GsDREB1基因的电子克隆及体内结合特异性分析[1]

GsDREB 1基因的电子克隆及体内结合特异性分析

摘要：应用电子克隆技术预测到了一个5＇端缺失的contig5，并根据栽培大豆与野生大豆相关基因相似性很高的特点，将GmDREB 1基因的5＇端序列填补到contig5片段的5＇端上，此序列命名为contig5Gm 。ORF 预测结果表明，contig5Gm 只有一个开放阅读框。经RT-PCR 验证，分别得到了与contig5和contig5Gm 大小一致的片段。经克隆、测序发现，contig5Gm 与GmDREB 1基因序列相似性为99％，将其命名为GsDREB1。利用酵母单杂交系统对GsDREB1进行了体内结合特异性分析，结果表明，GsDREB1能够与DRE 顺式作用元件发生特异性结合。

关键词：DREB ；电子克隆；野生大豆；结合特异性；转录因子中图分类号：Q786；Q785

文献标识码：A

收稿日期：2008-03-03

基金项目：国家重大基础研究专项（973）前期项目（2003CCA03500）

作者简介：李莹（1980-），女，吉林人，硕士研究生，研究方向为植物基因工程与分子生物学。

*通讯作者E-mail:lijie_neau@

转录因子又称反式作用因子，能够与真核基因启动子区域中顺式作用元件发生特异性相互作用，通过它们之间以及其他相关蛋白之间的相互作用激活或抑制转录［１］。

ＤＲＥＢ蛋白含有ＡＰ２／ＥＲＥＢＰ保守结构域，是一种极其重要的转录因子，广泛存在于被子植物中。多数ＤＲＥＢ类转录因子，如拟南芥ＤＲＥＢ１／２含有一个ＡＰ２／ＥＲＥＢＰ结构域［２－４］，通过与ＤＲＥ顺式作用元件相互作用调控相关基因表达［５］。目前在拟南芥中发现６种DREB １基因和８种DREB ２基因。ＤＲＥＢ１Ａ、ＤＲＥＢ１Ｂ和ＤＲＥＢ１Ｃ诱导冷胁迫相关基因的表达，ＣＢＦ４／ＤＲＥＢ１Ｄ与ＤＲＥＢ１Ａ有很高的同源性，含有完整的ＡＰ２／ＥＲＥＢＰ结构域，但是ＣＢＦ４／ＤＲＥＢ１Ｄ却只受冷胁迫以外的其他渗透胁迫诱导［６－７］，ＤＤＦ１／ＤＲＥＢ１Ｆ和ＤＤＦ２／ＤＲＥＢ１Ｅ受高盐胁迫诱导［７－８］。ＤＲＥＢ２Ａ和ＤＲＥＢ２Ｂ同时受干旱胁迫和高盐胁迫诱导［４］。ＤＲＥＢ２Ｃ、ＤＲＥＢ２Ｄ和ＤＲＥＢ２Ｆ在叶子中被高盐胁迫诱导，ＤＲＥＢ２Ｅ只受ＡＢＡ诱导，在根中有少量表达。Ｓａｋｕｍａ等发现ＤＲＥＢ２Ｇ和ＤＲＥＢ２Ｈ在干旱和冷胁迫诱导下并不表达［７］。最近，Ｓａｋｕｍａ等发现，ＤＲＥＢ２Ａ的Ｃ末端区域是

转录激活区，它的中间区域是负调控结构域［９］。以上研究表明，ＤＲＥＢ类转录因子基因有着相当复杂的调控机制，克隆新的DREB 基因对于阐明ＤＲＥＢ类转录因子的调控机制和植物抗渗透胁迫基因工程都有着重要的意义。

随着人类基因组测序和生物信息学技术的迅猛发展，表达序列标签（ＥＳＴ）成为人类寻找未知功能基因和克隆不同时空差异表达基因的重要途径。基于ＥＳＴ的电子克隆（in silico ｃｌｏｎｉｎｇ）策略已成为克隆新基因的主要方法。

