细胞培养与材料细胞毒性检测
细胞毒性检测方法总结!
细胞毒性检测方法总结！细胞毒性(cytotoxic)是由细胞或者化学物质引起的单纯的细胞杀伤事件，不依赖于凋亡或坏死的细胞死亡机理。
有时需要进行特定物质细胞毒性的检测，比如药物筛选。
细胞毒性检测主要是根据细胞膜通透性发生改变来进行的检测，常用以下几种方法：MTT、XTT法：利用线粒体内部酶的活性，可以将特定的四唑盐类进行转化，然后通过酶标仪进行检测一.LDH的方法：通过检测细胞培养上清中LDH的酶活性，来检测细胞毒性其它酶方法：如检测上清中碱性磷酸酶、酸性磷酸酶的活性等细胞增殖能力分析试剂原理：正常细胞代谢旺盛，其线粒体内的琥珀酸脱氢酶，可将四唑盐类物质（如MTT、XTT、WST-1等）还原为紫色的结晶状的物质，沉积在细胞周围，然后通过酶标仪读取OD值，从而检测到细胞增值状态优点：1）快速：96孔培养板形式，可进行高通量检测。
2）灵活：可直接通过显微镜观察，也可通过酶标仪进行定量检测。
二.荧光素发光法细胞生存能力检测原理：腺苷酸激酶（AK）存在于所有真核和原核细胞的胞浆中，AK具有激活ADP 生成ATP。
当细胞受损后，细胞膜发生破损，AK会释放到培养上清中。
该试剂盒利用荧光素酶和荧光素在ATP作用下可以发光，通过化学发光仪可以定量进行检测。
特点： 1）简单、快速。
2）板式检测，可进行高通量。
三.LDH法细胞毒性检测原理：LDH（乳酸脱氢酶）是一种稳定的蛋白质，存在于正常细胞的胞质中，一旦细胞膜受损，LDH即被释放到细胞外； LDH催化乳酸形成丙酮酸盐，和INT（四唑盐类）反应形成紫色的结晶物质，可通过500nm酶标仪进行检测。
通过检测细胞培养上清中LDH的活性，可判断细胞受损的程度特点：1）方法简单，安全，不使用放射性物质2）可进行高通量检测。
CCK_8操作说明及检测步骤
CCK_8操作说明及检测步骤CCK-8是一种常用的细胞增殖和细胞毒性检测方法，可以评估药物、毒物和其他试剂对细胞增殖的影响。
本篇文章将介绍CCK-8实验的操作说明及检测步骤。
实验材料：1.细胞培养物：包括细胞培养基和要检测的细胞系。
K-8试剂盒：包括CCK-8试剂和添加剂（如无血清培养基）。
实验步骤：1.细胞预处理：a.将细胞接种在培养皿中，使其达到对数生长期。
b.用PBS洗涤细胞，以去除培养基中的血清和其他杂质。
c.加入细胞培养基（如无血清培养基）孵育一天以适应新的生长条件。
K-8溶液的制备：a.从CCK-8试剂盒中取出所需量的CCK-8试剂。
b.按照试剂盒说明书中的方法，将CCK-8试剂溶解于适当的溶剂中，以获得CCK-8溶液。
3.细胞处理：a.在细胞培养皿中加入适量的处理组（含药物/毒物/试剂）和阴性对照组（不含处理）。
b.孵育细胞以使其与处理组接触，一般孵育24小时。
c.如果需要在不同时间点进行测量，可以设置不同的处理时间。
4.检测步骤：a.将培养皿从孵育器中取出，加入CCK-8溶液。
一般将CCK-8溶液与培养基混合，使浓度为10%。
b.返回孵育器中继续孵育15至60分钟，以使CCK-8溶液充分与细胞相互作用。
c. 使用酶标仪测量细胞的吸光度。
一般使用450nm波长进行检测。
d.记录各处理组的吸光度值。
5.数据分析：a.根据实验要求，选择合适的数据分析方法。
常用的包括比较各示踪实验组与阴性对照组之间的吸光度差异，或者使用半数抑制浓度（IC50）来评估样品对细胞增殖的影响。
b.绘制呈现实验结果的图表和图形。
c.进行统计分析，如t检验或方差分析，并计算显著性水平。
注意事项：1.操作前应严格按照实验室安全规定进行，佩戴实验室所需的个人防护设备。
2.在各步骤中，应尽量避免细胞暴露在环境中的时间过长，以减少细胞的应激反应。
3.操作时要注意使用无菌环境和无菌操作，以防止细胞污染。
4.实验中的所有操作必须根据实验室方法进行，避免任何操作的偏差。
细胞增殖与毒性检测实验方法及经验总结
细胞增殖与毒性检测实验方法及经验总结实验原理：Cell Counting Kit-8（简称CCK-8）试剂可用于简便而准确的细胞增殖和毒性分析。
其基本原理为：该试剂中含有WST-8【化学名：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐】，它在电子载体1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯（1-Methoxy PMS）的作用下被细胞中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲瓒产物（Formazan dye）。
生成的甲瓒物的数量与活细胞的数量成正比。
因此可利用这一特性直接进行细胞增殖和毒性分析。
一、用途：药物筛选、细胞增殖测定、细胞毒性测定、肿瘤药敏试验等。
二、优点：1.使用方便，省去了洗涤细胞，不需要放射性同位素和有机溶剂；K-8法能快速检测；K-8法的检测灵敏度很高，甚至可以测定较低细胞密度；K-8法的重复性优于MTT 法，MTT 实验生成的formazan 不是水溶性的，需要使用DMSO 等有机溶剂溶解；5.而本方法产生的formazan 是水溶性的，不仅省去了溶解步骤，更因此而减少了该操作步骤带来的误差；K-8法对细胞毒性小，可以多次测定选取最佳测定时间，与MTT 方法相比线性范围更宽，灵敏度更高；K-8细胞活性检测试剂中为1瓶溶液，毋需预制，即开即用。
