-4 E12 -1 * E13-1 * E13-2 E14-1 * E15-3* E17-2* E17-3 E18-1* E18-2 E18-3 E20-5 * E21-3 E21-10 * E22-5 * E23-2 *
2
Yeast two-hybrid system:
a genetic assay for detecting protein-protein interactions
Regulation of gene expression in yeast
transcription activator
酵母双杂交系统的原理
酵母双杂交系统的原理酵母双杂交(systems)系统是一种基于酵母(yeast)细胞的生物技术，该技术用于研究蛋白质相互影响及其在蛋白质互作网络中的作用。
该技术采用重组DNA 技术将目标基因插入酵母细胞的基因组内，在酵母细胞内表达融合蛋白，通过检测融合蛋白的相互作用来分析蛋白质间的相互作用关系。
酵母双杂交系统的原理：酵母双杂交系统(principle of yeast two-hybrid system)基于蛋白质间的相互作用原理，其中包括：转录调控、信号传递及代谢途径等方面。
首先需要构建两个载体，一个是酵母转录因子的DNA结合结构域（BD）融合载体，另一个则是酵母活化装置的活化结构域（AD）融合载体。
在BD载体中含有一个目标基因的蛋白质结构域，该载体专门用于识别具有相互作用能力的肽链。
这个肽链是作为目标基因的蛋白质结构域插入到BD载体的后端，从而形成一个融合蛋白(BD-Target)。
在AD载体则含有另一目标基因的蛋白质结构域，该结构域是作为另一个相互作用配体的蛋白质结构域插入到AD载体的后端，并形成一个融合蛋白(AD-Target)。
当两个融合蛋白(BD-Target和AD-Target)进入同一个酵母细胞时，它们会自行相互结合。
这种相互结合会使BD域融合物释放出其与DNA结合的传输活性。
该生物技术利用此原理，通过分离酵母细胞中的mRNA，并对其进行筛查确定其结合后的特异性。
同时，酵母细胞也会检测信息的转移，并以此促进由两个融合蛋白之间的相互作用而激活的报告基因的表达。
这些报告基因可以编码酵母细胞中可见性较高的荧光蛋白，从而方便检测生物体中的酵母如何解释信号。
酵母双杂交系统的优势：酵母双杂交系统是一种非常有用的方法，可以在操作简单的情况下，高效地分析蛋白质间的相互作用及其生物学意义。
酵母双杂交系统的优点如下：1.可高效筛选蛋白质相互作用：酵母双杂交系统在高通量筛选系统中表现出良好的性能表现；这表明可以将其用于大规模筛选目标蛋白质相互作用蛋白。
第一实验：酵母双杂交（YeastTwo-Hybrid）
第一实验：酵母双杂交（Yeast Two-Hybrid）一、目的掌握酵母双杂交原理和方法。
利用酵母双杂交方法在拟南芥转录因子AP2-EREBP家族中筛选与拟南芥Med25有相互作用的蛋白。
二、原理酵母双杂交系统由 Fields和Song等首先在研究真核基因转录调控中建立。
典型的真核生物转录因子，如GAL4、GCN4等都含有二个不同的结构域: DNA结合结构域(DNA-binding domain，DBD)和转录激活结构域(transcription-activating domain，AD)。
DNA结合结构域可识别DNA上的特异序列，并使转录激活结构域定位于所调节的基因的上游，转录激活结构域可同转录复合体的其他成分作用，启动它所调节的基因的转录。
二个结构域可在其连接区适当部位断开，仍具有各自的功能。
将两个待测蛋白分别与这两个结构域组成融合蛋白，并共表达于同一个酵母细胞内。
如果两个待测蛋白间能发生相互作用，就会通过待测蛋白的桥梁作用使AD与DBD形成一个完整的转录激活因子并激活相应的报告基因表达。
通过对报告基因表型的测定可以知道待测蛋白分子间是否发生了相互作用。
图 1-1 酵母双杂交基本原理酵母双杂交系统在发展中增添了接合型酵母双杂交和反向酵母双杂交系统。
其中接合型双杂交系统就是已预先将文库转化了某个接合型的单倍体酵母，然后再和转化了诱饵质粒的相反接合型的单倍体进行接合，形成二倍体，并检测报告基因的表达。
酵母双杂交系统由三个部分组成：(1)与DBD融合的蛋白表达载体，被表达的蛋白称诱饵蛋白(bait)。
