Elispot 酶联免疫斑点扫描图像分析仪
酶联免疫斑点检测技术对结核性脑膜炎的诊断分析
酶联免疫斑点检测技术对结核性脑膜炎的诊断分析结核性脑膜炎是由结核分枝杆菌感染引起的一种病毒性脑膜炎，其症状包括头痛、发热、恶心、呕吐、抽搐等，严重时可导致神经系统和认知功能损伤。
因为该病的症状常常类似于其他病毒性脑膜炎症状，难以通过临床症状来确诊，因此需要靠特定的实验室检测方法进行诊断。
酶联免疫斑点检测技术（Enzyme-Linked Immunospot Assay，ELISPOT）是一种用于检测细胞因子、抗体、蛋白质等的生物分子的定量分析方法，其原理是通过特定的抗体捕获被检分子，进行显色反应并计数，从而得出样品中所含目标分子的浓度。
这种技术可以用于检测具体的细胞因子、蛋白质等分子，对于结核性脑膜炎的诊断也有很高的应用价值。
在酶联免疫斑点检测技术中，将患者血清样本与结核分枝杆菌特异性抗原结合，使得与该菌感染相关的蛋白质或抗体形成复合物，然后通过酶标记的特异性二抗捕获复合物并显色。
若样品中含有结核分枝杆菌特异性抗体，则会形成具有分子特异性的抗体斑点，否则则不会有这些斑点。
因此，结核性脑膜炎患者的血清样品所形成的斑点数量越多，就越可以证明该患者存在结核分枝杆菌感染的可能性。
酶联免疫斑点检测技术有许多的优势。
首先，该技术有很强的特异性和灵敏度，可以精确地检测出异物样本中特定的分子。
其次，该技术操作简单、快捷，样本数量也可以灵活调整。
此外，该技术可以在早期诊断结核性脑膜炎疾病，有很高的临床应用价值。
但是，该技术也存在一些问题。
首先，人体有时会出现假阳性反应，导致并不表示其真实感染结核分枝杆菌，这需要通过配合其他临床方法来确定是否为真实感染。
此外，该技术的检测结果可能受到患者病情、抗体水平等因素的影响，需要在检测前进行充分的预处理和准备。
总的来说，酶联免疫斑点检测技术在结核性脑膜炎的诊断中有很高的应用价值。
虽然该技术还有一些问题需要解决，但已经成为了现代医疗技术的一种重要手段，为临床医生提供准确的疾病诊断和治疗建议。
elispot的原理及应用
Elispot的原理及应用1. Elispot是什么Elispot（enzyme-linked immune spot assay）是一种用于测定单个细胞的分泌功能的实验技术。
它通过检测分泌细胞在特定条件下产生的细胞因子或细胞分泌物的分泌量，来评估细胞的免疫反应。
Elispot被广泛应用于免疫学、肿瘤学、感染病学等领域的研究和诊断。
2. Elispot的原理Elispot基于细胞分泌物的分泌原理进行测定。
其原理主要包括以下几个步骤：1.准备ELISPOT板：将特定抗体或刺激物涂覆在固相支持体上，形成抗原或刺激物捕获层。
常用固相支持体有多孔膜、96孔板等。
2.加样细胞：将待测细胞或其他产生细胞分泌物的细胞加入到ELISPOT板中，使其与抗原或刺激物接触。
3.细胞刺激：经过一定的培养条件和时间，刺激细胞产生分泌物。
4.分泌物检测：将细胞移除，用特异性抗体标记待测细胞分泌物中的目标分子，形成复合物。
5.免疫反应可见化：通过酶标法或荧光法，使复合物与ELISPOT板上的底物发生反应，产生可观察的斑点。
3. Elispot的应用Elispot技术广泛应用于以下领域：3.1 免疫学研究Elispot可以用于研究多种细胞因子的产生情况，如干扰素γ（IFN-γ）、白介素-2（IL-2）、肿瘤坏死因子（TNF-α）等。
它可以检测单个细胞的分泌情况，并通过对不同细胞类型进行比较，揭示免疫细胞的功能和相互作用。
3.2 肿瘤学研究Elispot可以评估肿瘤特异性T细胞的活性和功能。
通过使用与肿瘤相关的抗原刺激细胞，可以检测肿瘤特异性T细胞的分泌情况，进而评估免疫治疗的效果和抗肿瘤免疫应答的强度。
3.3 感染病学研究Elispot在感染病学研究中起到重要作用。
通过检测特定感染病原体的抗原刺激下，细胞分泌物的产生情况，可以评估免疫应答的强度和类型，并且可以用于疫苗开发和新药筛选等领域。
3.4 自身免疫性疾病研究Elispot可以用于评估自身免疫性疾病（如类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮等）患者的自身免疫反应。
ELISPOT技术概述
一、 ELISPOT技术概述1、技术原理和技术特点ELISPOT全名为酶联免疫斑点检测，英文：Enzyme-linked Immunospot Assay。
它结合了细胞培养技术与酶联免疫吸附技术（即ELISA技术），能够在单细胞水平检测细胞因子的分泌情况。
其技术原理，一句话概括就是：用抗体捕获培养中的细胞分泌的细胞因子，并以酶联斑点显色的方式将其表现出来（Sedgwick JD 2005）。
