测量酶方法
酶活性的测定方法
酶活性的测定方法
酶活性的测定方法有多种。
以下列举了常见的几种方法：
1. 酶动力学法：通过测定酶催化底物转化为产物的速率，来确定酶活性。
常用的酶动力学方法有初始速率法、双重倒数法、利用酶反应速率与底物浓度的关系等。
2. 比色法：利用酶与底物反应后产生的色素变化进行酶活性测定。
例如，过氧化物酶活性可通过测量其催化产生的有色产物浓度的变化来确定。
3. 荧光法：利用酶与底物反应后产生的荧光变化进行酶活性测定。
荧光法的灵敏度高，操作简便。
例如，酯酶活性可通过测量底物转化为产物后产生的荧光强度的变化来确定。
4. 放射性同位素法：将放射性同位素标记在底物上，通过测量酶催化底物与同位素的结合来确定酶活性。
例如，放射性同位素法可用于测定DNA聚合酶活性。
5. 电化学法：利用酶与底物反应后产生的电流变化进行酶活性测定。
常用的电化学方法包括循环伏安法和电化学阻抗法。
例如，葡萄糖氧化酶活性可通过测量产生的电流与葡萄糖浓度之间的关系来确定。
值得注意的是，不同酶具有不同的理化性质和催化机制，因此需要根据具体酶的
特性选择适合的测定方法。
酶标仪测酶的使用流程
酶标仪测酶的使用流程1. 准备工作在使用酶标仪之前，首先需要进行一些准备工作，以确保实验顺利进行。
1.1 酶标仪器准备•将酶标仪置于干净的实验台上，确保仪器平稳放置。
•打开酶标仪电源，并等待仪器启动和进入工作状态。
•检查仪器是否连接到电脑或打印机等外设。
1.2 试剂准备•根据实验需求，准备好所需的试剂和底物，确保试剂的保存期限在有效期内。
•按照试剂说明书的要求，将试剂稀释至适当的浓度，用于后续实验操作。
2. 样品处理在进行酶标仪实验之前，需要对样品进行适当的处理和准备。
2.1 样品采集•根据实验设计，采集待测样品，并确保样品储存条件符合要求，如冷藏或冷冻保存。
•样品采集时需注意操作规范，避免污染和交叉感染。
2.2 样品制备•根据具体实验要求，将待测样品进行适当的处理和制备，如离心、过滤或稀释等。
•样品制备过程中应采取严格的无菌操作，避免污染对结果的影响。
3. 酶标仪实验操作步骤经过准备工作和样品处理后，即可按照下述步骤在酶标仪上进行实验。
3.1 仪器设置•在酶标仪上选择相应的实验模式，并根据试剂和测量参数设置仪器。
•设置酶标仪的波长，通常为450nm或620nm，根据实验需求进行选择。
3.2 标准曲线建立•准备一系列不同浓度的标准溶液，并确保每个浓度的标准溶液准确地配制。
•获取酶标仪的测量数据，并绘制标准曲线，用于后续待测样品的定量测量。
3.3 样品测量•将样品加入到酶标仪的反应孔中，确保每个孔的样品用量相等。
•启动酶标仪，设定相应的测量参数，如测量时长或间隔时间。
•酶标仪完成测量后，记录或导出测量数据。
3.4 数据处理•根据标准曲线和测量数据，计算出待测样品中酶的活性或浓度值。
•根据实验的需求和要求，采用适当的统计学方法进行数据分析和结果解释。
4. 实验结束和清洁实验完成后，需要进行相应的结束和清洁工作。
4.1 仪器关闭•关闭酶标仪电源，并将仪器置于安全的位置。
•断开与电脑或打印机等外设的连接。
检测酶的活性的方法
检测酶的活性的方法
有许多方法可以检测酶的活性，以下列举了几种常见的方法：
1. 光度法（spectrophotometry）：该方法测量在酶催化下产生的化学反应的光学性质变化，例如吸光度或荧光强度的变化。
通过测量反应体系中的光学信号，可以推断酶的活性。
2. 比色法（colorimetry）：该方法通过测量在酶催化下产生的产物或底物的颜色变化来确定酶活性。
通过将反应体系加入适当的底物和试剂，酶催化的产物会导致溶液颜色的变化，可以通过光学检测方法来测量和分析产物的含量。
3. 标记底物法（labeled substrate assay）：该方法利用带有特定标记的底物，例如放射性同位素或荧光染料。
酶催化底物的反应会导致标记物的释放或改变，从而可以通过测量标记物的数量来推断酶的活性。
4. 电化学法（electrochemistry）：该方法利用酶催化电化学反应导致电流或电势的变化来检测酶的活性。
常见的技术包括循环伏安法（cyclic voltammetry）和电化学阻抗谱法（electrochemical impedance spectroscopy）等。
5. 放射性测量法（radiometric assay）：该方法利用酶催化底物与放射性同位素结合，通过测量底物的放射性衰变来确定酶的活性。
6. 质谱法（mass spectrometry）：该方法利用质谱技术分析酶催化反应产生的气相或溶液中的离子组成。
可以通过检测反应体系中特定的离子峰来推断酶的活性。
以上只是部分常见的酶活性检测方法，具体的方法选择取决于研究的酶类型、底物和实验条件等因素。
测量酶方法
氮蓝四唑（NBT）法测定超氧物歧化酶（SOD）活力一、原理超氧物歧化酶（superoxidedismutase , SOD）普遍存在于动、植物体内，是一种清除超氧阴离子自由基的酶。
本实验依据超氧物歧化酶抑制氮蓝四唑（NBT）在光下的还原作用来确定酶活性大小。
在有氧化物质存在下，核黄素可被光还原，被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生02,可将氮蓝四唑还原为蓝色的甲腙，后者在560nm处有最大吸收。