(2)与AD融合的蛋白表达载体，被表达的蛋白称靶蛋白(prey)。
(3)带有一个或多个报告基因的宿主菌株。
常用的报告基因有HIS3，URA3，LacZ和ADE2等。
而菌株则具有相应的缺陷型。
双杂交质粒上分别带有不同的抗性基因和营养标记基因。
这些有利于实验后期杂交质粒的鉴定与分离。
酵母双杂交系统常应用在：(1)研究两个已知蛋白是否存在相互作用，同一蛋白是否有自身相互作用以及相互作用的分子区域。
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同时用上述两种载体转化改造后的酵
母，这种改造后的酵母细胞的基因组 中不能产生GAL4结合形成杂种 蛋白，与GAL1的UAS序列结合，但由于无 AD的参与，报告基因不转录。 蛋白质X DNA-BD
基本原理
DNA结合域（DNA-BD）：N端1-147 氨基酸 转录激活域（AD）：C端786-881氨基 酸
DNA-BD：识别GAL4效应基因上游的 激活序列（UAS） ，并与之结合 AD：通过同转录机制(transcription machinery)的其它成分之间的结合以启 动上游激活序列（UAS）下游的基因转录。
用DNA重组技术，将DNA-BD和AD分 开，并放在同一宿主细胞中表达。
将编码DNA-BD的基因与已知蛋白质 Bait protein的基因构建在同一个表达 载体上，在酵母中表达两者的融合蛋白 BD-Bait proteiRARY表达载体上。
上游更远处 增强子 统称顺式作用元件
转录因子
能直接或间接辨认和结合上游区段DNA 的蛋白质----反式作用因子. 其中能直接或间接与RNA聚合酶结合的 称为转录因子(TF). 相应于RNA聚合酶ⅠⅡⅢ的转录因子为 TF Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ 真核生物的TFⅡ又分为TFⅡ A与TFⅡ B
真核生物转录起始前复合物
（ADH1:醇脱氢酶1）
实验程序
1 2 3 4 5
分别重组两种穿梭质粒载体。 分别导入E.coli培养。 分别提取两种质粒。 转化酵母菌 筛选阳性克隆
应用---蛋白质相互作用
筛选单抗 蛋白质-蛋白质相互作用 筛选酶抑制剂
…
GAL1 UAS
（上游激活序列） 启动子
Lac Z(报告基因)
GAL4的AD同蛋白质Y结合，形成的杂种蛋 白，未与UAS序列结合，不能启动报导基因 转录。
AD 蛋白质Y
GAL1 UAS
（上游激活序列）
启动子
Lac Z(报告基因)
通过此两个杂种蛋白中的X与Y的相互作用， 在细胞内重建了GAL4的功能，启动报导基 因表达。
GAL1 UAS
（上游激活序列）
启动子
Lac Z(报告基因)
缺陷型宿主菌株
常见的有SF562和HF7c. 特点： 无表达GAL4转录激活因子的能力
载体------穿梭质粒
pGBT9, 又称DNA-BD质粒载体。靶基 因插入可与GAL4-BD形成融合蛋白Ⅰ。 pGAD424，又称AD质粒载体。靶基因 插入可与GAL4-AD形成融合蛋白Ⅱ。 二者均可在大肠杆菌和酿酒酵母中自主复 制。 两种融合蛋白可在酵母中高表达。在核定 位序列作用下，进入酵母细胞核内。
两个结构域
DNA结合结构域(DNA-binding domain， BD) 一个或多个与其他调控蛋白相互作用的转录激 活结构域(activation domain，AD)
酵母转录因子GAL4结构特点
GAL4包括两个彼此分离的但功能必需的 结构域. 两结构域：DNA结合域 转录激活域 特点：结构上可分开、功能上相互独立
酵母双杂交体系
Yeast two-hybrid system
酵母双杂交 (yeast two hybrid) 技术是利 用酵母遗传学方法分析蛋白质之间的相互作 用的技术.
背景知识
真核生物转录起始前区域结构: -25bp区有：TATA 序列 称为 Hogness盒或TATA box，为启动子核 心序列。
TFⅡD识别TATA TFⅡD-ⅡA-ⅡB-DNA复合体 TFⅡB为桥梁并提供结合表面,促使 TFⅡF-RNA pol复合结构进入启动子核 心区TATA. TFⅡE的ATPase分解ATP,解开DNA双 螺旋. TFⅡH进入完成转录起始前复合物(PIC) 启动合成RNA第一个碱基.
真核转录因子的结构域