测量酶方法

氮蓝四唑（NBT）法测定超氧物歧化酶（SOD）活力

一、原理

超氧物歧化酶（superoxidedismutase，SOD）普遍存在于动、植物体内，是一种清除超氧阴离子自由基的酶。本实验依据超氧物歧化酶抑制氮蓝四唑（NBT）在光下的还原作用来确定酶活性大小。在有氧化物质存在下，核黄素可被光还原，被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生O2，可将氮蓝四唑还原为蓝色的甲腙，后者在560nm处有最大吸收。而SOD可清除O2，从而抑制了甲腙的形成。于是光还原反应后，反应液蓝色愈深，说明酶活性愈低，反之酶活性愈高。据此可以计算出酶活性大小。

二、材料、仪器设备及试剂

（一）材料；水稻或小麦叶片

（二）仪器设备：1.高速台式离心机；2.分光光度计；3.微量进样器；4.荧光灯（反应试管处照度为4000Lx）；5.试管或指形管数支。

（三）试剂 :1. 0.05mol/L 磷酸缓冲液（pH7.8）；

2. 130mmol/L 甲硫氨酸（Met）溶液：称1.9399gMet用磷酸缓冲液定容至

100ml(现用现配)；

3.750μmol/L 氮蓝四唑溶液：称取0.06133gNBT用磷酸缓冲液定容至100ml，

(避光保存)；

4. 100μmol/L EDTA－Na2溶液：称取0.03721gEDTA－Na2用磷酸缓冲液定容至

1000ml；

5. 20μmol/L 核黄素溶液：称取0.0753g核黄素用蒸馏水定容至1000ml(避光保

存)。

三、实验步骤

1. 酶液提取

取一定部位的植物叶片（视需要定，去叶脉）0.5g于预冷的研钵中，1ml预冷的磷酸缓冲液在冰浴上研磨成浆，加缓冲液使终体积为5ml。取1.5～2ml于1000rpm下离心20min，上清液即为SOD粗提液。

2. 显色反应

取5ml指形管（要求透明度好）4支，2支为测定管，另2支为对照管，按下列加入各溶液：试剂（酶）用量（ml）终浓度（比色时）0.05mol/L 磷酸缓冲液 1.5130mmol/L Met溶液0.313mmol/L 750μmol/L NBT溶液0.375μmol/L 100μmol/L EDTA－Na2液0.310μmol/L 20μmol/L 核黄素0.320μmol/L 酶液0.052支对照管以缓冲液代替酶液蒸馏水0.25总体积3.0混匀后将1支对照管置暗处，其它各管于4000Lx日光下反应20min（要求各管受光情况一致，温度高时间缩短，低时延长）。

3. SOD活性测定与计算

至反应结束后，以不照光的对照管做空白，分别测定其它各管的吸光度。

四、结果计算

已知SOD活性单位以抑制NBT光化还原的50％为一个酶活性单位表示，按下式计算SOD活性。SOD总活性＝(Ack－AE)×V/(Ack×0.5×W×Vt) 上式中，SOD比活力＝SOD总活性蛋白质含量式中SOD总活性以每克鲜重酶单位表示；比活力单位以酶单位／mg蛋白表示Ack照光对照管的吸光度AE样品管的吸光度V样品液总体积（ml）Vt测定时样品用量（ml）W样鲜重（g）蛋白质含量单位为：mg蛋白／g鲜重。

超氧化物歧化酶(SOD)活性的测定

【实验原理】

SOD是含金属辅基的酶，它催化以下反应：

02-+02-+ 2H+ H202+02

由于超氧阴离子自由基02-寿命短，不稳定，不易直接测定SOD活性,而采用

间接的方法。目前常用的方法有3种, 包括氮蓝四唑(NBT)光化还原法，邻苯三酚自氧化法，化学发光法。本实验主要介绍光化还原法，其原理是：氮蓝四唑在蛋氨酸和核黄素存在条件下，照光后发生光化还原反应而生成蓝色甲腙，蓝色甲腙在560nm处有最大光吸收. 。SOD 能抑制NBT的光化还原，其抑制强度与酶活性在一定范围内成正比。

试剂:

1.50m mol/l pH7.8的磷酸缓冲液(PBS) ,含0.1m mol/l EDTA

2.220m mol/l甲硫氨酸：称

3.2824g甲硫氨酸\,用50m mol/l pH7.8的磷酸缓冲液定溶至100ml （现配现用）。

3.1.25m mol/l氯化硝基四氮唑蓝（NBT）溶液（现配）：称NBT 0.102g,用 50m mol/l pH7.8的磷酸缓冲液(PBS)溶解定容至100ml.

4.0.033m mol/l核黄素：称2.52mg 用PBS溶解定容至200ml（遮光保存）。

【实验步骤】

1．酶液制备

称取植物组织0.5g先加入2.5ml PBS，研磨匀浆后，再加入2.5ml PBS混匀， 4℃下 10000r/min 离心15min 上清液即为粗酶液。取部分上清液经适当稀释后用于酶活性测定。

2.酶活性测定

取10ml小烧杯7只, 3只测定样品,4只作为对照，按下表加入试计: 试剂

用量(ml ) 终浓度(比色时) 50m mol/l (PBS) 220m mol/l Met 1.25m mol/l NBT 0.033m mol/l核黄素酶液总体积 4.05、 0.3 、0.3、 0.3 、0.05 、5.0 、

13m mol/l 、75µ mol/l 、2.0µ mol/l ，对照以缓冲液代替酶液，将上述试剂混匀后，1只对照烧杯至于暗处，另3只对照烧杯和样品一起置于 4000lx日光灯下反应20min（要求各管受光一致，温度高时时间缩短，温度低时可适当延长）。最后在560nm处测定反应液的光密度。以不照光的对照烧杯作参比，分别测定其他各管的光密度。

3.蛋白含量的测定

步骤1的上清液经适当稀释后用考马斯亮蓝 G-250法测定蛋白含量.

【实验结果及计算】

SOD活性单位是以抑制NBT光化还原的50%为一个酶活性单位表示。可按下式计算SOD活性： SOD总活性=

SOD比活力=SOD总活性/蛋白质总浓度

式中: SOD总活性以 U/gFW,比活力单位以 U/mg蛋白表示 ACK为对照杯(光照)的光吸收值;AE 为样品的光吸收值;V为样液总体积,V1为测定时样品用量,W为样重g.