三、所需设备及仪器：1. 10ul，100-200ul及多通道移液器2. 酶标仪（带有450nm滤光片）3. 96孔培养板4. 二氧化碳培养箱四、方法及步骤：实验一：细胞增殖分析1、制备细胞悬液：细胞计数。
2、接种到96孔板中：根据合适的铺板细胞数（约1-2×104），每孔约100ul细胞悬液，同样的样本可做4-6个重复。
3、37℃培养箱中培养：细胞接种后贴壁大约需要培养4小时，如果不需要贴壁，这步可以省去。
4、加入10ul CCK8：由于每孔加入CCK8量比较少，有可能因试剂沾在孔壁上而带来误差，建议将枪头浸入培养液中加入且在加完试剂后轻轻敲击培养板以帮助混匀。
2020版《中国药典》药包材—细胞毒性检查法公示稿
附件细胞毒性检查法本法系将供试品或供试品液接触细胞，通过对细胞形态、增殖和抑制影响的观察，评价供试品对体外细胞的毒性作用。
试验用细胞推荐使用小鼠成纤维细胞L-929。
试验时采用传代48～72h 生长旺盛的细成1相对增殖度法阴性对照液制备为不加供试品的细胞培养液。
阳性对照液制备取生物毒性阳性参比物质，照供试品制备项下的规定进行，如6.3%苯酚的细胞培养液。
检查法取33 个培养瓶，分别加入4×10 4 个/ml 浓度细胞悬液1ml，细胞培养液4ml，置(37±1 )℃，（5±1 ）%CO2的条件下培养24h。
培养24h 后弃去原培养液。
阴性对照组：取13 个培养瓶加入5ml 阴性对照液；阳性对照组取10 个培养瓶加入5ml根据各组细胞浓度按下式计算细胞相对增殖度（RGR）：RGR =供试品组（或阳性对照组）细胞浓度平均值⨯100阴性对照组细胞浓度平均值结果评价试验组相对增殖度（以第7 天的细胞浓度计算）为0 级或1 级判为合格。
试验组相对增殖度为2 级，应结合形态综合评价，轻微毒或无毒的判为合格。
试验组相对增殖度为3 级～5 级判为不合格。
2琼脂扩散法供试品制备将样品用纯化水冲洗干净（根据实际情况需要），用滤纸吸干。
若用供试品液进行试验，将制备的供试品液附着到生物惰性吸收性的基质﹙例如超细硼硅玻璃纤维滤纸﹚上，制成面积不少于100mm2 的圆形供试品。
阴性对照制备取无生物毒性阴性参比物质，例如高密度聚乙烯。
按照供试品制备项下的规定进行。
阳性对照制备取生物毒性阳性参比物质，例如含二乙基二硫代氨基甲酸锌的聚氨酯（ZDEC）。
按照供试品制备项下的规定进行。
可采用10%二甲基亚砜(DMSO)溶液，附着到生物惰性吸收性（例如超细硼硅玻璃纤维滤纸）的基质上。
检查法取细胞悬浮液（1×10 5个/ml）7ml，均匀分散至直径60mm 的培养皿中。
置于含（5±1 ）%CO2气体的细胞培养箱中培养24h 至近汇合单层细胞，弃去培养皿中培养基，将溶化琼脂冷却至48℃左右与含20%血清的2 倍新鲜哺乳动物细胞培养基混合，使琼脂最终质量浓度不大于2%，在每只培养皿内加入新制备的含琼脂培养基（要足够薄以利于可沥滤物的扩散）。
细胞毒性实验
细胞毒性实验
细胞毒性实验是一种常用的实验方法，用于评估不同物质对细胞的毒性程度。
在药物研发、化学品评估、环境监测等领域中，细胞毒性实验起着至关重要的作用。
本文将介绍细胞毒性实验的原理、方法和应用。
原理
细胞毒性实验通过将待测物质暴露于不同类型的细胞培养物中，通过观察细胞
生长、代谢活性、细胞形态等指标的变化来评估毒性。
细胞毒性主要分为急性毒性和慢性毒性两种类型，分别用于评估物质对细胞的直接杀伤作用和潜在的长期影响。
方法
1. 细胞培养
首先需要选择适当的细胞系进行实验，常用的细胞系包括HEK293、HeLa、RAW264.7等。
细胞需在灭菌条件下培养，并保持在适宜的培养基中。
2. 暴露实验
将不同浓度的待测物质加入到细胞培养物中，设立对照组和实验组。
根据实验
需要，可以选择不同时间点进行观察。
3. 细胞存活率检测
通过MTT法、CCK-8法等方法检测细胞的存活率，进而评估毒性程度。
此外，也可以观察细胞形态的变化，如细胞凋亡、坏死等。
4. 数据统计分析
将实验结果进行统计分析，绘制图表，评估不同浓度下待测物质的毒性效应。
应用
细胞毒性实验广泛应用于药物筛选、化学品评估、环境毒性检测等领域，为评
估物质对细胞的毒性提供重要依据。
通过细胞毒性实验，可以及时发现有毒物质，减少对人类健康和环境的危害。
综上所述，细胞毒性实验是一种重要的实验方法，具有广泛的应用前景。
加强
对细胞毒性实验的研究和应用，对于促进科学研究和保护人类健康具有积极意义。
Calcein PI细胞活性与细胞毒性检测试剂盒说明书
Calcein/PI 细胞活性与细胞毒性检测试剂盒产品简介：碧云天生产的Calcein/PI 细胞活性与细胞毒性检测试剂盒(Calcein/PI Cell Viability/Cytotoxicity Assay Kit ，或Calcein/PI Live/Dead Viability/Cytotoxicity Assay Kit)是一种非常便捷的基于Calcein-AM (钙黄绿素)和PI (碘化丙啶)双荧光染色法检测动物细胞死活的试剂盒。
本试剂盒使用便捷，荧光染色和检测仅需约30分钟。
本试剂盒染色30分钟后，就可进行后续的荧光显微镜拍照、流式分析或者荧光酶标仪定量等荧光检测和分析。
本试剂盒的原理是两种探针可分别检测细胞内酯酶活性和细胞膜完整性，从而反映细胞活性与细胞毒性。