该技术检测细胞因子具有三大优点：其一，灵敏度高。
在一百万个阴性细胞中只要有一个分泌细胞因子的阳性细胞即可被检测出来。
这是目前为止，最为灵敏的检测技术，灵敏度比传统的的ELISA方法高2-3个数量级。
其二，单细胞水平，活细胞功能检测。
ELISPOT检测的是单个细胞分泌，而非细胞群体的平均分泌。
在检测的过程中，有活细胞培养与抗原刺激阶段，检测的是活细胞的功能，而非死细胞的遗留物。
其三，操作简便经济，可以进行高筒量筛选。
ELISPOT没有复杂的细胞体外扩增过程，不使用同位素，不需要大型的、专门的实验仪器设备。
按照标准化的实验操作，一个实验者可以同时处理数百个样品，效率远远高于其它检测方法（Kalyuzhny AE 2005）。
实验设计在96孔培养板上进行，直接以培养板的塑料板底或者PVDF膜以及硝酸纤维素膜为基质，包被上特异性的单克隆抗体，用以捕获细胞分泌的细胞因子。
（由于涉及到细胞培养的过程，对单克隆抗体的要求要远高于ELISA中的捕获抗体，该抗体需要无毒，不含内毒素，亲和力高等特点。
）之后，在培养板的孔内加入细胞培养基（现在无血清ELISPOT技术已经成熟，培养基中可以不再含有血清）、待检测的细胞以及抗原刺激物进行培养。
在特异性的抗原或者非特异性的有丝分裂原的刺激下，数小时之内，T细胞就会开始分泌各种细胞因子。
细胞因子当即就被位于细胞下方的膜上的单克隆抗体所捕获。
在洗去细胞之后，被捕获的细胞因子可以与生物素标记的第二抗体结合，然后用酶标亲和素再与生物素结合，进行化学酶联显色，就可以在膜的局部形成一个个圆形的斑点。
酶联免疫斑点试验检测技术(Elispot)在诊断结核性脑膜炎中的应用
提供 ， 脑脊液 Ｔ — Ｎ Ｐ Ｒ） 平 ≥５０ ｃｐｅ／ ｌ 断 为 阳 ＢＤ Ａ（ Ｃ 水 ０ ｏ ｉ ｍ 判 ｓ
性 ， ５ ０ｃｐｅ ｍ 判 断 为 阴 性 。 检 测 结 果 使 用 Ｐｉ ５０软 ＜ ０ ｏｉ ／ ｌ ｓ ｒｍ ． ｓ
件包进行数据统计和统计学分析。两组 间率 的比较采用卡方
特 异 性 ｒ 扰 素 （Ｆ —） 平 可 以 用 于 结 核 分 枝 杆 菌 感 染 的 干 ＩＮ ｒ 水
断为 阳性 ， 抗 原 检 测 结 果 为 阴性 ， 果 判 断 为 阴 性 ； 有 ３种 结 所 脑 膜 脑 炎 病 例 均 常 规 行 脑 脊 液 Ａ Ａ、 脊 液 Ｔ — Ｎ Ｐ Ｒ） Ｄ 脑 Ｂ Ｄ Ａ（ Ｃ
检测 。脑脊 液 Ａ Ａ使 用 酶 标 法 进 行 检 测 ， 据 国 内 同行 Ｄ 根 ２０ ０４年对脑脊 液 Ａ Ａ在结 核性脑 膜脑 炎 中研 究 的标准 Ｊ Ｄ ， 脑脊液 Ａ Ａ１８Ｕ Ｌ判断为 阳性 ， ８Ｕ Ｌ判断为阴性 ； Ｄ ＞ ／ ＜ ／ 脑脊
液 Ｔ —Ｎ Ｂ Ｄ Ａ荧 光 定 量 聚 合 酶 链 反 应 试剂 由达 安 基 因有 限 公 司
选 非 结 核 性 脑 膜 脑 炎 病 例 均 通过 临床 治 疗 转 归 及 实 验室 检 查 最终确诊 。
方 法
所 有 病 例 均抽 取 乙 二 胺 四 乙 酸 （ Ｄ Ａ） 凝 血 ５ｍ ， ＥＴ 抗 ｌ送
实 验 室 行 Ｅｉ ｏ检 测 。检 测 结 果 根 据 斑 点 数 量 设 定 ， 一 反 ｌｐ ｔ ｓ 每
术 在 结 核 性 脑 膜脑 炎 中 的应 用 价 值 。
临 床 资 料
、
果
在 ７ 例 结 核 性 脑 膜 脑 炎 的 诊 断 中 ，ｌｐ ｔ 性 者 ４ ３ Ｅｉ ｏ 阳 ｓ ５
ELISPOT工作原理
ELISPOT工作原理关键信息项：1、 ELISPOT 技术的定义2、涉及的实验材料和设备3、实验操作步骤4、数据采集与分析方法5、技术的优势和局限性11 ELISPOT 技术的定义ELISPOT（EnzymeLinked Immunospot Assay），即酶联免疫斑点检测技术，是一种用于检测和定量单个细胞分泌特定蛋白质的免疫学方法。
111 原理概述ELISPOT 基于细胞分泌的蛋白质能够在细胞周围的固相载体上形成可见斑点的原理。
当被检测的细胞受到特定刺激后，会分泌特定的细胞因子或抗体等蛋白质。
这些分泌的蛋白质会被预先包被在固相载体（通常是微孔板）上的特异性抗体捕获。
112 与其他技术的比较与传统的 ELISA（酶联免疫吸附测定）方法相比，ELISPOT 能够检测单个细胞的分泌水平，而 ELISA 则是对细胞群体分泌的总和进行测量。
12 涉及的实验材料和设备121 固相载体通常使用 96 孔或 384 孔的微孔板，表面经过特殊处理以增强抗体的吸附。
122 捕获抗体针对待检测的细胞因子或蛋白质的特异性抗体，用于包被微孔板。
123 检测抗体与捕获抗体识别不同表位的另一种特异性抗体，通常与酶标记物结合。