而SOD可清除02，从而抑制了甲腙的形成。
于是光还原反应后，反应液蓝色愈深，说明酶活性愈低,反之酶活性愈高。
据此可以计算出酶活性大小。
二、材料、仪器设备及试剂（一）材料；水稻或小麦叶片（二）仪器设备： 1.高速台式离心机； 2.分光光度计； 3.微量进样器； 4.荧光灯（反应试管处照度为4000Lx）； 5.试管或指形管数支。
（三）试剂:1. 0.05mol/L 磷酸缓冲液（pH7.8）；2. 130mmol/L 甲硫氨酸（Met ）溶液：称1.9399gMet 用磷酸缓冲液定容至100ml（现用现配）；3.750卩mol/L氮蓝四唑溶液：称取0.06133gNBT用磷酸缓冲液定容至100ml,（避光保存）；4. 100卩mol/L EDTA- Na2溶液：称取0.03721gEDTA— Na2用磷酸缓冲液定容至1000ml ；5. 20卩mol/L核黄素溶液：称取0.0753g核黄素用蒸馏水定容至1000ml（避光保存）。
三、实验步骤1. 酶液提取取一定部位的植物叶片（视需要定，去叶脉）0.5g于预冷的研钵中，1ml预冷的磷酸缓冲液在冰浴上研磨成浆，加缓冲液使终体积为5ml。
取1.5〜2ml于1000rpm下离心20min，上清液即为SOD粗提液。
2. 显色反应取5ml指形管（要求透明度好）4支，2支为测定管，另2支为对照管，按下列加入各溶液：试剂（酶）用量（ml）终浓度（比色时）0.05mol/L磷酸缓冲液 1.5130mmol/L Met溶液0.313mmol/L 750 卩mol/L NBT 溶液0.375 卩mol/L 100 卩mol/L EDTA—Na2 液0.310 卩mol/L 20 卩mol/L核黄素0.320卩mol/L酶液0.052支对照管以缓冲液代替酶液蒸馏水0.25总体积3.0 混匀后将1支对照管置暗处，其它各管于4000LX日光下反应20min （要求各管受光情况一致,温度高时间缩短,低时延长）。
酶活性的检测方法
DNS 还原糖 显色反应
比色法
蔗糖转化酶的活性检测： 光谱学检测
蛋白酶活性的检测：
BBA - Proteins and Proteomics, 1864 (1), 2016, 130-142
酶活性的检测方法
（二） HPLC检测法
植酸酶的活性检测方法： （植酸酶催化的脱磷酸反应的探针）
Soil Biology & Biochemistry 41 (2009) 192-200
酶活性的检测方法
酶活性的检测方法
（五） 耦合反应法（可耦合脱氢酶反应） 脱氢酶以NADH/NADPH为辅酶
NADH/NADPH的转换可耦 合340nm吸光度变化：
酶活性的检测方法
葡萄糖激酶的活性检测：
3.反应条件应有利于指定反应方向的进行，可以移除生成 物，或接上耦合反应。
二、酶活性的检测方法
直接测定生成物
耦合反应法 （可耦合脱氢酶反应）
光谱学检测法 HPLC检测法 化学测定法 电极检测法
酶活性检测的具体方法
（一） 光谱学检测法
• 生成物有特定的紫外或荧光吸收
木聚糖酶、纤维素酶活性检测：
木聚糖 羧甲基纤维素
主要内容
酶催化反应原理 酵素产品部分酶活性的检测
一、酶催化反应原理
把催化反应转化成可测量的模式
Juang RH (2005) EPA
测量酶催化活性应注意的事项
酶活性的检测通常是指催化活性的检测，建立活性检测步 骤时，应注意：
1.测定生成物的产生量比测定反应物的消失量），回 馈抑制酶反应。
酶活性的检测方法
（三） 化学测定法
• 如果生成物不具有光谱学特性，可以通过化学反应使之转化成 具有特定光谱吸收的物质，进而进行测定。
酶活性测量的方法有哪几种
酶活性测量的方法有哪几种酶活性测量是评估酶在特定条件下，催化底物转化为产物的能力的一种方法。
根据不同的酶特性和底物/产物的特性，可以使用多种方法来测量酶的活性。
以下是常见的酶活性测量方法：1. 比色法：比色法是最常用的测量酶活性的方法之一。
在酶催化底物转化为产物之后，产生的有色化合物可以通过分光光度计来测量其吸光度。
比色法适用于各种酶的测量，包括氧化还原酶、氨基酸酶等。
2. 荧光法：荧光法是利用酶底物转化为产物之后所产生的荧光来测量酶活性的方法。
这种方法通常需要在底物或产物中引入荧光染料，通过测量荧光信号的强度来定量酶活性。
荧光法对于具有较高灵敏度要求的酶活性测量非常有用，例如蛋白酶、DNA酶等。
3. 发光法：发光法是利用酶催化底物转化为产物后所产生的光来测量酶活性的方法。
这种方法通常需要在底物或产物中引入发光底物或荧光染料，通过测量其发光强度来测量酶活性。
发光法对于对时间分辨率要求较高的酶活性测量非常有用，例如ATP酶、NADH酶等。
4. 放射性法：放射性法是利用酶催化底物转化为产物后所释放的放射性物质测量酶活性的方法。
该方法需要在底物或产物中引入放射性同位素，通过测量其放射性强度来定量酶活性。
放射性法对于具有极高灵敏度要求的酶活性测量非常有用，例如DNA聚合酶、RNA酶等。
5. 电化学法：电化学法是利用酶催化底物转化为产物后所产生的电流来测量酶活性的方法。
这种方法通常需要在底物或产物中引入可反应的电活性物质，通过测量电流来定量酶活性。
电化学法对于某些具有电催化酶活性的酶测量非常有用，例如葡萄糖氧化酶、酒精脱氢酶等。