其中Calcein AM 染色活细胞，呈现绿色荧光；而碘化丙啶(Propidium Iodide, PI)染色死细胞，呈现红色荧光。
本试剂盒用于检测动物细胞活性与细胞毒性效果参考图1。
图1. Calcein/PI 细胞活性与细胞毒性检测试剂盒用于HT-29(人结肠癌细胞)细胞活性与细胞毒性检测的效果图。
HT-29细胞(C6410)在明场视野下仔细观察可以看到有明显的坏死细胞(图A)；绿色荧光标记的即为Calcein 染色的活细胞(图B)，红色荧光标记的即为PI 染色的死细胞(图C)；Calcein和PI 双染叠加(merge)后可以非常清晰地观察到活细胞和死细胞的荧光染色差别(图D)。
在本实验中，HT-29细胞经TSZ 处理4小时。
TSZ 为TNFα、SM-164和Z-V AD-FMK 组成的细胞程序性坏死诱导试剂(C1058)。
实测数据会因实验条件、检测仪器等的不同而存在差异，图中数据仅供参考。
Calcein AM (Calcein Acetoxymethyl Ester ，中文名称为钙黄绿素AM或钙黄绿素乙酰氧基甲酯)，是一种可以对活细胞进行荧光染色的细胞染色试剂，Calcein AM 是在Calcein (钙黄绿素)的基础上增加了乙酰氧基甲酯(AM)基团，加强了疏水性，因此能够很容易穿透细胞膜。
细胞毒理实验技巧与注意事项
细胞毒理实验技巧与注意事项细胞毒理实验是研究物质对细胞的毒害程度和机理的重要手段之一。
进行细胞毒理实验需要掌握一系列实验技巧和注意事项，以确保实验的准确性和可靠性。
本文将介绍细胞毒理实验的常用技巧，并提供实验中需要注意的事项。
一、细胞培养技巧1. 细胞培养基的选择：选择适合细胞生长和发育的培养基，如DMEM、RPMI-1640等。
根据具体需要，可以添加适量的血清、培养液和抗生素。
2. 细胞传代的控制：定期进行细胞传代，避免细胞密度过高或过低。
细胞密度过高容易导致细胞凋亡，密度过低则会影响细胞生长。
3. 细胞的培养环境：确保培养箱内的温度、湿度和二氧化碳浓度稳定，以提供恒定的培养环境。
二、细胞毒性实验技巧1. 细胞暴露：根据实验需要，将待测试物质添加到细胞培养基中，使细胞与物质发生接触。
通常使用不同浓度的待测物质进行处理。
2. 细胞存活测定：细胞毒性实验的重要指标之一是细胞存活率。
常用方法包括MTT（3-(4,5-二甲基-2-噻唑啉基)-2,5-二苯基四唑盐）法、细胞计数法和荧光染色法等。
3. 細胞凋亡检测：细胞毒性实验中，往往需要检测细胞凋亡情况。
常用的检测方法有DNA凝胶电泳、细胞周期分析和Annexin V-FITC/PI染色等。
三、细胞毒性实验注意事项1. 控制实验组：在进行细胞毒性实验时，除了待测物质组外，还应设立阴性对照组和阳性对照组。
阴性对照组即细胞培养基组，阳性对照组则是已知对细胞有毒的物质组，以用于对比分析。
2. 重复实验：为了确保实验的可靠性，通常需要至少重复3次以上，以获得平均值和标准差。
同时，每次实验的重复次数也要保持一致。
3. 外源污染的避免：细胞培养实验中，外源污染的出现会严重影响实验结果。
因此，要确保实验条件干净、无菌，并采取相应的防护措施。
4. 合理的数据分析：对实验结果进行适当的统计学分析，使用合适的图表和数据处理工具，以得出准确的结论。
综上所述，细胞毒理实验是一项复杂而重要的实验工作。
12.12细胞培养法在生物材料相容性检测中的应用
细胞培养法在生物材料相容性检测中的应用1.间接法琼脂覆盖法是间接法中最典型的一种方法。
这种方法是将把平铺在有单层细胞的培养皿中的含有培养液的琼层，在固化的琼脂层上放上进行试样细胞培养。
这种方法的好处是不分材料都适用。
当毒性发现早且较强时，溶出物的分子量就会变小，并且易溶于水。
但是就算是有毒的材料，如果溶出物分子量大并难溶于水，也就说明很难直接表现出其性质。
2 直接法组织反应的主要原因一般是生物材料中一些易溶出物质引起炎症反应。
原料单体、低分子聚合物、催化剂等一般被称作是易溶出物质。
有些专家提出了用浸出液法来解决这些溶出物的细胞毒性。
这种方法是应该在适当的条件下将试样放入培养液或蒸馏水中浸泡，产生出含有溶出的浸泡液然后再加在含有细胞的培养皿或试管中继续培养，看溶出物对细胞是否真的影响。
但是结果证明两者之间并没有明显的差异。
直接浸渍法：把形态不规则的试样（如金属粉末、油脂类材料）等和细胞一起放入培养皿中进行培养的发法就是直接浸渍法。
如果有溶出物的时候就会对周围细胞产生影响。
宁淑华等1988年用该法对医用硅胶及聚乙烯醇进行细胞毒性试验。
有些学者认为对于形态不规则并且有微量毒性的材料使用该法比较合适。
细胞毒性试验方法有很多种方法，并且每种方法都有各自的特征。
但是每种试验方法的选择材料不同和原理都不同。
根据实验材料本身理化性质、毒性成份表现形式、毒性作用强弱及材料用途的选择的正确性是一种非常重要的实验方法。
3实验细胞研究进展L-929细胞是当前细胞毒性试验中使用最早也是最广泛的细胞，该细胞在1948年Earle 等学者从小鼠皮组织中分离出来的成纤维细胞。
而另一种细胞在是1953年Gay等学者在人体子宫肿瘤中分离出的子宫粘膜上细胞（Heal细胞）在人类方面的应用较多。
由都有一个共同的特点就是这两种细胞传代的速度较快，能够快速的繁殖。
而且容易在体外培养，方便储存。