124 酶标记物如辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶（AP）等，用于催化显色反应。
125 显色底物根据所使用的酶标记物选择相应的显色底物，产生可见的斑点。
126 细胞培养相关试剂包括培养基、血清、刺激剂等。
127 细胞分离和制备设备如离心机、移液器等。
13 实验操作步骤131 微孔板包被将捕获抗体稀释至适当浓度，加入微孔板中，在适当条件下孵育，使抗体吸附在微孔板表面。
132 封闭用封闭液封闭微孔板上未结合抗体的位点，以减少非特异性结合。
133 细胞接种将处理好的细胞悬液加入微孔板中，在特定条件下培养。
134 刺激根据实验目的，加入适当的刺激剂，诱导细胞分泌目标蛋白质。
135 孵育在适当的温度和时间条件下孵育，使细胞分泌的蛋白质被捕获抗体捕获。
酶联免疫斑点试验
酶联免疫斑点试验
酶联免疫斑点试验（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，简称ELISPOT）是一种高灵敏度的免疫学检测技术，可用于检测单个细胞
的分泌物，如细胞因子、抗体、酶等。
该技术广泛应用于疾病诊断、
药物筛选、疫苗研究等领域。
ELISPOT的原理是利用特定的抗体捕获分泌物，然后使用酶标记的二
抗或底物来检测捕获的分泌物。
具体步骤如下：
1. 准备试板：将多孔板涂上特定的抗体，使其能够捕获分泌物。
2. 细胞处理：将待检测的细胞加入试板中，使其与涂有抗体的孔相互
作用。
3. 洗涤：将试板洗涤，去除未结合的细胞和其他杂质。
4. 二抗标记：加入酶标记的二抗，使其与捕获的分泌物结合。
5. 洗涤：将试板洗涤，去除未结合的二抗和其他杂质。
6. 底物反应：加入底物，使其与酶标记的二抗反应，产生可见的斑点。
ELISPOT的优点是灵敏度高、特异性好、操作简单、结果可靠。
它可
以检测单个细胞的分泌物，因此可以用于研究细胞免疫应答、肿瘤免
疫学、感染病毒的免疫学等领域。
此外，ELISPOT还可以用于药物筛
选和疫苗研究，帮助科学家们开发更有效的药物和疫苗。
ELISPOT的缺点是需要较长的实验时间和较高的成本，同时需要专业
的实验技能和设备。
此外，ELISPOT只能检测单个细胞的分泌物，无
法检测细胞表面分子的表达情况。
总之，ELISPOT是一种重要的免疫学检测技术，具有广泛的应用前景。
随着技术的不断发展，ELISPOT将会在疾病诊断、药物筛选、疫苗研
究等领域发挥越来越重要的作用。
Elispot--酶联免疫斑点扫描图像分析仪
YZ—2000C型Elispot(酶联免疫斑点）扫描图像分析仪
仪器说明：
YZ-2000 C型Elispot(酶联免疫斑点）扫描图像分析仪是专门为酶联免疫斑点技术设计的扫描成像分析仪，可分析各个厂家Elispot 试剂,T-POT试剂及6—-—96孔透明板和PVDF膜上的斑点.可按斑点的形态学计数；按斑点的面积直径的大小设定阈值计数；计算斑点的积分光密度值和平均光密度值。
应用领域：
免疫学基础研究TB细胞计数；疫苗研究；药物筛选；感染性疾病诊断与研究；肿瘤免疫研究;自身免疫病研究;过敏研究；移
植免疫研究等方面。
技术参数:
动态密度值： 3.5 D
分辨率： 5um
最大光学分辨率： 4800/12800dpi
扫描速度： 96孔板或有效面积≤30秒（1200dpi）
测量池面积： 300×210mm
背光：两种光源白色和蓝色（可选），光强度可调。
操作温度： 0℃-—-—40℃
噪声: ≤50db
电源： 210-240v
相对湿度： 10%—85%
外观尺寸: 长355mm×高180mm×深580mm
计算机选配:
品牌电脑：操作系统windows7 ，Intel平台;CPU i5 四核，速度3.2Hz ;独立显卡2GB；内存8GB ;硬盘1T; 23英寸液晶显示器.。
设备名称荧光(酶联)斑点分析仪
设备名称：荧光（酶联）斑点分析仪一、设备使用需求1 、可见光单色、可见光双色的酶联免疫斑点实验结果分析。
2 、病毒斑，菌落，克隆斑，等微生物斑点实验分析。
3、多色荧光斑点实验检测分析。
4、死、活细胞计数，多色病毒抗体中和实验检测，病毒报告基因检测，荧光灶实验检测，NK杀伤实验检测分析等。
二、主要技术参数（原装进口）1、可见光和荧光检测。
2、适用于多种荧光方法，至少包括FITC、Alexa488、GFP、PI、PE、RFP、Cy3、TRITC、PE-Cy5、PerCP等。
3 、自动居中功能AutoCenter：无需三点定位，能够自动对每个孔的位置居中调节。
*4、可读取切片，载玻片，血细胞计数板，384孔，96孔，48孔，24孔。