电子克隆的技术原理是利用日益发展的生物信息学技术，借助电子计算机的巨大运算能力，通过ＥＳＴ或基因组的序列组装和拼接，利用ＲＴ－ＰＣＲ的方法快速地获得新基因［１０］。由于受到序列数据丰富度的限制，在植物领域基因克隆仍以常规的实验方法为主，但随着ＥＳＴ数据库的不断完善，利用生物信息学的方法进行某些植物基因的电子克隆已经成为可能［１１］。

本试验拟应用电子克隆技术，在耐盐野生大豆中克隆ＤＲＥＢ类转录因子基因，为ＤＲＥＢ类转录因子的调控机理研究和应用研究奠定基础。

１材料与方法

1.1材料1.1.1

植物材料

耐盐野生大豆５０１０９，由吉林省农科院提供。

李莹，才华，李

勇，李

杰*，刘西燕，田

佳

（东北农业大学生命科学学院，哈尔滨

150030）

第３9卷第11期东北农业大学学报39(11):56~61

２００8年11月Journal of Northeast Agricultural University

Nov.2008

文章编号

１００５－９３６９（２００8）11－0056－06

1.1.2载体和试剂

克隆载体ｐＭＤ１８Ｔ－ｖｅｃｔｏｒ（购自ＴａＫａＲａ）；大肠杆菌菌（E.coli）菌株ＤＨ５α；Ｔｒｉｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＳＳⅢ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）；其它试剂均为国产分析纯。ｐＨＩＳ２和ｐＧＡＤＴ７－Ｒｅｃ２均购自ＢＤ公司；３－ＡＴ购自Ｓｉｇｍａ；ｐＨＩＳ２－ＤＲＥ和ｐＨＩＳ２－ｍＤＲＥ质粒由本实验室保存。

1.2方法

1.2.1GsDREB1基因的电子克隆

通过查阅文献，寻找在栽培大豆中已经克隆到的ＤＲＥＢ类转录因子基因。以所找到的ＤＲＥＢ类转录因子基因序列为种子，以Glycine soja为限制词，在ＮＣＢＩ上的ＥＳＴ＿ｏｔｈｅｒｓ数据库中进行数据搜索，获得相关的ＥＳＴ序列。应用ＣｏｎｔｉｇＥｘｐｒｅｓｓ拼接软件对所获得的ＥＳＴ进行序列拼接，把拼接得到ｃｏｎｔｉｇｓ分别进行Ｂｌａｓｔｎ比对，根据比对结果，选出可能是ＤＲＥＢ类转录因子基因的ｃｏｎｔｉｇｓ，对其进行全长和ＯＲＦ预测。

1.2.2RT-PCR验证

取经２５０ｍｍｏｌ·Ｌ－１ＮａＣｌ处理２ｈ后的１月龄野生大豆幼苗叶片，用Ｔｒｉｚｏｌ试剂一步法提取植物总ＲＮＡ。以总ＲＮＡ为模板，经反转录得到ｃＤＮＡ（具体操作参见产品说明书）。根据ｃｏｎｔｉｇ５序列设计１对引物来验证拼接结果的正确性（见图１），同时在延伸序列ｃｏｎｔｉｇ５Ｇｍ两端设计验证引物，通过ＲＴ－ＰＣＲ扩增目的片段，而后进行基因克隆、测序。引物序列如下：

C5Gssense：5＇AACGAGGAAGGTGGTGGAG3＇

C5Gsanti1：5＇ACTCCGAGGCATCATCATCT3＇

C5Gmsense1：5＇AATCCGTTATATGCCACCTGA3＇C5Gmsense2：5＇AACCATGGAAGACAGGGATC3＇

1.2.3GsDREB1体内结合特异性分析

首先通过ＰＣＲ扩增ＤＲＥＢ转录因子基因的结构域并引入同源重组位点。根据GsDREB１基因结构域序列，设计引入同源重组位点序列的引物，注意不能使结构域序列在翻译时产生移码，一次ＰＣＲ引物序列如下（下划线部分为第一次ＰＣＲ引入同源重组位点序列）：