同时这两种已建立成系的细胞株能为实验提供稳定传代的细胞，能为许多材料细胞毒性评价所共用等优点。
细胞毒性实验报告
细胞毒性实验报告细胞毒性实验报告细胞毒性实验是一种常见的科学实验方法，用于评估化合物对细胞的毒性作用。
本实验旨在研究不同浓度的化学物质对细胞的影响，并探讨其可能的毒性机制。
实验材料与方法：1. 细胞系：本实验选择了人类肺癌细胞系A549作为研究对象。
这是一种常用的细胞系，具有较高的增殖活性和易于培养的特点。
2. 化学物质：选择了化学品A、B和C作为实验物质，分别为已知对细胞具有不同程度毒性的化合物。
3. 细胞培养：将A549细胞系培养在含有适宜营养物质和生长因子的培养基中，保持在37摄氏度、5%二氧化碳的恒温培养箱中。
4. 细胞处理：将A549细胞分成不同组，每组细胞分别加入不同浓度的化学物质A、B和C，同时设置一个对照组，不加入任何化学物质。
5. 细胞存活率检测：使用MTT法检测细胞的存活率。
MTT是一种黄色的化学试剂，它能够被活细胞内的线粒体酶还原为紫色的产物。
通过测量产物的光密度，可以反映细胞的存活率。
实验结果与讨论：经过一定时间的培养和处理后，我们观察到不同浓度的化学物质对A549细胞的影响。
通过MTT法测定细胞存活率，我们得到了以下结果：在化学物质A的处理下，细胞存活率呈现浓度依赖性的下降趋势。
随着化学物质A浓度的增加，细胞存活率逐渐降低。
这表明化学物质A对A549细胞具有明显的毒性作用。
进一步的研究发现，化学物质A可能通过抑制细胞的DNA合成和蛋白质合成来导致细胞死亡。
与化学物质A相比，化学物质B对A549细胞的毒性作用较弱。
在较低浓度下，细胞存活率相对较高，但随着浓度的增加，细胞存活率逐渐降低。
这可能是因为化学物质B对细胞的毒性作用与其浓度成正相关。
进一步的研究发现，化学物质B可能通过干扰细胞的氧化还原平衡和细胞膜的完整性来导致细胞死亡。
化学物质C对A549细胞的毒性作用相对较弱。
在较低浓度下，细胞存活率接近对照组水平，但随着浓度的增加，细胞存活率逐渐降低。
进一步的研究发现，化学物质C可能通过干扰细胞的代谢过程和细胞凋亡通路来导致细胞死亡。
细胞毒性实验
细胞毒性实验简介细胞毒性实验是一种常用的生物学实验方法，用于评估物质对生物体的细胞毒性。
通过测量物质对细胞的影响，可以判断其是否对细胞产生有害作用。
细胞毒性实验常被应用于药物研发、化学品评估以及毒性测试等领域，旨在确保物质的安全性和对生物体的可接受性。
实验步骤1. 细胞培养在进行细胞毒性实验之前，首先需要培养细胞。
选择适当的细胞系，如人类肺癌细胞株A549，将其放入细胞培养皿中，并添加培养基（常用的培养基包括DMEM、RPMI 1640等）。
将细胞培养在恒温恒湿的培养箱中，通常培养温度为37°C，CO2含量为5%。
2. 细胞处理将待测试物质加入培养基中，与细胞一同培养。
通常会设置不同浓度的待测物质组，以便研究其剂量依赖性毒性效应。
同时，还需设置一个阴性对照组（仅含培养基）和阳性对照组（含有已知毒性的物质，如阿霉素）。
3. 细胞存活率检测根据细胞系的不同，可以选择合适的方法检测细胞的存活率。
常用的方法包括MTT法、SRB法和细胞计数法等。
- MTT法MTT法是一种测定细胞代谢活性的方法。
MTT（3-(4,5-二甲基-2-噻吩基)-2,5-二苯基-2H-四唑）是一种黄色溶液，可以被活细胞中的代谢酶还原为紫色的形式。
使用MTT溶液处理细胞后，将细胞溶胀后的产物溶解，通过分光光度计测量溶液的吸光度，间接反映细胞存活率。
- SRB法SRB法是通过测量细胞中蛋白质含量来评估细胞数量的一种方法。
在SRB实验中，细胞在培养皿中固定后，使用SRB染色剂染色。
待染色剂固定后，通过溶解并测量其吸光度，可以间接反映细胞存活率。
- 细胞计数法细胞计数法是直接计数细胞数量来评估细胞存活率的方法。
将细胞用适当的缓冲溶液（如PBS）稀释后，使用血细胞计数器或显微镜进行细胞计数。
通过对细胞数量的统计，可以计算出细胞存活率。
4. 数据分析将实验得到的数据进行统计和分析。
使用适当的统计方法，比如t检验或方差分析，来判断待测物质对细胞的毒性作用是否存在显著差异。
Mtt说明说和使用方法
产品简介：1. MTT细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒(MTT Cell Proliferation and Cytotoxicity Assay Kit)被广泛应用于细胞增殖和细胞毒性的实验方法。
由于细胞活力与细胞数呈正相关，因此常常用来检测细胞的增殖情况。
MTT可以被线粒体内的一些脱氢酶还原生成结晶状的深紫色产物formazan。
在特定溶剂存在的情况下，可以被完全溶解。
然后通过酶标仪可以测定570nm波长附近的吸光度。
细胞增殖越多越快，则吸光度越高；细胞毒性越大，则吸光度越低。
2. 本试剂盒采用了独特的Formazan溶解液配方，无需去除原有的培养液，可以直接加入Formazan溶解液溶解formazan。
从而避免了由于去除培养液时formazan被部分去除而引起的误差。
3. 本试剂盒背景低，灵敏度高，线性范围宽，使用方便提高了可靠性。
4. 本产品为500 次（5个96孔细胞培养板）操作。
产品内容：MTT染色液5ml Formazan溶解液55ml 说明书1份保存条件：MTT染色液需-20℃避光保存；Formazan溶解液可以室温保存。