*5 、可见光照明系统：5.1 顶部光源为点光源阵列，点光源数量≥60个。
5.2 底部光源为LED平面发光板，面积≥3cm×3cm。
*6、荧光激发光源≥2个，光源类型为高能LED光源，寿命≥20000小时。
7、全自动滤镜转换器，提供的位置≥8组，配置滤镜≥4组。
8、能够至少完成下列实验结果的观察和分析：4色荧光检测实验；病毒抗体中和实验；病毒报告基因检测，荧光灶实验检测，死、活细胞计数实验； NK杀伤实验检测。
9 、独立的酶联免疫斑点分析软件：9.1 、用户设置计数参数，自动进行计数；系统可以辅助用户自动设定参数，可根据实验结果自动调整参数，实现不同情况下的准确计数。
9.2、智能动态分析：完全无需用户设置参数，也不需要调用预设的固定模版。
智能动态的对各种实验结果进行动态计数分析。
9.3、具备动态斑点群体分析AutoGate：采用科学的统计学方法对特异性和非特异性斑点进行人工智能的区分。
提供该分析方法的证明文献。
*10、独立的荧光斑点分析软件：10.1、分析多色荧光斑点实验。
需提供软件分析截屏图说明。
10.2、对死活细胞计数实验进行自动分析，同时检测样本数≥30个。
ELISPOT
ELISPOT检测HLA-A2阳性的健康人外周血单个核细胞(PBMC)是否有候选肽特异性的T淋巴细胞，候选肽能否将它激活。
用ELISPOT检测活化T细胞分泌的IFN-r证实在正常人PBMC中是否有NY-BR-1特异性的CTL存在，同时也反应了各肽的免疫原性。
ELISPOT和51Cr杀伤实验检测表位肽的免疫原性结果显示HLA-A2阳性健康人外周血中有候选肽MLLQQNVDV(167～175)和NMWLQQQLV(1274～1282)特异性的前体细胞。
1．什么是ELISPOT检测?答:酶联免疫斑点( enzyme-linked immunosorbent spot, ELISPOT) 检测技术是通过两种高亲和力的特异性抗细胞因子抗体来检测淋巴细胞分泌细胞因子情况的一种方法。
淋巴细胞在体内被抗原激活后，或者在体外培养中被培养液中含有的特异性抗原或刺激剂激活后，将这些细胞转入ELISPOT培养板中。
这些活化的淋巴细胞所分泌的细胞因子，在孵育的过程中可在分泌细胞原位被ELISPOT培养板上包被的特异性细胞因子抗体所捕获。
将细胞和过量的细胞因子洗除后，加入生物素标记的检测抗体，孵育后洗去多余检测抗体。
然后加入酶标记的链亲和素（二抗），孵育后洗去多余酶标链亲和素（二抗）。
最后加入酶的底物，作用后可形成不溶的颜色产物即斑点（SPOT）。
每个斑点是激活的淋巴细胞分泌的细胞因子区域，代表一个活性淋巴细胞。
实验结果可在显微镜下观察或使用酶联免疫斑点自动图象分析仪（BioReader 4000 Pro-X）来进行计数分析。
该方法可在单细胞水平检测淋巴细胞对特异性抗原的反应能力及记数特异性抗原刺激下分泌性淋巴细胞产生的情况。
第二部分：关于ELISPOT试验技术中对细胞的处理1．提取外周血淋巴细胞时，有那些注意事项？答：如果取外周血淋巴细胞(PBMC) 进行ELISPOT检测，最好采用新鲜血液。
在保证无菌操作的前提下，首先应保证取血时抗凝剂应及时充分的与血液混匀，避免血凝块的出现。
ELISPOT技术简介及实验步骤
one spot
ELISPOT技术优点
• 高灵敏度：单个细胞水平检测，极低频的阳性细胞检
出率——百万分之一
• 高通量：每个研究人员每天可做上百样本的检测 • 冻存标本的检测 • 安全：无放射性污染 • 高性价比：一般细胞实验室即可进行。
ELISPOT应用
• 疫苗开发：评估疫苗效力，或疫苗注射路径影响 • 传染疾病研究：HBV-ELISPOT、TB-ELISPOT • 过敏机制探讨：IL-4诱导免疫球蛋白亚型转换，其它参与
双因子酶联斑点检测
IFN-
IL-4
IFN-/IL-4
双因子荧光斑点检测
IFN-
IL-13
IFN-/IL-13
多色荧光斑点检测
IFN-
IFN-/TNF-/IL-10
TNF-
IL-10
BioRreader 读板
BioReader 3000
BioReader 5000
BioReader 4000
8.ELISPOT技术服务
ELISPOT 全国用户培训 ELISPOT 试剂开发服务
3.试剂的准备
*预包被ELISPOT技术
™ 预包被ELISPOT 试剂盒
6.实验室质控
*ELISPOT质控技术
冻干多价非特异性刺激物 PHA和PMA/IMC ELISPOT细胞质控品
PBMC-SPOTTM细胞
F肽特异性刺激肽
1
B2
1.1
22
69
2,818
6,715
Real Plate B3
1.2
30
77
3,466
11,915
Real Plate D5
12.2
65