图1引物设计

Fig.1Primer design

ＣＺＧｓＤＲＥＢ１ｓｅｎｓｅ：５＇ＣＧＣＡＧＡＧＴＧＧＣＣＡＴＴＡＴＧＧＣＣＣＣＧＣＧＡＧＡＡＧＣＡＧＴＣＧＡＴＧＡＡＡＣ３＇ＣＺＧｓＤＲＥＢ１ａｎｔｉ－ｓｅｎｓｅ：５＇ＡＧＧＣＣＧＡＧＧＣＧＧＣＣＧＡＣＡＴＧＣＴＧＧＴＣＧＴＣＧＴＣＣＴＧＧＡＡＣＡＡＧ３＇

将一次ＰＣＲ产物稀释１００倍后为模板，进行二次ＰＣＲ扩增目的片段，二次ＰＣＲ引物序列如下（下划线部分为第二次ＰＣＲ引入同源重组位点序列）：

ＳＭＡＲＴⅢ：５＇ＴＴＣＣＡＣＣＣＡＡＧＣＡＧＴＧＧＴＡＴＣＡＡＣＧＣＡＧＡＧＴＧＧＣＣＡＴＴＡＴＧＧＣＣＣ３＇ＣＤＳⅢ：５＇ＧＴＡＴＣＧＡＴＧＣＣＣＡＣＣＣＴＣＴＡＧＡＧＧＣＣＧＡＧＧＣＧＧＣＣＧＡＣＡＴＧ３＇

将ｐＨＩＳ２－ｍＤＲＥ和ｐＨＩＳ２－ＤＲＥ载体分别与ｐＧ－ＡＤＴ７－Ｒｅｃ２载体和ＧｓＤＲＥＢ１结构域组合（见表１），共同转入酵母感受态细胞中。ｐＨＩＳ２－ｍＤＲＥ为含有突变ＤＲＥ元件的载体，ｐＨＩＳ２－ＤＲＥ为含有ＤＲＥ元件的载体，ＤＲＥ元件序列为ＴＡＣＣＧＡＣＡＴ，ｍＤＲＥ元件序列为ＴＡＴＴＴＴＣＡＴ。将转化混合液分别涂布在含有不同浓度３－ＡＴ的ＳＤ／－Ｈｉｓ／－Ｌｅｕ／－Ｔｒｐ固体培养基中，３０℃培养１周，并观察菌落在固体培养基上的生长情况。载体ｐＧＡＤＴ７－Ｒｅｃ２用ｓｍａｌＩ线性化，质粒ｐＨＩＳ２－ＤＲＥ和ｐＨＩＳ２－ｍＤＲＥ的提取均为分子生物学常规操作，酵母感受态细胞的制备和转化方参见ＢＤＭａｔｃｈｍａｋｅｒＴＭＬｉｂｒａｒｙＣｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ＆ＳｃｒｅｅｎｉｎｇＫｉｔＵｓｅｒＭａｎｕａｌ。

２结果与分析

2.1GsDREB1基因的电子克隆

通过查阅文献，获得了５个栽培大豆ＤＲＥＢ类转录因子基因。在ＮＣＢＩ上搜索这５条转录因子基因序列，基因序列号分别为：GmDREBa（ＡＹ５４２８８６）、GmDREBc（ＡＹ２４４７６０）、GmDREBb（ＡＹ２９６６５１）、GmDREB2（ＤＱ０５４３６３）、GmDREB1（ＡＦ５１４９０８）。

分别以这５条ＤＲＥＢ类转录因子基因序列为种子，以Glycine soja为限制词，在ＮＣＢＩ上的ＥＳＴ＿ｏｔｈｅｒｓ

李莹等：GsDREB１基因的电子克隆及体内结合特异性分析

第11期·57·