外周血染色体标本制作

2低渗溶液
2.2主要的低渗液 • 低渗溶液是指渗透压和离子强度均低的溶液。可以是水、 低渗的柠檬酸钠或氯化钠、甘油磷酸钾(0.65mol／L)、氯 化钾(0.075mol／L)、稀释的平衡盐溶液或培养基。处理 时间一般为8—40分钟，处理时的温度为23—37℃。 • 在早期的一些研究中，大多用柠檬酸钠或柠檬酸钾作为低 渗液。也有些学者主张用稀释的人血清，认为这样可使染 色体的形态特征更为清晰。自1965年后，人们改用KCl为 低渗掖。其优点是染色体的轮廓清楚，可染色性增强，染 色时间短。在相差显微镜下观察．KCl低渗处理标本的效 果比其它低渗液更好些，也适合于显微分光光度分析，当 用显带染色时能充分显示带型的特点。KCl的浓度以 0.075mol／L为宜，但不同组织所需的处理时间未必相同。
1 纺锤体抑制剂
1.2主要的纺锤体抑制剂及其作用特点 • 秋水仙素 • 秋水仙素（colchicine）是一种生物碱，因最初从百合科植 物秋水仙（Colchicum autumnale）中提取出来，故名。 分子式C22H25O6N。纯秋水仙素呈黄色针状结晶，熔点 157℃。易溶于水、乙醇和氯仿，难溶于热水、乙醚等。 味苦，有毒。秋水仙素能抑制有丝分裂，破坏纺锤体，使 染色体停滞在分裂中期。这种由秋水仙素引起的不正常分 裂，称为秋水仙素有丝分裂（C-mitosis）。在这样的有丝 分裂中，染色体虽然纵裂，但细胞不分裂，不能形成两个 子细胞，因而使染色体加倍。
2低渗溶液
2.4影响低渗效果的因素 影响低渗处理的效果是以下三个因素：低渗溶液的 化学组成、低渗的强度和处理的时间。处理时间太短则染 色体铺展不好，处理时间过长会引起细胞破裂甚至由于染 色体胀得太大而致形态结构模糊。因此，在实际操作中， 对某一种组织究竟应选用哪一种低渗溶液，需事先进行预 试验。
3 固定
1 纺锤体抑制剂
• 与其它预处理化学物相比较秋水仙素的另一个优点是，在
广泛的温度范围内都是有活性的。在热带地区的夏季，那 怕气温高达43.3℃，对秋水仙素的活性也无显著影响，有 人将秋水仙素加入保存在8—9℃的组织中，发现中期细胞 的数目比保存在室温但未加秋水仙素的组织要多得多，而 且染色体的结构也很清楚。 乙酰甲基秋水仙碱是人工合成的秋水仙素的衍生物。它的 功能跟秋水仙素一样但对细胞的毒害作用只有秋水仙素的 1／30一1／40。4—6×10-6的浓度即可得到所希望的效 应。 除了秋水仙素以外，另一些化学物也可作为纺锤体抑制剂。 如三氯乙醛水合物、六六六、硫酸长春花碱等，它们在人 体细胞均可产生良好效果。
3 固定
• 最后，理想的固定剂还应能有助于达到优良的染色效果，
即能增强染色体的嗜碱性。例如，甲醛虽具有优良固定剂 的其它所有特性，但却会降低染色体的嗜碱性，所以不能 单独用作染色体的固定剂。 显而易见，没有哪一种化学物能同时具备以上这些条件， 因而通常是将数种可以共存的液体混合起来，使之成为染 色体研究中真正有效的固定剂。尽管如此，那怕是最佳固 定剂仍难免有不足之处。首先，细胞被杀死后发生的基本 变化很难予以避免；其次，可能会抽提出一些弥散成分； 最后即使操作十分谨慎，仍难以保持酶活性不变；此外， 某些化学物还会导致细胞的皱缩。
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
1 纺锤体抑制剂