酶联免疫斑点法
酶联免疫斑点法酶联免疫斑点法（Enzyme-linked immunospot assay, ELISPOT）是一种用于检测单个细胞分泌物（包括细胞因子、抗体和其他蛋白质）的方法。
该技术将单个细胞和特异性抗体共同培养于多孔的固体基质上，当特异性抗体捕获了细胞分泌物时，就会形成一个“免疫斑点”，而该斑点会通过化学反应显示出来，从而可进行定量分析。
该技术的优点一是提高了灵敏度和特异性，促进了单个细胞分泌物的检测能力。
二是实验条件较容易控制，能够极大地减少误差。
另外，与其他技术相比，ELISPOT技术具有较高的自动化水平和适应性。
同时，该技术可用于评估和比较不同治疗方案或疫苗的效果、评估细胞免疫反应、疾病诊断和监测、评估药物毒性和进行基础研究。
在实验中，ELISPOT可分为两个阶段。
第一阶段是细胞培养，即将感兴趣的细胞和特定的刺激物共同培养。
第二阶段是免疫斑点检测，即将细胞移到多孔的固体基质上，添加特异性抗体进行反应，以发现并定量斑点。
常用的免疫斑点计数仪可以通过电子显微镜对固定、染色的免疫斑点进行准确计数，从而获得准确的结果。
通过该技术，研究人员可以研究细胞免疫和疫苗的作用机制，及早发现传染病或肿瘤的预警信号，以促进更好的预防和治疗。
此外，酶联免疫斑点法也适用于儿童疫苗接种后对疫情的监测和跟踪，以及老年人免疫力的评估。
需要指出的是，这种技术并不能够直接用于临床检测，仅在研究领域发挥作用。
一些商业实验室已经开始使用该技术进行疫苗测试和特定蛋白质的检测，在检测和诊断方面具有很大的潜力。
总之，酶联免疫斑点法是一种基于细胞分泌物检测的技术手段，在生物医学研究、药物开发以及疾病预防和治疗等方面具有较为重要的应用价值。
酶联免疫斑点试验的原理
酶联免疫斑点试验的原理1. 引言酶联免疫斑点试验（Enzyme-Linked ImmunoSpot Assay，简称ELISPOT）是一种用于检测细胞分泌物的敏感且高通量的免疫学技术。
该技术可以定量检测单个细胞分泌的蛋白质或细胞因子，在免疫学研究、药物开发和临床诊断中具有广泛的应用。
2. 原理概述ELISPOT技术基于酶标记抗体和特异性抗原结合的原理。
它通过将待测细胞与特定抗原刺激后，将细胞分泌物捕获到固相载体上，然后使用酶标记二抗进行检测，最后通过显色反应可视化并计数斑点数量。
该技术具有高灵敏度、高特异性和高通量等优势。
3. 实验步骤步骤一：制备固相载体在ELISPOT实验中，常用的固相载体是多孔膜板或膜片。
首先，在载体表面涂覆特异性抗原或抗体，以便捕获待测细胞分泌的特定蛋白质或细胞因子。
步骤二：孵育待测细胞将待测细胞加入到含有特异性抗原的培养基中，使其与抗原发生特异性反应。
通常，实验者会设置对照组，包括阴性对照组（只有培养基）和阳性对照组（含有已知分泌物的细胞）。
步骤三：洗涤将孵育后的细胞用洗涤缓冲液洗去未结合的细胞和其他杂质。
步骤四：二抗处理加入酶标记的二抗（如辣根过氧化物酶标记的抗IgG），使其与待测细胞分泌物中的特异性蛋白质或细胞因子结合。
步骤五：显色反应加入适当的底物和显色剂，通过酶催化作用产生可见信号。
常用的显色剂是BCIP/NBT，在酶催化下会生成紫色斑点。
步骤六：计数和分析使用显微镜对固相载体进行观察，并使用计算机软件或手工计数斑点数量。
斑点的数量代表了待测细胞分泌物的水平。
4. 原理解析特异性抗原和抗体结合固相载体表面涂覆的特异性抗原或抗体与待测细胞分泌物中的特定蛋白质或细胞因子结合。
这种结合是通过免疫反应中抗原与抗体之间的特异性识别实现的。
酶标记二抗检测酶标记二抗是一种能够与待测细胞分泌物中的特异性蛋白质或细胞因子结合并具有酶活性的二级抗体。
常用的酶标记二抗有辣根过氧化物酶标记的抗IgG。
ELISPOT技术简介及实验步骤
PBMC
存活率≥90%
存活率≥80%
存活率≤70%
培 养
负对照，无刺激物
Lympho-Spot™ Primate 无血清培养基
基
种
类
4 SFC 无刺激物；
1244 SFC CEF刺激
负对照，无刺激物 10%进口胎牛血清
400,000 Hu-PBMC Lympho-Spot™ Vs FBS
400,000 Hu-PBMC Lympho-Spot™无血清培养基
Table :
Real Plate
Number of Counts / Table
Table Number :
3
24/11/2003
50
Average Values
Cummulated values
Experiment Well
Spots/Well
Opt. Density * Area
area **
Coat with antibodies
ELISPOT原理
Wash and add enzyme-labeled streptavidin