6. 色谱法：色谱法是利用酶催化底物转化为产物后所产生的物质在色谱柱上的分离来测量酶活性的方法。
这种方法通常需要在底物或产物中引入特定的标记物质，通过测量标记物质在色谱图谱上的峰面积或峰高度来定量酶活性。
色谱法对于某些底物或产物具有特定的分离性质的酶活性测量非常有用，例如激酶、酮糖酶等。
酶标仪终点法、动力学法和光谱扫描
酶标仪是一种用于测定酶活性的仪器，它可以通过多种方法来检测酶对底物的作用，其中包括终点法、动力学法和光谱扫描。
这三种方法各有特点，适用于不同类型的酶活性研究。
在本文中，我将深入探讨这三种方法的原理、应用和局限性，以便你能更全面地了解酶标仪在酶活性研究中的应用。
1. 酶标仪终点法酶标仪终点法是通过观察反应终点时酶对底物的转化情况来测定酶活性的一种方法。
在进行实验时，可以在不同时间点上停止反应，并通过测定产物的浓度来推断酶在不同时间点上的活性水平。
这种方法简单易行，特别适用于一些较为稳定的酶反应。
然而，由于无法确定反应速率的变化情况，终点法并不能提供酶反应动力学信息，因此在动态反应中的应用受到一定的局限。
2. 酶标仪动力学法相较于终点法，酶标仪动力学法能够提供更为全面的酶活性信息。
动力学法通过实时监测酶对底物的转化速率来确定酶活性的变化情况，从而可以得到酶的最大反应速率、米氏常数等重要参数。
这种方法适用于研究酶对底物的实时作用情况，能够全面了解酶的活性特性。
然而，动力学法需要实时测量反应产物的浓度变化，因此在实验设计和数据处理上较为繁琐，需要较高的实验技术。
3. 酶标仪光谱扫描除了以上两种方法外，酶标仪还可以通过光谱扫描来测定酶活性。
这种方法是通过监测反应产物在不同波长下的吸光度来推断酶对底物的转化情况，特别适用于一些对底物和产物的吸收光谱有明显差异的酶反应。
光谱扫描方法可以提供关于酶对底物的选择性和反应特异性的信息，对于特定类型的酶研究有重要意义。
然而，由于光谱扫描需要对反应产物的吸收特性进行精确测量，因此对于实验条件和数据校准要求较高。
综合来看，酶标仪终点法、动力学法和光谱扫描各有其适用范围和局限性。
在实际研究中，研究人员可以根据不同酶反应的特点选择合适的方法来进行酶活性测定。
而在今后的研究中，可以借助多种方法的综合应用，在更全面、深入地了解酶反应特性的基础上进一步探索酶的活性调控和应用前景。
在个人观点上，我认为酶标仪作为一种重要的酶活性测定仪器，在生物医学、生物工程和药物研发等领域具有重要应用前景。
酶活检测方法
酶活检测方法酶活检测方法是一种常见的生化实验方法，通过测定酶活性来评估生物体内某种特定酶的功能状态。
酶是生物体内的一种催化剂，可以加速化学反应的速率。
酶活检测方法通常用于生物医学研究和临床诊断中，其优点包括高灵敏度、高特异性和快速检测结果等。
酶活检测方法的原理是利用某种底物与酶反应产生的产物的化学性质不同，通过测量反应物或产物的浓度变化来评估酶活性。
常用的酶活检测方法包括光度法、荧光法、比色法等。
光度法是一种常用的酶活检测方法，它利用酶催化反应产生的产物吸收或散射光线的变化来测定酶活性。
光度法适用于测定酶活性较低的样品，如血清中的酶活性。
荧光法是一种高灵敏度的酶活检测方法，它利用酶催化反应产生的产物吸收或发射荧光的性质来测定酶活性。
荧光法适用于测定酶活性较高的样品，如细胞内的酶活性。
比色法是一种常用的酶活检测方法，它利用酶催化反应产生的产物吸收或反射光线的颜色变化来测定酶活性。
比色法适用于测定酶活性中等的样品，如尿液中的酶活性。
酶活检测方法的操作步骤包括样品处理、反应体系制备、反应条件控制、反应终止和测定等。
样品处理是酶活检测方法中的关键步骤，样品的处理方法应该根据不同的样品类型和检测要求进行不同的处理。
在酶活检测方法中，需要注意的是选择适当的底物和反应条件，以及对反应终止和测定的方法进行优化，以获得准确、可重复的结果。
此外，酶活检测方法还需要进行质量控制和质量保证，以确保实验结果的准确性和可靠性。
酶活检测方法是一种常用的生化实验方法，适用于生物医学研究和临床诊断中。
酶活检测方法的原理简单、操作方便、结果准确可靠，是现代生物医学研究和临床诊断的重要工具。
酶活测定方法
酶活测定方法还原法酶与底物在特定的条件下反应,酶可以促使底物释放出还原性的基团。
在此反应体系中添加化学试剂,酶促反应的产物可与该化学试剂发生反应,生成有色物质。
通过在特定的波长下比色,即可求出还原产物的含量,从而计算出酶活力的大小。
色原底物法通过底物与特定的可溶性生色基团物质结合,合成人工底物。
该底物与酶发生反应后,生色基团可被释放出来,用分光光度法即可测定颜色的深浅,在与已知标准酶所做的曲线比较后,即可求出待测酶的活力。
粘度法该法常用于测定纤维素酶、木聚糖酶和β-葡聚糖酶的活力。
木聚糖和β-葡聚糖溶液通常情况下可形成极高的粘度,当酶作用于粘性底物时木聚糖和β-葡聚糖会被切割成较小的分子使其粘度大为降低。
基于Poiseuille定律我们知道,只要测定一定条件下溶剂和样品溶液的运动粘度,便可计算特性粘数,并以此来判断酶的活力。
高压液相色谱法酶与其底物在特定的条件下充分反应后,在一定的色谱条件下从反应体系中提取溶液进行色谱分析,认真记录保留时间和色谱图,测量各个样的峰高和半峰高,计算出酶促反应生成物的含量,从而换算出酶活力的数值。
