DNA结构分析

基因结构分析

摘要：本文综述了基因的研究背景，并且用X射线衍射技术观察了DNA的双螺旋结构，原子力显微镜观察了pBR322DNA的拓扑结构，电子显微镜观察DNA，扫描隧道显微镜观察了DNA的变异结构，以及用透射电镜观察DNA的转录。

关键词：DNA X射线衍射原子力显微镜电子显微镜

1 研究背景

1869 年瑞士化学家米歇尔（Friedrich Miescher）在细胞核中发现了一种含有磷酸的奇特的物质，他把这种物质称为“核质”（nuclein），后来改名为核酸（nucleic acid）。1880年德国生化学家科塞尔（Albrecht Kossel）开始了对核酸的生化分析，到19 世纪末叶已从DNA中分离出4 种碱基，它们是腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶。1927年李（）从DNA中分离出脱氧核糖。到20世纪30年代已经确定了DNA的化学组成，它由4个称为核苷酸的基本单位组成，每种核苷酸又是由3 种基本的亚单位，1个碱基，1个脱氧戊糖和1个磷酸基团组成[1]。

1950 年查伽夫（Erwin Chargaff ）发现DNA中嘌呤类两个碱基之比例和嘧啶类两个碱基之比例随生物种类不同而大有不同. 他又发现嘌呤类之总量和嘧啶类之总量相等，其中腺嘌呤之量等于胸腺嘧啶之量，鸟嘌呤之量等于胞嘧啶之量[1]。

1952 年赫尔希（. Hershey ）和蔡斯（Martha Chase）利用放射性示踪物质对噬菌体侵染过程中分子事件的确切研究，表明了只有DNA（而没有蛋白质）参与了噬菌体颗粒复制的生化过程，说明DNA是遗传物质[2]。

DNA 分子是由许多核苷酸分子连接而成的长链分子，在DNA 中核苷酸是通过磷酸基团连接起来的（如图1所示）。每一个核苷酸的脱氧核糖与另一个核苷酸的磷酸基连接在一起，形成糖-磷酸基骨架，构成了DNA 的主链，这条主链决定了DNA分子的长度。

虽然糖-磷酸基主链是很有规则的，其结构单元是彼此相同的，但它不是作

为一个整体的分子，而只是DNA分子的一部分，因为每个糖有个附着在它上面的碱基，而这个碱基并不总是相同的，沿着这条链它们彼此遵循的顺序是有规律的。对各种DNA的化学结构而言，相互间的差别主要体现在所含碱基的组成、数量及排列顺序上。

虽然我们从DNA 的化学结构式知道它是一条链，但它自身并未告诉我们这个分子的形状，它的分子排列图形仍然不明。要进一步了解DNA的三维空间结构，有待于用各种方法进行分析研究。

2 基因提取方法

基因有多种提取方法，真核生物、原核生物中的DNA和病毒质粒等的提取方法各不相同。现在介绍一种实验室常用的普遍的实验方法，步骤如下：

1、贴壁细胞用胰酶消化,离心收集。

2、细胞重悬于冰冷的PBS漂洗一次,离心收集。

3、重复2。

4、加入5ml DNA提取缓冲液,(10mmol/L Tris-Cl, mol/L EDTA, % SDS),混匀。

5、入25ul蛋白酶K,使终浓度达到100ug/ml, 混匀,50℃水浴3h。

6、用等体积的酚抽提一次,2500r/min 离心收集水相,用等体积的（酚,氯仿,异

戊醇）混合物抽提一次,2500r/min 离心收集水相。用等体积的氯仿,异戊醇抽提一次。

7、加入等体积的5mol/L 的LiCl,混匀,冰浴,10min。

8、2500r/min,离心10min，转上清于一离心管中，加入等体积的异丙醇，室温10分钟。

9、2500r/min,离心10min，弃上清。加入倍体积3mol/L乙酸钠与2倍体积-20℃预冷无水乙醇，-20℃20分钟。

10、12000r/min, 室温离心5分钟，弃上清，将DNA溶于适量TE中。

3 研究方法

X射线衍射确定基因的双螺旋结构[3]

威尔金斯使用的样品是纤维状的DNA结晶体，并使其保持在潮湿状态。实验中DNA纤维和照相底片都放置在垂直于X 射线束的方向上（图2）。当单色X射线束垂直通过DNA纤维时，就像通过一个光栅一样，在照相底片上就会呈现明暗相间的X射线衍射图样。在衍射图上的纵轴和横轴分别以子午线和赤道线相称。

图2 X射线照相设置示意图图3 B型结构的X射线衍射图衍射图是B型结构的DNA的X射线衍射图（图3）。他指出：X射线衍射图照片是由两个区域组成的。一个是由沿着这条链的碱基的有规则的空间排列决定的；另一个是由这条长链的空间构型决定的。他说：“阿斯特伯里建议的这个强烈的

0 .34 nm 反射对应于沿着这条纤维轴中间的核苷酸的重复。然而这个约为3 .4 nm

的层线并不是多核苷酸组成的重复，而是由于链条构型的重复。当核苷酸具有比较高的密度的时候就引起了强烈的衍射。在子午线上及附近反射的减少立即可以得出具有平行于纤维轴的螺旋结构”。

这一段话说明了螺旋结构与衍射图间的相互关系，可作如下具体解释。如图4所示，设核苷酸（或碱基对）之间的间距为h，则h=0 .34 nm，在衍射空间（即倒易空间）中对应线段的长度h﹡= 1/h=1/0 .34 ，对应于衍射图上第10层线的衍射强度。设螺旋的螺距为p，则p= 3 .4 nm，在衍射空间（即倒易空间）中对应线段的长度p﹡= 1/p= 1/3 .4 ，对应于衍射图上第1层线的衍射强度。

图4 螺旋结构与衍射图间的相互关系示意图图5 A型DNA的X射线衍射图威尔金斯小组拍制了A型DNA的X射线衍射图。图5给出结晶的DNA在X射线衍射的倒易空间中衍射强度的二维图。图中黑色矩形的高度正比于结构因子，其面积正比于总强度。这条连续曲线与螺旋结构的结构因子相对应。

威尔金斯用大量的实验数据证实了沃森和克里克提出的DNA的双螺旋结构模型，并用具体的实验数据表示之。他得出结论说：“整条磷酸基-糖链大约处在距离螺旋轴0 .9 nm处，形成两条间距为1 .4 nm、直径为1 .8 nm的螺旋。一系列碱基对与螺旋轴大约成65度的倾角，在两个直径为1 .8 nm的螺旋之间，形成直径为1 .0 nm 的单股螺旋（图6）。这个模型作为一个整体与从X射线衍射数据推