Add cytokine secreting T cells
Wash and add biotinylated antibodies
biotin
Wash and add substrate to allow spot formation
100
150
200
ELISPOT单孔量化分析
光密度与细胞因子相对量化分析
BioSys GmbH
每孔斑点数目与每孔TOD值的比 较
Karben
JK
File :
tang
分子医学技能：酶联免疫斑点(ELISPOT)技术
特点：
❖斑点可持久保存并进行计数分析
❖易操作、有效、快速、灵敏度高
✓ 细胞因子的检测不易受非分泌细胞的干扰 ✓ 比传统的ELISA和细胞内细胞因子染色法敏感20-200倍
❖样本量大的情况下实验结果可用计算机图象分 析系统进行快速、客观的分析
❖
基
Coating Ab
本
包被培养孔
原
理
根据实验设 计加入淋巴 细胞及含或 不含刺激因 子的培养液
酶联免疫斑点(ELISPOT)技术
❖ELISPOT（Enzyme-linked Immunospot Assay）
▪ 结合了细胞培养技术与酶联免疫吸附技术（即 ELISA技术），能够在单细胞水平检测细胞因子 的分泌情况；
▪ 用抗体原位捕获培养中的细胞分泌的细胞因子， 并以酶联斑点显色的方式将其表现出来。
❖双色ELISPOT结果示意图
蓝色：IFN-γ,红色：IL-2; 蓝色：IFN-γ,红色：IL-17
❖ ELISPOT
▪ B细胞杂交瘤的筛选 ▪ 化合物和药物免疫学反应的检测 ▪ 优化树突细胞和T细胞的抗肿瘤活性 ▪ 靶向疫苗的质控
方 ▪ 自身免疫疾病的诊断和预后分析 法 ▪ 自身免疫疾病免疫治疗的监控 主 ▪ 过敏性疾病的脱敏治疗的监测 要 ▪ 器官移植中排斥反应的预测 用 ▪ 微量组织、肿瘤和免疫细胞分泌谱的分析 途 ▪ 结核病的诊断
▪ 显色剂I和II应避光保存，不使用时切勿混合
❖ ELISPOT 实 验 结 果 示 意 图
细胞因子A
双抗体包被
❖双色ELISPOT原理
培养细胞 细胞因子B
包被抗体
Biotin-检测抗体
HRP-检测抗体 BCIP/NBT底物
AEC底物
ELISPOT酶联免疫斑点分析
ELISPOT酶联免疫斑点分析ELISPOT 技术简介随着酶联免疫分析技术在医学及生物学领域的广泛应用, 使体外检测各种细胞因子及抗体研究有了新的突破。
在研究免疫应答机制时以往常用用酶联免疫吸附法（ELISA ）检测体液中游离的细胞因子（CK ）或抗体，但由于游离的循环抗体或CK 的半哀期不同，使之在体液中不断的被代谢或与靶器官结合，而不能确切的反映体内的抗体及CK 的水平。
80 年代，国外的科研工作者根据ELISA 技术的基本原理，建立了体外检测特异性抗体分泌细胞和CK 分泌细胞的固相酶联免疫斑点技术（ELISPOT ）。
因其具有较高的特异性和敏感性，目前正被国内外广泛应用，对探索自身免疫系统疾病发病机制具有重要意义。
ELISPOT 法源自ELISA ，又突破传统ELISA 法，是定量ELISA 技术的延伸和新的发展。
两者都是检测细胞产生的细胞因子或其他可溶性蛋白，它们最大的不同在于：•ELISA 通过显色反应，在酶标仪上测定吸光度，与标准曲线比较得出可溶性蛋白总量。
•ELISPOT 也是通过显色反应，在细胞分泌这种可溶性蛋白的相应位置上显现清晰可辨的斑点，可直接在显微镜下人工计数斑点或通过德国AID的ELISPOT 分析系统对斑点进行计数，1 个斑点代表1 个细胞，从而计算出分泌该蛋白的细胞的频率。
（某些研究不仅要测细胞因子生成量，还需检测分泌此细胞因子的细胞频率）•由于是单细胞水平检测，ELISPOT 比ELISA 和有限稀释法等更灵敏，能从20 万-30 万细胞中检出1 个分泌该蛋白的细胞。
•捕获抗体为BD 、R&D 、Mabtech 、Diaclone 生产的高亲和力、高特异性、低内毒素单抗，在研究者以刺激剂激活细胞时，不会影响活化细胞分泌细胞因子。
ELISPOT 检测原理细胞受到刺激后局部产生细胞因子，此细胞因子被特异单克隆抗体捕获。
细胞分解后，被捕获的细胞因子与生物素标记的二抗结合，其后再与碱性磷酸酶标记的亲和素结合。
酶联免疫斑点检测技术对结核性脑膜炎的诊断分析
酶联免疫斑点检测技术对结核性脑膜炎的诊断分析【摘要】酶联免疫斑点检测技术是一种高灵敏度和高特异性的诊断方法，对于结核性脑膜炎具有重要的临床应用意义。
本文首先介绍了酶联免疫斑点检测技术的原理，然后探讨了结核性脑膜炎的临床表现和酶联免疫斑点检测技术在该疾病诊断中的应用。
关联研究成果表明，该技术在结核性脑膜炎的诊断中具有较高的准确性和可靠性。
