乳酸菌的提取和鉴定

酸奶中乳酸菌的筛选试验

一、实验目的：熟悉从酸奶中分离和纯化乳酸菌的一般方法

二、实验原理：

市场销售的酸奶主要含乳酸菌，乳酸菌的主要作用是把牛奶中乳糖发酵成乳酸，此外酸奶中还含有其他球菌，利用它产酸等性质可以分离乳酸菌，分离培养基一般添加蛋白胨、酵母膏提供氮源、维生素、生长因子；葡萄糖为可发酵糖类；磷酸氢二钾为酸碱缓冲剂；柠檬酸铵、硫酸镁、硫酸锰、亚硫酸铁、吐温-80和乙酸钠为培养各种乳酸菌提供生长因子，其成分还能抑制某些杂菌；琼脂是培养基的凝固剂。、也常常加入醋酸盐，因醋酸盐能抑制部分细菌生长，对乳酸菌无害。培养基中添加碳酸钙，乳酸溶解培养基中的碳酸钙形成透明圈，作为分离鉴别的依据。

.筛选方法：.溶钙圈法：利用一些产酸类细菌在含CaCO3 的培养基上产生CaCO3 溶解圈，从而筛选出这些产酸类细菌，可用于乳酸菌的筛选。其中培养基中加入CaCO3 的作用是：①鉴别能产生酸的细菌；②中和产生的酸，以维持培养基的PH、更利于乳酸菌的生长和分离

三、实验药品及仪器

牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、葡萄糖、乳糖、吐温-80、柠檬酸二铵、CaCO3 、K2HPO4 NaAc·3H2O、MgSO4·7H2O、MnSO4·H2O、琼脂、结晶紫染色液、碘液、95%乙醇、石蜡、蒸馏水。

仪器：超净工作台、电子显微镜、接种环、恒温培养箱、接

种环、培养皿、涂布环、高压锅、试管、微波炉、电子天平、离心机

四培养基类型

①改良MRS 培养基（乳酸菌分离培养基）：牛肉膏10g，蛋白胨10g，酵母膏5g，葡萄糖20g，吐温-80 1.0ml（它是一种很好的乳化剂和分散剂也就是说它的作用就是是培养基的营养成分更加的均匀就是对营养成分的再一次优化），K 2HPO4 2g，NaAc·3H2O 5g，柠檬酸二铵2g，MgSO4·7H2O 0.58g，MnSO4·H2O 0.25g，补蒸馏水至1000ml（固体培养基中加琼脂 1.5%-2%），调pH 至6.4±0.2，121℃高压灭菌15min

②改良MC 培养基（乳酸菌选择培养基）：牛肉膏5g，蛋白胨5g，酵母膏5g，葡萄糖20g，乳糖20g，CaCO3 10g，琼脂20g，中性红0.05g（指示剂），最终pH6.5±0.2，补蒸馏水至1000ml，121℃高压灭菌15min。

配制方法：1把除CaCO3以外的成分称量溶解后.调PH至6.2～6.4；

2.称取20g CaCO3加入到100mL蒸馏水中，制成CaCO3乳浊液；

3.将培养基和CaCO3乳浊液分开灭菌；

4.倒平板前，待培养基融化冷却后，平板上加入一定量的CaCO3乳浊液，晾干了以后再接种。

五、实验流程

1、吸取酸奶1ml

2、10 倍梯度稀释平板涂布（改良MC Medium）

3、厌氧培养（28℃培养48h）待形成菌落

4、挑取溶钙圈较大的单菌落→ 观察、记录菌落形态与特征

5、Improved MC Medium 划线分离纯化

6、选取溶钙圈较大的单菌落进行G+染色

7、革兰氏阳性菌（G+菌）→ 记录菌株细胞形态

9、MRS 液体培养（37℃培养48h

具体步骤：

（1）按要求做好培养基

（1）无菌操作将经过充分摇匀的检样20mL，放入含有180mL 灭菌生理盐水的灭菌三角瓶内，振摇均匀，即为1：10稀

释液，依次做1：100、1：1000……稀释。10倍梯度稀释

至10-6浓度

（2）取每个稀释度的溶液2 mL分别倾倒在准备好的改良MC 培养基上，每个稀释度两个平板，用涂步环涂布，用石蜡油密

封培养基厌氧培养，42℃培养48h

（3）待形成菌落后，选取表面湿润、形态饱满、溶钙圈较明显较大的单菌落(图2-12)在改良MC培养基上进行划线纯化（4）划线纯化后挑取溶钙圈较大、形态饱满表面湿润的单菌落进行接种试管斜面6个，试管口用石蜡封口，37℃厌氧培养18

小时。

（5）从试管上取单菌落进行革兰氏染色，确定是否为G+ 涂片

固定

染色：初染（结晶紫染色液染色2-3分钟，用蒸馏水冲洗）——媒染（碘液1-2分钟水洗）——脱色（用95%乙醇冲洗

玻片2-3次，然后用蒸馏水冲洗）_复染(番红,后水洗) 镜检：在显微镜下画出菌体形态特征，确定是否为纯菌株（6）把试管里的菌体用接种环转移到已配置好的改良MRS液体培养基上，三角瓶要用石蜡密封，37℃培养恒温培养48小时。

（7）取菌株培养液用离心机离心分离，3500r/min,15min,收集菌体

六、注意事项：

1菌体的厌氧培养

2菌分离筛选的传统步骤是先用改良MC Medium 进行鉴别分离，再以MRS 培养基培养

六、实验结果:

绘制乳酸菌在电镜下的图片，记录乳酸菌单菌落形态特征。