免疫学方法常用于酶活性分析的免疫学方法包括:免疫电泳法、免疫凝胶扩散法。
这两种方法都是根据酶与其抗体之间可发生特定的沉淀反应,通过待测酶和标准酶的比较,最终确定酶活力。
免疫学方法检侧度非常灵敏,可检侧出经过极度稀释后样品中的酶蛋白,但其缺点是不同厂家生产的酶产品需要有不同特定的抗体发生反应。
琼脂凝胶扩散法将酶作用的底物与琼脂混合熔融后,倒入培养皿中或载波片上制成琼脂平板。
用打孔器在琼脂平面上打出一个约4-5mm半径的小孔。
在点加酶样并培养24h以后,用染色剂显色或用展开剂展开显出水解区,利用水解直径和酶活力关系测定酶活力。
蛋白酶活力的测定随着生物技术的发展及环保要求的提高，越来越多的酶制剂应用于制革生产中。
比如浸水，脱毛，软化，脱脂等工序都用到大量的酶制剂，从酶的作用性质来看制革生产中用到的主要是蛋白酶和脂肪酶。
测定酶活性浓度的两大类方法
理论上的 V0 在实际工作中是不存在的，必须让酶和底物作用一段时间，消耗掉一 定量的底物，才能测出反应速度，一般说，如消耗底物在 5％内所测到的反应速度都 可认为是初速度，如底物浓度很高时，底物消耗在 20％以内的反应往往还在线性反应 期。
是不是所有类型的酶偶联反应都可用来测酶活性浓度？回答是否定的。因为测酶 的活性浓度是依据测定酶反应速度——△A/△t 或△B/△t 求出。在酶偶联法，此值 无法直接求出，而是通过测定指示酶反应△C/△t 间接求出，要使酶偶联法测得的酶 活性浓度准确可靠，则 Vind＝Vx。换言之，指示酶的最大反应速度必须等于或接近测 定酶的最大反应速度。
只有当反应如曲线 A 时，用“固定时间法”才能测出真实的酶活性，实际工作中 是很少见的，图中曲线 B 代表了最常见的反应情况，在一个很短的线性反应期后在大 部分测定期间内主要为非线性反应期。曲线 C 说明在测定期间包括了延滞期，曲线 D 则不仅包括了延滞期，还包括非线性期，在这些反应中如用固定时间法来测定，结果 是不够准确的，一般是偏低的，而且酶浓度愈高，偏离程度愈大。
从理论上说，用酶偶联反应测酶活性浓度时，最好条件应是测定酶反应为限速反 应。动力学上为零级反应，而指示酶为一级反应，酶反应速度与指示酶底物浓度相关。
（二）指示酶、辅助酶的种类和浓度
指示酶、辅助酶的种类：常规化验中常用的酶偶联法中，多以脱氢酶为指示酶， 在常规化验中的自动分析仪几乎无一例外都有 340nm 波长，通过 NAD(P)H 系统可以很 方便地监测到指示酶反应。但从理论上说，往往可以有不止一种偶联方法，只要设法 使偶联反应中最后一个是指示酶反应，前面已提到测 CK 可以正向逆向二个方向建立 二种不同酶偶联的反应。又如在丙氨酸转氨基酶（ALT）测定法中，正向反应后产生 丙酮酸和谷氨酶，目前最常用的是用乳酸脱氢酶与丙酮酸偶联反应，伴有 NADH 下降。 但也可以用谷氨酸脱氢酶与谷氨酸作用，伴有 NADH 生成。
酶活测定的原理
酶活测定的原理酶活测定是一种用来定量测量酶活性的方法，酶活性是酶催化底物转化为产物的速率。
酶活测定的原理是通过测量底物的消耗或产物的生成来间接测量酶催化反应的速率。
酶活测定的原理可以分为两种方法：连续监测法和间断测定法。
1. 连续监测法：连续监测法是指在反应过程中连续测量底物浓度或产物浓度的变化，从而得到酶活性。
常用的连续监测法有光度法、荧光法、滴定法等。
光度法是通过测量酶催化反应后的混合物的吸光度的变化来确定酶活性。
在光度法中，可以选择适当的底物与酶催化反应形成产物，而该产物通常具有一定的吸光度。
通过不断监测反应体系的吸光度或透过率的变化，可以得到随时间变化的底物或产物浓度，并计算出酶活性。
荧光法和光度法类似，不同之处在于荧光法是通过测量荧光物质的荧光发射或吸收的变化来确定酶活性。
荧光法的优点是具有极高的灵敏度和选择性，适用于对底物和产物浓度要求较低的酶活测定。
滴定法是通过在酶催化反应过程中滴加一定浓度的滴定剂来测定酶活性。
滴定剂一般选择可以与底物或产物发生特定反应的化学物质。
当底物滴定到一定的量时滴定剂会发生颜色变化，从而可以通过滴定液的体积与时间的比值来计算酶活性。
2. 间断测定法：间断测定法是在一定时间内采集样品，在样品采集后通过颜色反应等方法测定底物或产物的浓度。
常用的间断测定法有比色法和电化学法。
比色法是通过底物和产物的颜色反应来测定酶活性。
比色法是酶测定中最常用的一种测定方法。
在比色法中，可以选择适当的底物与酶催化反应形成产物，而该产物通常具有一定的颜色。
在固定时间内，收集反应液并停止酶活，然后通过比色分析仪器来测定产物的吸光度或透过率变化，并通过标准曲线计算酶活性。
电化学法是通过通过电极与反应体系接触的方式来测定底物或产物的浓度。
常用的电化学法有电位法和电流法。
在电位法中，通过测量电极的电位变化来确定酶活性。
在电流法中，通过测量通过电极的电流变化来确定酶活性。
除了以上介绍的方法外，还有许多其他酶活测定方法，如色谱法、质谱法等。
5种酶测定方法
丙二醛含量(MDA)原理丙二醛（MDA）是由于植物官衰老或在逆境条件下受伤害，其组织或器官膜脂质发生过氧化反应而产生的。
它的含量与植物衰老及逆境伤害有密切关系。
测定植物体内丙二醛含量，通常利用硫代巴比妥酸(TBA)在酸性条件下加热与组织中的丙二醛产生显色反应，生成红棕色的三甲川（3、5、5－三甲基恶唑2、4－二酮），三甲川最大的吸收波长在532nm。