文章还讨论了酶联免疫斑点检测技术的技术优势，并展望了其在结核性脑膜炎诊断中的前景。
技术的局限性和改进方向也需要进一步研究和探索。
酶联免疫斑点检测技术有望成为结核性脑膜炎诊断领域的重要工具，并为临床治疗提供更准确的依据。
【关键词】酶联免疫斑点检测技术、结核性脑膜炎、诊断、临床表现、研究成果、技术优势、前景展望、局限性、改进方向。
1. 引言1.1 背景介绍结核性脑膜炎是一种常见的中枢神经系统感染性疾病，由结核分枝杆菌引起。
该疾病在临床上具有病变进展迅速、症状复杂多样、易被误诊等特点，严重危害患者生命健康。
传统的诊断方法包括临床表现、脑脊液检查和影像学检查等，但存在着诊断难、漏诊率高等问题。
酶联免疫斑点检测技术是一种高灵敏度、高特异性的免疫学检测方法，能够检测患者体内特定抗原的T细胞反应，起到了在结核性脑膜炎诊断中的重要作用。
通过该技术可以快速准确地诊断结核性脑膜炎，有望降低漏诊率，提高诊断准确性，指导临床治疗。
在当前医学领域，酶联免疫斑点检测技术得到越来越广泛的应用，对结核性脑膜炎的诊断与治疗具有重要的临床意义。
本文旨在系统阐述酶联免疫斑点检测技术在结核性脑膜炎诊断中的应用价值及前景，为该疾病的早期诊断与治疗提供新的思路和方法。
1.2 研究目的结核性脑膜炎是一种常见且严重的中枢神经系统感染性疾病，其早期诊断对患者的治疗和预后至关重要。
本研究旨在探讨酶联免疫斑点检测技术在结核性脑膜炎诊断中的应用，以评估其在早期诊断和临床治疗中的可行性和有效性。
具体研究目的包括：1. 探讨酶联免疫斑点检测技术的原理和应用特点，以了解其在结核性脑膜炎诊断中的优势和局限性。
酶联免疫斑点检测仪安全操作及保养规程
酶联免疫斑点检测仪安全操作及保养规程1. 引言酶联免疫斑点检测仪（ELISPOT）是一种常用于免疫学研究的实验设备。
为了保证实验室人员的安全以及设备的正常运行，需要遵守一系列安全操作和保养规程。
本文档将详细介绍酶联免疫斑点检测仪的安全操作及保养规程。
2. 设备安全操作规程2.1. 设备放置酶联免疫斑点检测仪应放置在干燥、通风良好的实验室台面上，远离易燃物质和化学品。
确保设备周围有足够的空间，以便进行样本处理和操作。
2.2. 电源连接在连接电源之前，确保电源插座符合设备的电压需求，并且接地可靠。
插头和插座之间不得出现松动或有暴露导线，以避免电击和火灾的风险。
2.3. 操作面板操作面板的按钮和旋钮应该平稳有序，无松动或不良接触的现象。
在操作前确保设备处于待机状态，并按照说明书正确操作。
2.4. 样本处理在进行样本处理时，应佩戴实验室安全手套和实验服。
避免直接接触样本和试剂，避免吸入样本和试剂的挥发物。
使用标准的生物安全柜进行操作，避免污染和交叉感染的风险。
2.5. 实验室安全酶联免疫斑点检测仪操作过程中要遵守实验室安全规范，包括正确处理和处置化学品废液、正确使用实验室设备、遵循生物安全操作等。
实验室人员应接受相关的培训和指导，了解实验室安全操作的要求。
3. 设备保养规程3.1. 定期清洁定期清洁酶联免疫斑点检测仪能够确保设备的正常运行，延长设备的使用寿命。
清洁过程中应注意以下事项：•使用干净的、柔软的布进行擦拭，避免使用含有酸、碱等化学成分的清洗剂。
•清洁时，应关闭设备并拔掉电源插头，以免发生意外。
•清洗过程中，应注意保护设备上的显示屏、按钮和插口，避免水或清洁剂渗入设备内部。
3.2. 定期维护定期对酶联免疫斑点检测仪进行维护能够及时发现设备的故障和问题，确保设备的正常运行。
维护工作应交由专业的技术人员进行，包括设备内部的清洁、零部件的更换等。
3.3. 备品备件在保养过程中，应随时准备备品备件，以备需要更换的情况。
斑点酶联免疫分析仪校准用模拟斑点标准物质
斑点酶联免疫分析仪校准用模拟斑点标准物质*李兰英1 王乐乐1 唐冬梅1 闻艳丽1 孟娇然1 丁敏1 武利庆2 米薇2 鲁絮3 Markus Rueger4刘刚1 / 1.上海市计量测试技术研究院；2.中国计量科学研究院；3.艾迪创格（北京）科技有限公司；4.德国艾迪（AID)公司摘 要 根据斑点酶联免疫分析仪的技术参数，结合酶联斑点的培养生长特性，采用AutoCAD 设计模拟斑点图形，研制了模拟斑点标准物质，经过均匀性和稳定性检验，由八家实验室采用人工识别计数的方法进行协同定值，并进行不确定度评估。
结果表明，该标准物质均匀性良好，在实验室室温避光条件下保存，稳定性在1 a以内，并成功应用到斑点酶联免疫分析仪的计量校准工作中，对仪器示值误差和重复性的计量特性进行实验研究，为仪器日常的校准工作以及国家计量校准规范的制定提供了实验基础。
