人源性单克隆抗体和基因工程抗体
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单克隆化
扩大培养 有限稀释
单克隆化
由单一细胞 长成
16
Fab抗体分子的制备来自百度文库
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利用基因工程制备单链抗体(ScFv)
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4
4. 构建转人Ig基因组小鼠
▶ 将改造过的人的抗体基因组导入小鼠胚胎，得 到在免疫后能产生人抗体的转基因小鼠。改造 过的抗体除了构成抗原识别与抗原结合部位的 三个互补决定区(CDR)是鼠源的以外，其余部 分均是人源的。
▶ 用人Ig基因组取代小鼠Ig基因组获得转基因小鼠， 以后仅需免疫小鼠制作单克隆抗体，但获得的 是人抗体而非小鼠抗体。该技术难度较大，但 已有成功的报道。
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人－鼠嵌合抗体的制备
9
2. 改型抗体：
也称CDR移植。用鼠源的CDR(可 变区中和抗原互补结合构成抗原结合部 位的部分）取代人抗体中相应的CDR部 位，使得抗体中除构成抗原结合部位的 3个CDR是鼠源以外，其余均为人源。 这种抗体在人体内免疫性大大降低。
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改型抗体（CDR移植）
11
3. 抗体片段：
13
14
5. 表位印模选择技术：
用特定的已知抗原从抗体组合文库中 或噬菌体抗体文库中筛选所需抗体，通过 抗体可变区与抗原结合及编码轻、重链可 变区鼠源性与人源性基因置换、匹配，从 而获得能与抗原特异性反应的人源性抗体， 将筛选到的含人轻、重链基因的质粒转染 到骨髓瘤SP2/0细胞中，该细胞即可产生人 单克隆抗体。
5
5. 严重免疫缺陷小鼠制备人单克隆抗体：
SCID小鼠具有严重免疫缺陷，对外源 组织无免疫排斥反应，故这种小鼠可接受 人体组织或器官移植，形成人－鼠嵌合体 小鼠。将人免疫干细胞移植到SCID小鼠体 内，SCID小鼠获得了人的免疫系统。这种 小鼠可用任何抗原免疫，从激活的淋巴细 胞中富集抗原特异性人源性B淋巴细胞，进 一步进行细胞融合或制备抗体库。
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4. 噬菌体抗体文库技术
体外建立一个相应于体内B细胞库的抗体库， 从中筛选所需要的抗体。利用PCR扩增重链和轻 链的cDNA，并插入到噬菌体外壳蛋白的编码基 因中，然后感染E. coli，使抗体基因的表达产物 和外壳蛋白一起融合展示在噬菌体表面，成为噬 菌体抗体。通过固相化的抗原进行筛选，不能结 合抗原的噬菌体被洗去，结合的噬菌体被洗脱下 来再次感染细菌进行扩增，多次吸附－洗脱－扩 增后可获得所要的抗原特异性的噬菌体抗体。这 些抗体可以做到全部为人源的。
技术同鼠－鼠杂交瘤，亲本骨髓瘤细 胞主要有来自小鼠的骨髓瘤653、SP2/0、 NS-1，来自大鼠的骨髓瘤Y3Ag1.2.3等； 亲本B细胞来源于人外周血淋巴细胞、淋 巴结细胞、脾细胞。但人－鼠杂交瘤的单 克隆抗体分泌性能不稳定，多数情况下由 于人染色体的丢失导致杂交瘤细胞失去分 泌抗体的能力。
3
3. 人－人杂交瘤单克隆抗体：
四、人源性单克隆抗体 和基因工程抗体
1
(一) 、人源性单克隆抗体 1. EB病毒转化技术：
利用类似于疱疹病毒的EB病毒在体 外直接感染人外周血淋巴细胞（来源于淋 巴结、扁桃体、脐带血、外周血等），使 之转化获得永生能力得到人B淋巴细胞系， 这些细胞可在体外分泌人抗体。
2
2. 人－鼠杂交瘤单克隆抗体：
Fab抗体：抗体Y形的两个臂称为Fab，它由 可变区和小部分的恒定区组成，利用基因工 程的方法构建具有可变区和小部分恒定区的 Fab抗体，这样的抗体仍具有特异结合抗原的 特性。 单链抗体(ScFv)：用短肽接头[常用(Gly4Ser)3] 将重链可变区和轻链可变区相连，使其分子 变小，更有利于穿透组织和清除，而且易构 建表达；但亲和力会出现一定的下降。
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(二)、基因工程抗体
基因工程抗体是利用基因工程 的手段获得人源性抗体，主要包括 以下几个方面：人－鼠嵌合抗体、 改型抗体、抗体片段、噬菌体抗体 文库技术、表位印迹选择技术等。
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1. 人－鼠嵌合抗体：
抗体的重轻链构成的可变区(V区)与识 别抗原有关，具有特异性；而恒定区(C区) 与效应功能有关。人－鼠嵌合抗体就是通 过人工改造使抗体的V区是鼠源的，而C 区是人源的。如此改造的嵌合抗体保留了 原来鼠源单克隆抗体的特异性和亲和力， 人抗小鼠抗体反应(HAMA)也明显减弱。
人－人杂交瘤操作步骤基本上与小鼠－小鼠 杂交瘤技术相同，使用人的骨髓瘤细胞与人的B 淋巴细胞融合；但可供利用的人骨髓瘤细胞种类 非常有限，人的骨髓瘤细胞在融合率、非分泌型 方面仍不及小鼠骨髓瘤细胞，而且人不能像小鼠 那样进行高度免疫，B淋巴细胞常限于取自外周 血(小鼠取自动物脾脏)，激活状态不适合做融合； 故人－人杂交瘤细胞在融合、融合后的筛选以及 融合细胞分泌抗体方面仍不理想。
单克隆化
扩大培养 有限稀释
单克隆化
由单一细胞 长成
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Fab抗体分子的制备来自百度文库
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利用基因工程制备单链抗体(ScFv)