注意事项：1. 由于使用96孔板进行检测，如果你的细胞要养48 h或更长，建议不要吝啬96-孔板的四周边孔，这32 个边孔不能使用，建议加入灭菌PBS以饱和中间64个孔的水分。
因为细胞培养过程中，边孔的水分蒸发很快，培养液及里面的药物会出现浓缩现象，细胞的状况就复杂了2. MTT溶剂在低温情况下会凝固，使用前请室温放置或20-25℃水浴温育片刻至全部融解后使用。
3. MTT一般最好4ºC避光保存两周内有效，保存在-20度长期保存，避免反复冻融，最好小剂量分装，用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解，尤其当MTT变为灰绿色时就绝对不能再用了。
4. Formazan溶解液结冻或产生沉淀时可以37℃水浴孵育以促进溶解，并且必须在全部溶解并混匀后使用。
5. 孵育时，须避光6. MTT有致癌性，用的时候小心,有条件最好带那种透明的簿膜手套.配成的MTT需要无菌，MTT对菌很敏感。
细胞毒性的检测
实验三、细胞毒性的检测一、实验材料及设备培养箱、雷杜RT-6100酶标仪、移液器（THERMO）、枪头、吸管、96孔板、盐水、PBS、1640培养液、离心管、血球计数板、CCK-8（日本同仁）二、实验步骤1、在96孔板中配置100微升的细胞悬液。
将培养板在培养箱中预培养24小时（37℃,5% CO2）（注：贴壁细胞最小的接种量为10000个/孔，细胞数目由血球计数板中计算得来，若计数时浓度太大，可以先稀释一定倍数取融合度为90%左右的细胞，吹打均匀，取样计数一般细胞接种后贴壁大约需要2~4小时，但是不同类型的细胞所需要的时间有差异，根据实验情况而定细胞悬液一定要混匀，培养基周围容易挥发，为减少误差，建议培养板的四周只加培养基，而不作为检测孔）。
2、向培养板加入10微升不同浓度的待测物质。
在培养箱中孵化一段时间。
（6、12、24、48，时间根据OD值来选择，OD值在1.0~2.0都可以，最好在1.0附近比较好，时间根据细胞周期来定，起码要一代以上的时间）3、向每孔加入10微升CCK-8溶液，加完后轻轻敲击培养板以帮助混匀。
【注：每孔培养基体积的10%加入CCK-8，注意不要在孔中形成气泡，他们会影响OD值得读数。
如果待测物质有氧化或者还原性的话，或者细胞培养时间较长使得培养基颜色或者pH发生变化的话，可以在加CCK-8之前更换新鲜培养基（除去培养基，并用培养基洗涤细胞俩次，然后加入新的培养基），去掉药物影响。
斜贴壁加CCK-8,不要插到培养基下，容易产生气泡，干扰读数，而且速度要快，减少试剂在移液器上的残留，加后要轻轻地振荡培养板使试剂和培养基充分混合，可以将CCK-8用培养基稀释一倍，混匀后每孔加20uL使用】4、将培养板在培养箱内孵育1~4小时。
（细胞不同形成的甲臜的量也不同，如果显色不够的话，可以继续培养，以确定最佳条件建议BEL-7402 2h，）。
5、用酶标仪测定在450nm处的吸光度。
mtt法检测细胞毒性原理
mtt法检测细胞毒性原理
MTT法是一种常用的细胞毒性检测方法。
其原理基于细胞代
谢活性与细胞数量之间的关系。
该方法利用一种叫做MTT的
化学物质，它能够被细胞内的还原酶所代谢并转化为紫色的结晶物。
这种发色反应与细胞的代谢活性相关，正常细胞代谢活性高，转化的MTT结晶物也就越多，溶液颜色越深。
而有细
胞毒性的物质会影响细胞的代谢活性，导致MTT转化的结晶
物减少，溶液颜色较浅。
MTT法的操作步骤包括：首先将待测物质添加到包含细胞的
培养基中，培养一定时间使细胞与物质相互作用；然后加入MTT试剂，培养一段时间使其被细胞代谢转化成紫色的结晶物；接下来，将培养基移除，加入溶解剂使MTT结晶物溶解；最后，通过分光光度计测量吸光度来评估细胞的代谢活性，进而判断物质对细胞的毒性。
MTT法具有操作简便、结果可靠的特点，被广泛应用于评估
药物、化学物质和各类材料对细胞毒性的影响。
它可用于筛选有潜在毒性的化合物，评估细胞对新药物的敏感性，并对材料的生物相容性进行评估。
生物学评价之细胞毒性试验
生物学评价之细胞毒性试验1范围细胞毒性试验是利用细胞体外培养方法来评价医疗器械或其浸提液可滤出成分中急性细胞毒性的潜在性。
2 试验项目选择（推荐）根据GB/T16886.5-1997标准中有关细胞毒性试验的要求，现推荐下面任何一种细胞毒性试验方法评价医疗器械的细胞毒性，即琼脂覆盖法，分子滤过法，生长抑制法。
3 试验条件（1）细胞株可以使用已建立的细胞株，目前我国使用较多的是L-929（小鼠结缔组织成纤维细胞）和V-79（中国地鼠肺成纤维细胞）。
（2）培养基培养基及其血清浓度的含量应能适合所选择细胞株的生长，满足细胞生长的需要。
培养基内含抗生素的量应不引起细胞毒性，以免影响材料的评价，含血清和谷氨酰胺的培养基在2~8℃贮存不能超过一周，只含谷氨酰胺不含血清的培养基在2~8℃贮存不能超过一个月，培养基的pH值在7.2~7.4之间，所有培养用液都应是无菌的。
（3）样品的制备•试验样品的制备。
试验样品应选择材料本身或其浸提液进行。
试验材料应用最终产品。
制备材料浸提液的条件往往是夸大临床应用的条件来评价样品潜在的细胞毒性，但不能引起样品严重的变化（如溶解或其化学结构改变），浸提液应在制备后的24h内使用；固体材料应至少有一个平面使其利于在细胞层或琼脂层相接触，各种试验样品在试验时均应经无菌处理。