但是测定植物组织中MDA时受多种物质的干扰，其中最主要的是可溶性糖，糖与硫代巴比妥酸显色反应产物的最大吸收波长在450nm处，在532nm处也有吸收。
植物遭受干旱、高温、低温等逆境胁迫时可溶性糖增加，因此测定植物组织中丙二醛与硫代巴比妥酸反应产物含量时一定要排除可溶性糖的干扰。
此外在532nm波长处尚有非特异的背景吸收的影响也要加以排除。
低浓度的铁离子能显著增加硫代巴比妥酸与蔗糖或丙二醛显色反应物在532、450nm处的吸光度值，所以在蔗糖、丙二醛与硫代巴比妥酸显色反应中需要有一定的铁离子，通常植物组织中铁离子的含量为100－300μg·g－1Dw，根据植物样品量和提取液的体积，加入Fe3＋的终浓度为0.5nmol·L－1。
在532nm、600nm和450nm波长处测定吸光度值，即可计算出丙二醛含量。
三、材料、仪器设备及试1. 材料：植物叶片。
2. 仪器设备：离心机，分光光度计；电子分析天平；恒温水浴；研钵；试管；移液管（1ml、5ml）、试管架；移液管架；洗耳球；剪刀。
3. 试剂：10％三氯乙酸：50gTCA 用水定容至500ml0.6％硫代巴比妥酸（TBA）溶液：0.6gTBA 溶于100ml水中（加少量1mol/L NaOH溶解）采用赵世杰(1994)方法，略有改动。
称取新鲜材料0.2 g，加入8 ml 10%TCA（三氯乙酸）溶液 (分三次加入，注意冲洗研钵)，在预冷研钵上充分研磨，4000 rpm离心10 min。
取上清液2 ml(对照加2 ml蒸馏水)，加入2 ml 0.6%TBA(硫代巴比妥酸)(用10%的TCA溶液配制)溶液，加塞，摇匀。
酶活性测定方法原理
酶活性测定方法原理
酶活性测定方法是用来测量酶的催化活性的方法，其原理基于酶催化反应速率与酶活性之间的关系。
酶活性是指酶催化单位时间内转化底物的量，通常以单位时间内生成的产物的浓度变化率来表示。
酶活性的测定方法可以分为直接测定和间接测定两种。
直接测定方法包括光度法、荧光法和放射性测定法等。
其中，光度法是最常用的方法之一。
其基本原理是通过测量与酶催化反应相关的光学性质的变化来确定酶的活性。
这些光学性质可以是波长、吸光度、发光强度等。
间接测定方法主要是通过测定酶催化反应过程中与底物转化相关的反应产物的生成量来间接得到酶活性。
常见的方法有pH 法、电位滴定法和色谱法等。
例如，pH法是通过测定与底物转化相关的酶催化反应产生的H+或OH-离子生成量来确定酶的活性。
总的来说，酶活性测定方法的原理是根据酶催化反应速率与酶活性之间的关系，通过测定与底物转化相关的反应产物的生成量或与酶催化反应相关的光学性质的变化来确定酶的活性。
各种酶活性测定方法
各种酶活性测定方法酶活性测定方法是用来测量酶的活性水平和酶催化反应速率的实验方法。
酶活性测定是生物化学研究中的重要内容之一，能够帮助研究人员了解酶的特性和功能，并对酶的应用提供指导。
目前，常用的酶活性测定方法有以下几种。
1.酶动力学实验法酶动力学实验法是通过调整底物浓度、酶浓度和其他反应条件，绘制酶活性与反应速率之间的关系曲线，以了解酶的动力学特性。
常用的酶动力学实验方法包括酶动力学参数的测定、酶标曲线的绘制和酶动力学模型的拟合等。
2.酶活性基质法酶活性基质法是一种通过检测酶对特定底物的催化反应来测定酶活性的方法。
常用的酶活性基质法包括比色法、荧光法、放射性测定法等。
比色法是通过测量产生的产物颜色的变化来间接测定酶活性，如川氏法、本氏法和丙二醛法等；荧光法是通过测量产生的荧光强度的变化来间接测定酶活性，如ATP酶活性测定法；放射性测定法是通过放射性同位素的标记来直接测定酶活性，如液闪测定法。
3.酶活性电位法酶活性电位法是一种通过测量酶催化反应中的电势差变化来测定酶活性的方法。
常见的酶活性电位法有葡萄糖氧化酶活性电位法、酶反应连续监测法等。
葡萄糖氧化酶活性电位法是通过测量葡萄糖氧化酶催化葡萄糖氧化反应产生的电势差变化来间接测定酶活性；酶反应连续监测法是通过测量酶催化反应中产生的电势差变化来直接测定酶活性。
4.酶活性蛋白质法酶活性蛋白质法是一种通过测定酶在反应条件下形成的酶-底物或酶-产物复合物的含量来测定酶活性的方法。
常用的酶活性蛋白质法包括凝胶酶体增活法、凝胶电泳法和酶免疫测定法等。
凝胶酶体增活法是通过测定酶在凝胶中形成的酶-底物或酶-产物复合物的含量来间接测定酶活性；凝胶电泳法是通过测定酶在凝胶中的迁移速度来间接测定酶活性；酶免疫测定法是通过测定酶的特异性免疫反应来直接测定酶活性。
5.酶活性循环法酶活性循环法是一种通过测定酶催化反应中剩余底物或消耗产物的浓度变化来测定酶活性的方法。
常见的酶活性循环法有连续监测法和衍生物测定法等。
自然科学实验中酶的活性测量技巧与方法
自然科学实验中酶的活性测量技巧与方法酶是一类生物催化剂，能够加速化学反应的速率。
在自然科学研究中，测量酶的活性对于了解生物体内的化学过程以及开发新药物具有重要意义。
本文将介绍一些常用的酶活性测量技巧与方法。
一、酶活性的测量原理酶活性通常通过测量酶催化反应产生的产物的生成速率来间接反映。
酶活性的测量原理可以分为两类：连续测量法和间断测量法。
连续测量法是指在酶催化反应过程中，通过连续监测反应物浓度的变化来计算酶活性。