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4. 构建转人Ig基因组小鼠
▶ 将改造过的人的抗体基因组导入小鼠胚胎，得 到在免疫后能产生人抗体的转基因小鼠。改造 过的抗体除了构成抗原识别与抗原结合部位的 三个互补决定区(CDR)是鼠源的以外，其余部 分均是人源的。
▶ 用人Ig基因组取代小鼠Ig基因组获得转基因小鼠， 以后仅需免疫小鼠制作单克隆抗体，但获得的 是人抗体而非小鼠抗体。该技术难度较大，但 已有成功的报道。
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人－鼠嵌合抗体的制备
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2. 改型抗体：
也称CDR移植。用鼠源的CDR(可 变区中和抗原互补结合构成抗原结合部 位的部分）取代人抗体中相应的CDR部 位，使得抗体中除构成抗原结合部位的 3个CDR是鼠源以外，其余均为人源。 这种抗体在人体内免疫性大大降低。
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改型抗体（CDR移植）
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3. 抗体片段：
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5. 表位印模选择技术：
用特定的已知抗原从抗体组合文库中 或噬菌体抗体文库中筛选所需抗体，通过 抗体可变区与抗原结合及编码轻、重链可 变区鼠源性与人源性基因置换、匹配，从 而获得能与抗原特异性反应的人源性抗体， 将筛选到的含人轻、重链基因的质粒转染 到骨髓瘤SP2/0细胞中，该细胞即可产生人 单克隆抗体。
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5. 严重免疫缺陷小鼠制备人单克隆抗体：
SCID小鼠具有严重免疫缺陷，对外源 组织无免疫排斥反应，故这种小鼠可接受 人体组织或器官移植，形成人－鼠嵌合体 小鼠。将人免疫干细胞移植到SCID小鼠体 内，SCID小鼠获得了人的免疫系统。这种 小鼠可用任何抗原免疫，从激活的淋巴细 胞中富集抗原特异性人源性B淋巴细胞，进 一步进行细胞融合或制备抗体库。
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4. 噬菌体抗体文库技术
体外建立一个相应于体内B细胞库的抗体库， 从中筛选所需要的抗体。利用PCR扩增重链和轻 链的cDNA，并插入到噬菌体外壳蛋白的编码基 因中，然后感染E. coli，使抗体基因的表达产物 和外壳蛋白一起融合展示在噬菌体表面，成为噬 菌体抗体。通过固相化的抗原进行筛选，不能结 合抗原的噬菌体被洗去，结合的噬菌体被洗脱下 来再次感染细菌进行扩增，多次吸附－洗脱－扩 增后可获得所要的抗原特异性的噬菌体抗体。这 些抗体可以做到全部为人源的。
技术同鼠－鼠杂交瘤，亲本骨髓瘤细 胞主要有来自小鼠的骨髓瘤653、SP2/0、 NS-1，来自大鼠的骨髓瘤Y3Ag1.2.3等； 亲本B细胞来源于人外周血淋巴细胞、淋 巴结细胞、脾细胞。但人－鼠杂交瘤的单 克隆抗体分泌性能不稳定，多数情况下由 于人染色体的丢失导致杂交瘤细胞失去分 泌抗体的能力。
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3. 人－人杂交瘤单克隆抗体：
四、人源性单克隆抗体 和基因工程抗体
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(一) 、人源性单克隆抗体 1. EB病毒转化技术：
利用类似于疱疹病毒的EB病毒在体 外直接感染人外周血淋巴细胞（来源于淋 巴结、扁桃体、脐带血、外周血等），使 之转化获得永生能力得到人B淋巴细胞系， 这些细胞可在体外分泌人抗体。
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2. 人－鼠杂交瘤单克隆抗体：
Fab抗体：抗体Y形的两个臂称为Fab，它由 可变区和小部分的恒定区组成，利用基因工 程的方法构建具有可变区和小部分恒定区的 Fab抗体，这样的抗体仍具有特异结合抗原的 特性。 单链抗体(ScFv)：用短肽接头[常用(Gly4Ser)3] 将重链可变区和轻链可变区相连，使其分子 变小，更有利于穿透组织和清除，而且易构 建表达；但亲和力会出现一定的下降。
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(二)、基因工程抗体
基因工程抗体是利用基因工程 的手段获得人源性抗体，主要包括 以下几个方面：人－鼠嵌合抗体、 改型抗体、抗体片段、噬菌体抗体 文库技术、表位印迹选择技术等。
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1. 人－鼠嵌合抗体：
抗体的重轻链构成的可变区(V区)与识 别抗原有关，具有特异性；而恒定区(C区) 与效应功能有关。人－鼠嵌合抗体就是通 过人工改造使抗体的V区是鼠源的，而C 区是人源的。如此改造的嵌合抗体保留了 原来鼠源单克隆抗体的特异性和亲和力， 人抗小鼠抗体反应(HAMA)也明显减弱。
人－人杂交瘤操作步骤基本上与小鼠－小鼠 杂交瘤技术相同，使用人的骨髓瘤细胞与人的B 淋巴细胞融合；但可供利用的人骨髓瘤细胞种类 非常有限，人的骨髓瘤细胞在融合率、非分泌型 方面仍不及小鼠骨髓瘤细胞，而且人不能像小鼠 那样进行高度免疫，B淋巴细胞常限于取自外周 血(小鼠取自动物脾脏)，激活状态不适合做融合； 故人－人杂交瘤细胞在融合、融合后的筛选以及 融合细胞分泌抗体方面仍不理想。