•阴性对照。
应是已知无细胞毒性的物质。
对于合成高分子材料，高密度聚乙烯较为适宜，牙科材料则可用氧化铝陶瓷作为阴性对照。
•阳性对照。
是已知的有一定细胞毒性的物质。
推荐含锡的聚氯乙烯作为固体材料或浸提液的阳性对照。
稀释苯酚亦可作为浸提液的阳性对照。
4 试验方法1)琼脂覆盖法•目的：本试验是为了评价医疗器械科浸提成分的急性细胞毒性。
•范围：本试验方法适用于固体（粉末，纤维状，金属），液体等试验材料。
•试验样品的制备。
试验样品：将试验样品制成100mm2的圆形，要求边缘光滑整齐。
液体材料用0.1mL的样品吸收在同面积的无菌滤纸片或纤维素上。
生物相容性检测报告
生物相容性检测报告生物相容性是指生物材料与生物体接触后，不引起明显的毒性、刺激、过敏或致病反应，并能与周围组织协调地相容，不影响生物体的正常功能。
因此，对于生物材料的生物相容性检测显得尤为重要。
本报告将对生物相容性检测的相关内容进行详细介绍，包括检测项目、检测方法和结果分析。
一、检测项目。
1. 细胞毒性测试，通过培养细胞与待检测生物材料接触，观察细胞形态、增殖和代谢情况，判断生物材料对细胞的毒性作用。
2. 致敏原性测试，采用皮肤致敏试验或淋巴细胞转化试验，评估生物材料对机体免疫系统的致敏作用。
3. 局部刺激性测试，将生物材料置于动物体表面或植入体内，观察局部组织的炎症反应和愈合情况，评估其对组织的刺激性。
4. 植入体内毒性测试，将生物材料植入动物体内，观察其对机体的毒性作用，包括局部和全身毒性反应。
二、检测方法。
1. 细胞毒性测试，采用MTT法、LDH释放法等细胞毒性试验方法，对生物材料的细胞毒性进行评估。
2. 致敏原性测试，采用皮肤致敏试验或淋巴细胞转化试验，评估生物材料的致敏原性。
3. 局部刺激性测试，采用动物体表面接触试验或植入体内试验，观察生物材料对组织的刺激性作用。
4. 植入体内毒性测试，将生物材料植入动物体内，观察其对机体的毒性作用，包括局部和全身毒性反应。
三、结果分析。
经过上述多项生物相容性检测项目和方法的综合评估，得出如下结果：1. 待检测生物材料对细胞没有明显的毒性作用，细胞形态正常，增殖和代谢情况良好。
2. 待检测生物材料对机体免疫系统无致敏作用，不会引起过敏反应。
3. 待检测生物材料在动物体表面或植入体内无明显的刺激性作用，对组织无明显的炎症反应。
4. 待检测生物材料植入动物体内后，无明显的局部和全身毒性反应。
综上所述，待检测生物材料在生物相容性方面表现良好，符合生物材料的生物相容性要求。
结语。
生物相容性检测是生物材料研发过程中的重要环节，通过科学的检测方法和手段，能够全面评估生物材料与生物体的相容性，为生物材料的临床应用提供重要参考。
细胞培养板检测标准
细胞培养板检测标准细胞培养板是细胞培养实验中常用的携带培养基的基质，用于支持和促进细胞的生长和增殖。
为了确保实验结果的准确性和可重复性，细胞培养板的质量控制至关重要。
本文将介绍细胞培养板的检测标准，以确保在细胞培养实验中获得可靠的结果。
一、外观检查细胞培养板的外观检查是初步评估其质量的重要步骤。
正常的细胞培养板应该是透明的，无明显的瑕疵或污染物。
在光线充足的环境下，仔细观察细胞培养板的表面和侧壁，确保无脏污、变色、裂纹或其他影响实验的问题存在。
二、无菌检测细胞培养实验要求无菌条件，因此，细胞培养板的无菌性是必须验证的。
常用的方法是通过培养基接种实验或无菌测试纸评估其无菌状态。
在培养基接种实验中，将细菌或真菌接种于细胞培养板中，然后在适当的培养条件下观察生长情况。
如果培养基无菌，则观察期间不应有任何菌落的出现。
无菌测试纸可以直接放置在细胞培养板内，检测是否会有颜色的发生，用于判断是否存在细菌或真菌的污染。
三、细胞附着性检测细胞附着性是细胞生长的关键步骤，因此，细胞培养板的表面特性对细胞的附着能力至关重要。
常用的检测方法包括浸润角测量、水接触角测量和比色法。
浸润角测量通过观察液体滴在细胞培养板表面的形态以评估其亲水性或疏水性。
水接触角测量可以进一步量化评估，水滴在细胞培养板表面上形成的角度。
比色法可以用于评估附着细胞数量，通过细胞染色和比色分析，确定细胞在细胞培养板上的附着情况。
四、毒性测试细胞培养板材料的毒性是一个必须要考虑的因素。
细胞培养板不应对细胞产生有害影响。
常用的毒性测试方法包括MTT（3-(4,5-二甲基-2-噻唑酰胺基)-2,5-二苯基四唑）试验和细胞增殖试验。
MTT试验通过将MTT溶液加入培养基中，根据细胞的代谢活性生成紫色的产物，然后通过比色分析测定代谢活性水平。
细胞增殖试验则通过比较在培养板中不同时间点的细胞数量来评估细胞的毒性。
五、蛋白吸附检测细胞培养板的表面会与细胞外基质或血清中的蛋白质接触，因此，细胞培养板的蛋白吸附性也是需要评估的一个因素。
细胞毒实验实验报告南方医科大学
细胞毒实验实验报告南方医科大学细胞毒性实验是生物学评估和筛选测试之一，该测试使用体外组织细胞观察医疗器械对细胞生长，繁殖和形态的影响。
细胞毒性实验旨在评估医疗器械和材料的一般毒性。
测试包括在细胞培养基中提取设备，然后将提取液暴露于小鼠成纤维细胞（L929）。
在使用定性或定量方法评估细胞之前，允许细胞在提取液中生长指定的时间。
该测试是在所有与患者接触的医疗设备，原材料以及经过清洁验证或剩余制造的设备上执行的。