这种方法常用于反应物浓度较高的情况下，如酶催化的酶促反应。
其中，常用的连续测量法包括比色法、荧光法和发光法等。
比色法是通过测量反应物或产物的吸光度来间接测量酶活性。
例如，过氧化氢酶催化过氧化氢分解反应产生的水可以与碘化钾反应生成碘，通过测量碘的吸光度来计算酶活性。
荧光法是通过测量反应物或产物的荧光强度来间接测量酶活性。
例如，琼脂糖酶催化琼脂糖水解反应产生的葡萄糖可以与荧光探针结合，通过测量荧光强度的变化来计算酶活性。
发光法是通过测量反应物或产物的发光强度来间接测量酶活性。
例如，ATP酶催化ATP水解反应产生的ADP可以与荧光素结合，通过测量发光强度的变化来计算酶活性。
间断测量法是指在酶催化反应过程中，通过在一定时间间隔内取样，然后测量样品中反应物或产物的浓度来计算酶活性。
这种方法常用于反应物浓度较低的情况下，如酶催化的酶抑制反应。
其中，常用的间断测量法包括比色法、滴定法和高效液相色谱法等。
二、酶活性测量技巧与方法1. 比色法比色法是一种简单且常用的酶活性测量方法。
它通过测量反应物或产物在特定波长下的吸光度来计算酶活性。
这种方法适用于颜色变化明显的反应体系。
例如，过氧化氢酶催化过氧化氢分解反应产生的水可以与碘化钾反应生成碘，通过测量碘的吸光度来计算酶活性。
2. 荧光法荧光法是一种高灵敏度的酶活性测量方法。
它通过测量反应物或产物在特定波长下的荧光强度来计算酶活性。
这种方法适用于荧光探针与反应物或产物结合的反应体系。
酶检测方法
酶检测方法酶是生物体内一类具有特定功能的蛋白质，它们在生物体内发挥着关键的催化作用。
酶的活性能够反映生物体内代谢的运行状态，因此酶检测在生物学研究、临床诊断和生物工程等领域起着重要的作用。
本文将介绍酶检测的方法，并分析其原理和应用。
一、酶检测的原理每种酶都具有特定的底物，当底物被酶催化后产生一定的产物，可以通过测量产物的数量或者相关反应的速率来间接反映出酶的活性。
酶的检测方法主要有光度法、荧光法、比色法和电化学法等。
光度法是利用酶催化反应后产生的物质溶液的吸收特性来检测酶活性的方法。
首先，选择具有特定光学属性的底物，使酶催化后的产物能够吸收特定波长的光线。
然后，通过测量反应体系中吸光度的变化来确定酶的活性。
举例：以辣根过氧化物酶的检测为例，辣根过氧化物酶能够将辣根过氧化物（HRP）和底物间的过氧化氢催化成高活性的自由基，进而氧化显色底物，形成有色产物。
利用比色法测定产物的吸光度变化，即可定量检测出辣根过氧化物酶的活性。
荧光法是利用酶催化反应产物的荧光特性来检测酶活性的方法。
在酶催化反应中，有些底物和产物具有荧光特性，通过测量产物的荧光强度变化可以确定酶的活性。
举例：以葡萄糖氧化酶的检测为例，葡萄糖氧化酶能够将葡萄糖氧化成葡萄糖酸，产生荧光物质NADH。
通过测量NADH的荧光强度变化，可以判断葡萄糖氧化酶的活性。
比色法是利用酶催化反应后产生的有色产物来检测酶活性的方法。
在酶催化反应中，底物与其他试剂反应产生有色产物，通过测量产物的吸光度变化来确定酶的活性。
举例：以碱性磷酸酶的检测为例，碱性磷酸酶能够将对硝基苯磷酸钠底物催化成黄色产物对硝基苯胺。
通过测量对硝基苯胺的吸光度变化，可以确定碱性磷酸酶的活性。
五、电化学法电化学法是利用酶在电极表面催化产生电流来检测酶活性的方法。
在电极表面固定酶，底物被酶催化后，产生电荷转移，可以通过测量电流变化来确定酶的活性。
举例：以谷胱甘肽还原酶的检测为例，谷胱甘肽还原酶能够将还原型谷胱甘肽（GSH）氧化为氧化型谷胱甘肽（GSSG）。
5种酶测定方法
丙二醛含量（MDA）原理丙二醛（MDA是由于植物官衰老或在逆境条件下受伤害，其组织或器官膜脂质发生过氧化反应而产生的。
它的含量与植物衰老及逆境伤害有密切关系。
测定植物体内丙二醛含量，通常利用硫代巴比妥酸（TBA）在酸性条件下加热与组织中的丙二醛产生显色反应，生成红棕色的三甲川（3、5、5—三甲基恶唑2、4 —二酮），三甲川最大的吸收波长在532nm但是测定植物组织中MDA时受多种物质的干扰，其中最主要的是可溶性糖，糖与硫代巴比妥酸显色反应产物的最大吸收波长在450nm处，在532nm处也有吸收。
植物遭受干旱、高温、低温等逆境胁迫时可溶性糖增加，因此测定植物组织中丙二醛与硫代巴比妥酸反应产物含量时一定要排除可溶性糖的干扰。
此外在532nm波长处尚有非特异的背景吸收的影响也要加以排除。
低浓度的铁离子能显著增加硫代巴比妥酸与蔗糖或丙二醛显色反应物在532、450nm处的吸光度值，所以在蔗糖、丙二醛与硫代巴比妥酸显色反应中需要有一定的铁离子，通常植物组织中铁离子的含量为100 —300卩g • g —1Dw根据植物样品量和提取液的体积，加入Fe3+的终浓度为0.5nmol • L—1。
在532nm 600nm和450nm波长处测定吸光度值，即可计算出丙二醛含量。
三、材料、仪器设备及试1. 材料：植物叶片。
2. 仪器设备：离心机，分光光度计；电子分析天平；恒温水浴；研钵；试管；移液管（1ml、5ml）、试管架；移液管架；洗耳球；剪刀。
3. 试剂：10%三氯乙酸：50gTCA用水定容至500ml0.6 %硫代巴比妥酸（TBA）溶液：0.6gTBA溶于100ml水中（加少量1mol/L NaOH溶解）采用赵世杰（1994）方法，略有改动。