秋水仙素的作用与其浓度和作用时间相关，在高浓度 时可以延缓着丝点分裂，低浓度时则抑制细胞纺锤体的形 成。 在秋水仙素作用下，染色单体缩短，着色变深以致 外形清晰。但不同染色体缩短的程度不一，长的染色体比 短的染色体浓缩得更明显些。从能收集到足够的中期细胞 考虑，秋水仙素处理的时间宜长些，所用的浓度宜高些； 但从能得到较为细长的染色体考虑，处理的时间宜短，所 用的浓度宜低。因而秋水仙素处理的方法应同时兼顾这二 个方面。如果处理的时间太短则标本中的分裂细胞就少； 与此相反，如果处理的时间太长分裂细胞虽多，但染色体 缩得太短，以致形态模糊，就难以获得优良的显带标本。
外周血染色体标本制作
一、染色体标本制备原理
在细胞遗传学研究中，为了使细胞质透明，离解胞 间层，使组织软化，且使染色体彼此铺展开而又能清楚地 显示缢痕，往往需要对正在分裂或已经收获的细胞作一系 列预处理。有时，在对细胞进行固定的时候，为了使固定 剂迅速渗透到组织中，以便于研究染色体的特殊结构，也 需要作预处理；其目的是使细胞的核外条件及染色体本身 的状态更适于分析和研究的需要。在细胞培养（培养基中 加有PHA）后72小时，合成DNA的细胞占总数的45％，有 丝分裂的速率相当于每小时1%，被激活的淋巴细胞占总 数的90%，是收获分裂期细胞、制备染色体标本的最佳时 期。从收获到制片需经过加纺锤体抑制剂、低渗处理、固 定、滴片等几个主要环节，现将各步骤的原理、所用试剂 及相关注意事项详述如下。
1 纺锤体抑制剂
1.1基本原理和机制 • 使染色体散开并清楚地呈现次缢痕，凭借的原理是改变细 胞质的粘度。因为在细胞分裂时，随着纺锤体的形成，染 色体紧靠在一起，很难进行分析。纺锤体的形成取决于细 胞质和纺锤体成分的粘度之间的平衡。因此，改变细胞质 的粘度就能破坏纺锤体，使染色体依然呈游离状态，或者 更确切地说，染色体不再粘附至细胞内的任何结合力上。 所以在随后制作标本时一旦受到压力，染色体就很易铺展 开来。同时，由于染色体的不同区段上水合作用的能力不 一，当细胞质的粘度发生变化时，就会使缢痕区显示得更 为清楚。
1 纺锤体抑制剂
细胞分裂中纺锤体是由微管组成的。微管管壁由13 条原丝纵向平行排列构成，主要成分为微管蛋白，而微管 蛋白分α微管蛋白和β微管蛋白两种。α微管蛋白和β微管蛋 白组成的异二聚体构成微管亚单位，若干个异二聚体相接 连成原丝。α微管蛋白与β微管蛋白在化学结构上极为相似， 两者42%序列相同。其中β微管蛋白肽链中第201位为半胱 氨酸，为秋水仙素结合部位。如果结合的部位被其结合， 微管不仅不能继续聚合，而且会引起原有微管解聚。
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3 固定
细胞的膨胀和染色体的皱缩是决定固定剂质量的两 个重要因素。以往曾认为渗透压是促使细胞内结构膨胀或 破坏的决定性因索，为此选用等渗液作为固定剂，其实这 种看法是不正确的。事实证明，稀释的醋酸具有20个大气 压，照常可使细胞和组织膨胀，而只有2.5个大气压的苦 味酸却可使组织大大地收缩。这提示一种固定剂的效果如 何与渗透压的关系很小。另一方面，苦味酸使蛋白质沉淀 的作用很强而醋酸却没有这一作用。可见，使蛋白质沉淀 这一特性在导致染色体收缩方面可能起重要作用。因此， 在选用哪些化学物作为固定剂时，需要权衡以上这些因素。
固定是组织、细胞或其成分选择性地固定于某一特 定阶段的过程。其目的是杀死细胞但又要避免所研究的成 分受到破坏。 不同物种对固定剂的反应是不一的，哺乳类动物染 色体的固定尤其需要特定的方法，这是因为每种生物的细 胞质成分彼此各异的缘故。生物类型本身的复杂性及多细 胞生物中细胞内的变化较大，以致很难在细胞水平上分析 固定的效应。
1 纺锤体抑制剂
故秋水仙素具有干扰微管装配，破坏纺锤体形成和 终止细胞分裂的作用。以秋水仙素为代表的纺锤体抑制剂 能引起有丝分裂过程中纺锤丝断裂或抑制纺锤体的形成， 但不影响染色体的复制和着丝粒的分裂使正在分裂的细胞 停留在中期，以获得大量分裂相供分析之用。秋水仙素积 累分裂中期的作用，几乎对所有植物器官和许多动物的器 官都是十分有效的。