关键词 模拟斑点；标准物质；斑点酶联免疫分析仪；计量校准0 引言斑点酶联免疫技术（Enzyme-linked immunospot, ELISPOT）在单细胞水平检测分泌抗体的细胞或分泌细胞因子的细胞情况下，统计斑点形成细胞的数目（即斑点计数）。
斑点计数是ELISPOT数据处理最重要的一步，斑点酶联免疫分析仪可以对ELISPOT板上各孔斑点图像进行全自动采集、计数及分析，从而评价机体的细胞免疫或体液免疫功能，广泛应用于疫苗研究、药物筛选、感染性疾病诊断与研究及肿瘤免疫研究等免疫学相关领域[1-4]。
值得一提的是，在疫苗的临床评价中，斑点酶联免疫分析仪已经被强制性用于ELISPOT中[5]，能够有效避免偏差，增加客观性、重复性及计数速度。
但是，目前国内外尚无通行的斑点酶联免疫分析仪校准方法。
由于细胞保存条件苛刻，稳定性差，不便携带，不适合做斑点酶联免疫分析仪校准用标准物质。
本文根据斑点酶联免疫分析仪的技术参数，结合酶联斑点的培养生长特性，研制了模拟斑点标准物质，量值准确可靠，便于存放和携带，均匀性和稳定性良好，为斑点酶联免疫分析仪的校准工作提供实验基础。
EliSpot 04HR-高端型酶联斑点分析仪
AID EliSpot Reader Systems --酶联斑点读取分析系统EliSpot 04 SR- 标准通用型酶联斑点分析仪保修期:2年这是一款经典的酶联斑点分析仪，其特点是快速、高效、操作简便，可处理任何类型的微孔板，是AID 最畅销的一款仪器之一。
AID 公司1997年开始研发酶联斑点分析仪，从1998年卖出了第一台仪器起至今，已经销售了500多台完整仪器，产品遍及20多个国家。
AID 也非常自豪地在网站（ ）上列出了一些使用该仪器的研究机构。
主要优势:在3分钟内完成一块板的读取和计数分析 AID EliSpot Reader (ELR04 SR) 验证充分 (21CFRpart11), 专业统计结果自动获取数据处理、输出数据快速、便捷可处理任何类型的平板硬件技术参数特点:QuadPack 双轴精密滚珠轴承镜台紧凑保护，精确步移，简化校准；材料优质，经久耐用环型发光二极管光源照明系统增强培养板上斑点成像对比度照射均匀，可清晰分辨因孔侧壁反光造成的“幻影现象”，准确识别孔底边缘节省耗材，寿命超长，可达十年之久。
数码照相机，分辨率为656*492的彩色CCD 芯片德国知名生产商制造的专业照相机，最专业的CCD 芯片高速FireWire （火线）传输系统火线传输线从数码设备快速发送数据到计算机系统，即插即用技术，快捷方便保证最快速度而无数据丢失性能卓越的计算机配置小巧紧凑实用型主机英特尔P entium IV, 3.0 GHz 处理器，1024 MB 内存，160G 硬盘Firewire Host Adaptor(容纳3个照相机的主机适配器) ，可以连接多个火线传输设备内置高速 DVD 刻录机，支持 CD 和 DVD 的刻录，USB 存储卡(1 G)，千兆网卡，用于网络备份 高品质彩色打印机，17寸显示器专业软件包括:MS Windows XP 操作系统MS Office XP 包括Excel 和WordAID EliSpot 软件V. 5.0 版本AID EliStat statistics 插件AID EliSpot软件 V. 5.0版本AID公司跟随用户的需要不断开发专业的图像分析软件，在不断地升级中充分的考虑用户的需要和分析的要求，现已优化软件到5.0版本。
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YZ-2000C型Elispot(酶联免疫斑点)扫描图像分析仪
仪器说明：
YZ-2000 C型Elispot(酶联免疫斑点)扫描图像分析仪是专门为酶联免疫斑点技术设计的扫描成像分析仪，可分析各个厂家Elispot 试剂，T-POT试剂及6---96孔透明板和PVDF膜上的斑点。
可按斑点的形态学计数；按斑点的面积直径的大小设定阈值计数；计算斑点的积分光密度值和平均光密度值。
应用领域：
免疫学基础研究TB细胞计数；疫苗研究；药物筛选；感染性疾病诊断与研究；肿瘤免疫研究；自身免疫病研究；过敏研究；移植免疫研究等方面。
技术参数：
动态密度值： 3.5 D
分辨率： 5um
最大光学分辨率： 4800/12800dpi
扫描速度： 96孔板或有效面积≤30秒（1200dpi）
测量池面积： 300×210mm
背光：两种光源白色和蓝色（可选），光强度可调。
操作温度： 0℃----40℃
噪声：≤50db
电源： 210-240v
相对湿度： 10%-85%
外观尺寸：长355mm×高180mm×深580mm
计算机选配:
品牌电脑：操作系统windows7 ，Intel平台；CPU i5 四核，速度3.2Hz ；独立显卡2GB；内存8GB ；硬盘1T；23英寸液晶显示器。