称取新鲜材料0.2 g，加入8 ml 10%TCA（三氯乙酸）溶液（分三次加入，注意冲洗研钵），在预冷研钵上充分研磨，4000 rpm离心10 min。
取上清液2 ml（对照加2 ml蒸馏水），加入2 ml 0.6%TBA硫代巴比妥酸）（用10%勺TCA溶液配制）溶液，加塞，摇匀。
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氮蓝四唑（NBT）法测定超氧物歧化酶（SOD）活力一、原理超氧物歧化酶（superoxidedismutase，SOD）普遍存在于动、植物体内，是一种清除超氧阴离子自由基的酶。
本实验依据超氧物歧化酶抑制氮蓝四唑（NBT）在光下的还原作用来确定酶活性大小。
在有氧化物质存在下，核黄素可被光还原，被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生O2，可将氮蓝四唑还原为蓝色的甲腙，后者在560nm处有最大吸收。
而SOD可清除O2，从而抑制了甲腙的形成。
于是光还原反应后，反应液蓝色愈深，说明酶活性愈低，反之酶活性愈高。
据此可以计算出酶活性大小。
二、材料、仪器设备及试剂（一）材料；水稻或小麦叶片（二）仪器设备：1.高速台式离心机；2.分光光度计；3.微量进样器；4.荧光灯（反应试管处照度为4000Lx）；5.试管或指形管数支。
（三）试剂 :1. 0.05mol/L 磷酸缓冲液（pH7.8）；2. 130mmol/L 甲硫氨酸（Met）溶液：称1.9399gMet用磷酸缓冲液定容至100ml(现用现配)；3.750μmol/L 氮蓝四唑溶液：称取0.06133gNBT用磷酸缓冲液定容至100ml，(避光保存)；4. 100μmol/L EDTA－Na2溶液：称取0.03721gEDTA－Na2用磷酸缓冲液定容至1000ml；5. 20μmol/L 核黄素溶液：称取0.0753g核黄素用蒸馏水定容至1000ml(避光保存)。
三、实验步骤1. 酶液提取取一定部位的植物叶片（视需要定，去叶脉）0.5g于预冷的研钵中，1ml预冷的磷酸缓冲液在冰浴上研磨成浆，加缓冲液使终体积为5ml。
取1.5～2ml于1000rpm下离心20min，上清液即为SOD粗提液。
2. 显色反应取5ml指形管（要求透明度好）4支，2支为测定管，另2支为对照管，按下列加入各溶液：试剂（酶）用量（ml）终浓度（比色时）0.05mol/L 磷酸缓冲液 1.5130mmol/L Met溶液0.313mmol/L 750μmol/L NBT溶液0.375μmol/L 100μmol/L EDTA－Na2液0.310μmol/L 20μmol/L 核黄素0.320μmol/L 酶液0.052支对照管以缓冲液代替酶液蒸馏水0.25总体积3.0混匀后将1支对照管置暗处，其它各管于4000Lx日光下反应20min（要求各管受光情况一致，温度高时间缩短，低时延长）。
3. SOD活性测定与计算至反应结束后，以不照光的对照管做空白，分别测定其它各管的吸光度。
四、结果计算已知SOD活性单位以抑制NBT光化还原的50％为一个酶活性单位表示，按下式计算SOD活性。
SOD总活性＝(Ack－AE)×V/(Ack×0.5×W×Vt) 上式中，SOD比活力＝SOD总活性蛋白质含量式中SOD总活性以每克鲜重酶单位表示；比活力单位以酶单位／mg蛋白表示Ack照光对照管的吸光度AE样品管的吸光度V样品液总体积（ml）Vt测定时样品用量（ml）W样鲜重（g）蛋白质含量单位为：mg蛋白／g鲜重。
超氧化物歧化酶(SOD)活性的测定【实验原理】SOD是含金属辅基的酶，它催化以下反应：02-+02-+ 2H+ H202+02由于超氧阴离子自由基02-寿命短，不稳定，不易直接测定SOD活性,而采用间接的方法。
目前常用的方法有3种, 包括氮蓝四唑(NBT)光化还原法，邻苯三酚自氧化法，化学发光法。
本实验主要介绍光化还原法，其原理是：氮蓝四唑在蛋氨酸和核黄素存在条件下，照光后发生光化还原反应而生成蓝色甲腙，蓝色甲腙在560nm处有最大光吸收. 。
SOD 能抑制NBT的光化还原，其抑制强度与酶活性在一定范围内成正比。
试剂:1.50m mol/l pH7.8的磷酸缓冲液(PBS) ,含0.1m mol/l EDTA2.220m mol/l甲硫氨酸：称3.2824g甲硫氨酸\,用50m mol/l pH7.8的磷酸缓冲液定溶至100ml （现配现用）。
3.1.25m mol/l氯化硝基四氮唑蓝（NBT）溶液（现配）：称NBT 0.102g,用 50m mol/l pH7.8的磷酸缓冲液(PBS)溶解定容至100ml.4.0.033m mol/l核黄素：称2.52mg 用PBS溶解定容至200ml（遮光保存）。
【实验步骤】1．酶液制备称取植物组织0.5g先加入2.5ml PBS，研磨匀浆后，再加入2.5ml PBS混匀， 4℃下 10000r/min 离心15min 上清液即为粗酶液。
取部分上清液经适当稀释后用于酶活性测定。