虽然可以通过多种不同的方法进行测量，但是通过使用重要染料（福尔马赞染料），蛋白酶生物标志物或通过测量ATP含量来评估细胞活力是确定细胞毒性的最常用方法。
常见的四唑盐包括INT，MTT，MTS和XTT。
通常在371C的补充了血清的哺乳动物细胞培养基（MEM）中提取设备材料。
提取后，将提取物与L929细胞（小鼠成纤维细胞）单层接触。
然后使细胞在提取液中生长指定的时间，然后使用定性或定量方法对细胞进行评估。
生物医学材料安全性评价
生物医学材料安全性评价随着人类对医疗健康的重视，生物医学材料的应用日益增多，其安全性评价也成为医学领域研究的热点问题。
生物医学材料是指在医学和生物学领域，用于生物体内、外部修复、重建组织、器官或器件的材料和器械。
与传统材料不同，生物医学材料与人体组织相互作用，因此需要专门的安全性评价体系，确保它们在人体内的应用不会造成不良反应和健康风险。
一、安全性评价体系安全性评价体系是对生物医学材料进行安全性评估的标准和方法。
其包含生物学评价、生理学评价、毒理学评价、免疫学评价、微生物学评价、生物相容性评价等多个方面。
（一）生物学评价生物学评价主要包括微观和宏观两个级别。
微观的生物学评价主要是查看细胞是否有受损和细胞增殖情况，通常通过细胞培养来完成。
而宏观生物学评价主要是通过观察生物学材料的整体影响来评价安全性。
一般来说，宏观生物学评价会优先于微观生物学评价。
（二）生理学评价生理学评价主要评估生物学材料对身体系统的影响，如改善肌肉力量，加快愈合过程等。
为了进行这种评价，需要在实验室和临床分别进行实验和观察。
（三）毒理学评价毒理学评价是对生物材料在人体内外毒理反应的评估。
通过毒理学评价，可以找出生物医学材料的不良作用和可疑成分，开发更安全的替代品，并提高产品安全性和有效性。
（四）免疫学评价免疫学评价是对材料是否引发免疫反应的评价。
免疫反应是最常见的不良反应之一，因此对于有免疫反应可能的生物医学材料，必须进行免疫学评价。
（五）微生物学评价微生物学评价主要是评估生物医学材料中微生物污染的可能性和影响。
如材料需要用于外科手术，特别需要注意微生物污染问题。
（六）生物相容性评价生物相容性评价主要是评估生物医学材料是否在不良反应或排斥反应中异物反应。
生物相容性评价是生物医学材料安全性评估中比较重要的一环。
二、常见检测方法生物医学材料的安全性评价需要使用多种检测方法，下面列举几种：（一）细胞毒性检测细胞毒性检测可以通过与细胞培养体系的细胞模型相结合，对各种可能会通过细胞膜和细胞质等进入宿主细胞的生物医学材料进行毒理学安全评价。
动物细胞培养和细胞毒性测试的研究
动物细胞培养和细胞毒性测试的研究随着生物技术和医学研究的不断发展，动物细胞培养和细胞毒性测试成为了重要的工具。
动物细胞培养是指将动物细胞从体内分离出来，使其在人工培养条件下维持其生长和分化的一种技术。
细胞毒性测试则是通过对细胞对某种物质的反应，来评估该物质对细胞的危害程度。
在生物医药领域，这两项技术可以用于药物筛选、新药研发、毒性评价等方面。
动物细胞培养的建立动物细胞培养的建立可以追溯到20世纪初。
当时，人们对细胞结构和功能有了初步认识，开始探索不同动物细胞在培养基中的生长情况。
在20世纪50年代，随着细胞培养技术的进一步发展，人们可以培养出越来越多种类的细胞。
培养出的细胞可以在体外维持其特有的生理功能和代谢过程，从而成为了进行细胞毒性测试、植物和动物细胞的研究的重要试验材料。
目前，动物细胞培养技术的发展已经非常成熟。
人们能够在实验室内通过不同的培养条件，培养出多种细胞，包括人类癌细胞、小鼠胚胎细胞、大鼠成纤维细胞等。
这些细胞在培养基中的生长和分化过程与体内相似，能够模拟人体生物学过程，从而成为了生物学、药学和医药领域的重要工具。
细胞毒性测试的意义和流程细胞毒性测试的意义在于评估物质对细胞的毒性程度以及其对人体健康的危害性，一般可以分为以下步骤：第一步是筛选化合物，即考察化合物的生物活性。
这一步通常采用高通量筛选技术，可以同时测试多个化合物的生物活性。
第二步是确定化合物的毒性程度。
在该步骤中，通常使用细胞文化技术，比如细胞增殖检测法和细胞毒性测定法。
这些技术可以测量化合物对细胞的影响，包括它的毒性以及对细胞的增殖、分化和细胞形态的影响。
第三步是确定化合物的毒性机制。
在该步骤中，需要对受影响的细胞进行深入研究，以了解化合物产生毒性的原因。
这些研究可以探讨影响细胞增殖的通路、凋亡机制和细胞信号传导途径等。
细胞毒性测试在医学和药学领域中有重要的应用。
在药物研发的早期阶段，通常会对药物进行细胞毒性测试，以确定药物是否对人体安全。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
器官培养 (Organ culture)：将活体中整个 器官或一部分器官取出， 置于体外生存、生长并同 时保持其一定的结构和功 能特征。
组织培养 (Tissue culture)：把活体的一小 片组织（O.5～1立方毫米） 置于底物上孵育，细胞自 其周围移出并生长。
细胞培养(cell culture)： 把提取的组织用机械或消 化的方法分散成单个细胞 悬液，后进行培养，增殖。
粘着、粘附 （attachment）
铺展 （spreading)
组织块培养法
1）取材 → 切割
（原代培养） 消化培养法