2.酶活性测定取10ml小烧杯7只, 3只测定样品,4只作为对照，按下表加入试计: 试剂用量(ml ) 终浓度(比色时) 50m mol/l (PBS) 220m mol/l Met 1.25m mol/l NBT 0.033m mol/l核黄素酶液总体积 4.05、 0.3 、0.3、 0.3 、0.05 、5.0 、13m mol/l 、75µ mol/l 、2.0µ mol/l ，对照以缓冲液代替酶液，将上述试剂混匀后，1只对照烧杯至于暗处，另3只对照烧杯和样品一起置于 4000lx日光灯下反应20min（要求各管受光一致，温度高时时间缩短，温度低时可适当延长）。
最后在560nm处测定反应液的光密度。
以不照光的对照烧杯作参比，分别测定其他各管的光密度。
3.蛋白含量的测定步骤1的上清液经适当稀释后用考马斯亮蓝 G-250法测定蛋白含量.【实验结果及计算】SOD活性单位是以抑制NBT光化还原的50%为一个酶活性单位表示。
可按下式计算SOD活性： SOD总活性=SOD比活力=SOD总活性/蛋白质总浓度式中: SOD总活性以 U/gFW,比活力单位以 U/mg蛋白表示 ACK为对照杯(光照)的光吸收值;AE 为样品的光吸收值;V为样液总体积,V1为测定时样品用量,W为样重g.过氧化物酶（POD）活性测定【实验原理】过氧化物酶广泛分布于植物的各个组织器官中，在有H202存在条件下，过氧化物酶能使愈创木酚氧化，生成茶褐色的4-邻甲氧基苯酚，可用分光光度计测生成物的含量来测定活性。
【实验试剂】愈创木酚、30%过氧化氢、20mmol/LKH2PO4、100mmol/L磷酸缓冲液（pH6.0）、反应混合液[100mmol/L磷酸缓冲液（Ph6.0）50mL，加入愈创木酚28uL,加热搅拌，直至愈创木酚溶解，待溶液溶解冷却后，加入30%过氧化氢19uL，混合均匀保存在冰箱中]【方法步骤】（1）、粗酶液的提取称取小麦叶片0.25g，加20mmol/LKH2PO4 2.5mL，于研钵中研成匀浆，以4000r/min离心10分钟，收集上清液保存在冷处，所得残渣再用20mmol/LKH2PO4 2.5mL提取一次，全并两次上清液，所得的即为粗酶提取液(酶活性过高，稀释10倍)。
（2）、酶活性的测定取试管3只，于一只中加入反应混合液3mL，KH2PO41mL，作为校零对照，另外三只中加入反应混合液3mL，稀释后的酶液1mL （如表1），立即开启秒表，于分光光度计470nm波长下测量OD值，每隔1min 读数一次（4min）。
以每分钟表示酶活性大小，将每分钟OD值增加0.01定义为一个活力单位。
4.结果计算以每分钟吸光度变化值表示酶活性大小，即以ΔA 470 /[min ·g （鲜重）]表示之。
也可以用每min 内 A 470 变化0.01 为 1 个过氧化物酶活性单位（u ）表示。
POD总活性[u/g(FW)]= ∆A 470×Vt/0.01×V1×t×FW式中：POD总活性以酶单位每克鲜重表示。
其中△470=ACK-AE 比活力单位以酶单位每毫克蛋白表示。
ACK ——照光对照管的吸光度。
AE ——样品管的吸光度。
Vt ——样品液总体积，mL。
V1 ——测定时样品用量，mL。
W——样品鲜重，g。
蛋白质含量单位为mg/g。
过氧化氢酶（CAT）活性的测定：紫外吸收法一、目的与要求过氧化氢酶普遍存在于植物的所有组织中，其活性与植物的代谢强度及抗寒、抗病能力有一定关系，故常加以测定。
二、原理过氧化氢酶（catalase）属于血红蛋白酶，含有铁，它能催化过氧化氢分解为水和分子氧，在此过程中起传递电子的作用，过氧化氢则既是氧化剂又是还原剂。
可根据H2O2的消耗量或O2的生成量测定该酶活力大小。
过氧化氢在240nm波长下有强烈吸收，过氧化氢酶能分解过氧化氢，使反应溶液的吸光度（A240）随反应时间而降低。
根据测量吸光率的变化速度即可测出过氧化氢酶的活性。
三、材料、仪器设备及试剂（一）材料：小麦或其它叶片（二）仪器设备：1. 研钵；2.紫外分光光度计；3. 离心机；4. 恒温水浴；5. 容量瓶。
（三）试剂：1.0.2mol/LpH7.8磷酸缓冲液（pH7.8: 0.2mol/L Na2HP04 91.5 ml; 0.2mol/L NaH2P04 8.5 m l）；2．0.1 mol/LH2O2 (30%的H2O2溶液5.68ml稀释至1000ml)二、实验步骤：1、酶液提取称取新鲜植物叶片或其它组织0.5g，置于研钵中，加入2～3ml 4℃下预冷的pH7.0磷酸缓冲液和少量石英砂研磨匀浆后，转入25ml 容量瓶中，并用缓冲液冲研钵数次，合并冲洗液，并定容到刻度。
混合均匀，将容量瓶置5℃冰箱中静置10min，取上清液在4000r/min下离心15min，上清液即为过氧化氢粗提液，5℃下保存备用。
2、测定10ml试管3支，其中2支为样品测定管，1支为空白管，按表1-1顺序加入试剂。
25℃预热后，逐管加入0.6ml0.1mol/l的H2O2,每加完1管立即记时，并迅速倒入石英比色杯中，260nm下测定吸光度，每隔1min读数1次，共测4min，待3支管全部测完后，按式（1-1）计算酶活性。
过氧化氢酶活性（μ.g-1min-1）=ΔA240*Vt/(0.1*Vl*t*FW) （1-1）式中ΔA240 ：As0-(As1+As2)/2;As0：加入失活酶液的对照管吸光值；As1，As2 ：样品管吸光值；Vt：粗酶提取液总体积（ml）；Vl：测定用粗酶提取液体积（ml）；FW：样品鲜重（g）；0.1：A240每下降0.1为1个酶活单位（μ）；t：过氧化氢到最后一次读数时间（min）。