2）直接购买 → 培养
传代
体外培养的原代细胞或细胞株要在体外持续地培养就必须传代，以 便获得稳定的细胞株或得到大量的同种细胞，并维持细胞种的延续。
培养的细胞形成单层汇合以后，由于密度过大生存空间不足而引起 营养枯竭，将培养的细胞分散，从容器中取出，以1:2或l:3以上的比率 转移到另外的容器中进行培养，即为传代培养。
1907年Harrison 和1912年 Carrel开始把组织培养作为一种 方法，用于研究离体动物细胞 的培养。
他建立的鸡胚胎成纤维细胞 持续了34年之久(1912-1946)
Alexis Carrel France Rockefeller Institute for Medical Research New York, NY, USA b. 1873 d. 1944
主要由无机盐和葡萄糖配制而成 作用：维持渗透压、缓冲和调节酸碱度 常用的缓冲液：
生理盐水 PBS Hanks液 （D-Hank’s常用于配制胰酶溶液）
通常是青霉素和链霉素联合使用，俗称“双抗 溶液”。
配制
具体操作均在超净台内完成。青霉素是80万U/瓶，用注 射器加4ml灭菌双蒸水。链霉素是100万U/瓶，加5ml灭 菌双蒸水，即每毫升各为20万U。
传代细胞：在体外培养条件下持续 传代培养的细胞
无菌
无毒、生物相容性
清洁的环境
品质良好的细胞来源，培养基配制使用高纯度药品和 去离子水
有标准化的工作方法
培养用的液体极多，应由专人负责，配制浓度准确， 所有配好的溶液瓶上都要标明名称、浓度、消毒与否 和制备日期等
一切培养用品都要有固定的存放点，避免杂乱无章， 其中尤其重要的是：培养用品与非培养用品应严格分 开，已消毒品与未消毒品应分别存放
消化时间： 用含血清培养液终止其对细胞的消化作用。
物品 湿热 干热 过滤 紫外
培养室 工作台＋Fra bibliotek玻璃 制品
＋
＋
金属 器械
＋
＋
塑料 制品
橡胶 制品
＋
培养 用液
＋
＋
布类 棉类
＋
＋
化学 气体
消毒剂
电离 辐射
＋＋
＋
＋＋
＋＋＋
＋＋＋
4.细胞培养的基本方法
贴附生长型细胞 必须贴附于底
物才能生长的细 胞。从形态上大 体分为上皮细胞 型及成纤维细胞 型，还有一些难 以确定其稳定形 态的细胞。
× ×
基础培养基 血清 青、链霉素
80％～95％ 5％～20％ 各100U／ml
天然培养基： 血清
血浆 组织提取液（如鸡胚和牛胚浸液）
合成培养基： 根据细胞生存所需物质的种类和数量，用人工方法
模拟合成的。 包括四大类物质：无机盐、氨基酸、维生素、碳水化合
物 目前常用培养基：RPMI-1640、DMEM、M199、MEM、 人工合成培养基只能维持细胞生存，要想使细胞生长和
前言 细胞培养的基本概念 细胞培养的基本条件 细胞培养的基本方法 细胞培养的污染和检测 细胞冻存和复苏 细胞管理及保藏 细胞毒性检测
1.前言
1885年Roux最早尝试使组 织离体培养，材料是鸡胚神经 板，采用生理盐水为培养液， 并首次采用组织培养这个术语。
Wilhelm Roux (1850-1924 )
肿瘤
胚胎
成体
粗切
消化
细切
修切
细胞培养 组织培养 器官培养
活细胞 便于观察检测 条件可控 均一性 便于人工筛选
失去原有组织结构和形态，趋向单一性 分化减弱 可能获得不死性
贴壁型：动物的正常细胞 悬浮型：血液淋巴细胞、肿瘤细胞、植物细胞 固定化培养
来源：由中胚层间充质组织起源的组织 如：真正的成纤维细胞 心肌，平滑肌，成骨细胞，内皮细胞
使用时溶入培养液中，使青、链霉素的浓度最 终为100U/ml。
庆大霉素：使用终浓度为100U/ml，广谱、稳定。
主要作用：
水解与赖氨酸或精氨酸相连接的肽键，除去细胞间粘蛋 白及糖蛋白，使贴壁细胞从瓶壁上脱落并使细胞分离。
常用浓度：0.25%
用无Ca2+、Mg2+的PBS缓冲液或D-Hank’s配制，用滤 器过滤除菌。
无菌条件：净化工作室，风淋室，传递窗，高 效过滤器，洁净层流罩，生物安全柜，超净工 作台，紫外灯，电热干燥箱，滤器，高压灭菌 器，抗生素 细胞生长条件：培养板，培养瓶，CO2培养箱， 培养基，血清
细胞检测条件：倒置显微镜，酶标仪，微孔板 震荡器，高速离心机，移液器 细胞保存条件：液氮罐，超低温冰箱
形态：似体内成纤维细胞的形态 胞体梭形或不规则三角形 胞质向外伸出2—3个长短不等的突起 中有卵圆形核
生长特点： 排列成放射状，漩涡状 并不紧靠连成片， 细胞—细胞接触易断开而单独行动
原代细胞：从机体取出后立即培养 的细胞
原代培养：将从体内取出的细胞进 行培养
传代培养：从原代培养细胞继续转 接培养
繁殖，还需补充一定量的天然培养基（如血清）。
常用血清 胎牛血清、新生牛血清、小牛血清、兔血清、 马血清等
优质血清的标准 透明，淡黄色，无沉淀物，无细菌、支原体、 病毒污染。
血清的灭活（消除补体活性） 56℃ ，30 分钟。
血清的消毒：过滤除菌
其他细胞培养用液
水：新鲜的三蒸水或去离子水 平衡盐溶液
超净工作台 高压蒸汽灭菌器 过滤除菌装置 倒置显微镜 水纯化装置 恒温培养箱 电热干燥箱 离心机、天平、水浴、摇床 液氮罐 冰箱：4℃、-20 ℃ 、-80 ℃
移液器 移液管 吸管 培养瓶： 25cm2、75cm2、150cm2 培养皿： 30、60、120毫米 多孔培养板： 4、6、24、96孔 离心管 冻存管