2低渗溶液
2.3低渗处理过程 秋水仙素处理2-4小时后，小心地从温箱取出培养瓶， 用滴管将培养液转移到10ml离心管并置离心机内离心，转 速为1500rpm，离心10min。离心后用滴管吸弃上清液， 培养物沉积在管底。然后加入37º 温育的低渗液8毫升，用 滴管吹打成单个细胞悬液，置37º C水浴处理20-30min，使 红细胞破碎，白细胞膨胀。
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3 固定
3.2固定液的种类 • 醋酸 • 作为混合固定液的一种成分，醋酸的优点在于：（1）可 以与已知的任何一种固定剂同时使用，并且可以和任意比 例的水、乙醇或甲醇混合；（2）浓度可以很低（1%）也 可以很高（99%）；（3）具有很强的穿透性能，比乙醇 的穿透性还高。 • 醋酸能使核酸沉淀使组蛋白溶解，但却不能固定细胞质蛋 白。在染色体结构的研究中，醋酸的主要用途是阻止染色 体收缩，使染色体的结构免于被破坏。经醋酸固定的物质 还能抵销乙醇的硬化作用。
3 固定
3.1基本原理与机制 • 用于固定的化学物对细胞都具有杀死作用，这类化学物可 分成二大类：一类能使染色体固缩，或使核酸和蛋白质纤 丝相脱离，另一类则可维持染色体结构的完整性。 • 为使染色体结构不受破坏，提高染色体的可见性及嗜碱 性，就需要使染色质物质沉淀。在活体条件下，细胞内不 同成分之间的相差并不足以使它们成为一种明显的单位。 可是随着蛋白质的凝结和沉淀，染色体的折射系数将发生 很大的变化从而使它们在细胞内成为明显的小体。正因为 如此，迄今所用的固定剂都具有交链蛋白质的特性，都能 使染色质沉淀。尽管常用的染色体固定剂往往是数种化学 物的混合物，但其中至少有一种化学物必须具备这一特性。
3 固定
固定剂的另一重要特性是能迅速地穿透组织或细胞， 并在—瞬间内杀死它们，这样方能使正在分裂的细胞立即 阻留在各自的时相上。瞬间杀死是很重要的，否则核分裂 仍可继续下去并到达所谓的“休止相”或“代谢相”，那 就无从研究染色体了。
3 固定
可是，随着细胞的死亡而出现的另一些变化(特别是 蛋白质的自溶作用)，往往会破坏染色体的原来结构。在 正常情况下，细胞内的酶参与蛋白质的合成，而当细胞死 亡时，由于介质变为酸性，这些酶便在相反方向起作用， 即使复合蛋白质裂解为简单的氨基酸。因为多肽是染色体 的主要成分之一，所以这种变性效应最终将引起染色体结 构的破坏。因此，作为一种固定剂也应能防止蛋白质的自 溶作用。此外，在细胞致死的同时，细菌的活动致使细胞 内成分的分解。因此一种好的固定剂应当既能起到防腐作 用，又能阻止细菌的分解作用。
3 固定
• 用作固定剂的化学物有非金属和金属两类。前者如乙醇，
甲醇、醋酸、甲醛、丙酸、苦味酸和氯仿等。后者如铬酸、 锇酸、氯化铂、氯化汞、硝酸铀等。其中有几种化学物还 可作为蒸气固定剂，也即在接触水或其它溶剂之前使可溶 性物质先转变为不溶性物质，这样就可在原位制作标本。 在细胞化学研究上，大多数非金属固定剂(除甲醛外)比之 于金属固定剂有一优点是，在固定之后无需在水中冲洗标 本。
2低渗溶液
经过秋水仙素处理后，细胞内的染色体比较适合于 观察了，但还是不能满足要求。因为人类细胞的染色体数 目多，形状小，最大的染色体约7—8微米，加之主要的观 察与分析均在油镜下进行，这就要求标本中的染色体彼此 散开，并且尽可能处于同一平面上。这些均有赖于低渗处 理。
2低渗溶液
2.1基本原理和机制 1965徐道觉发现未作低渗处理时，伴随染色体的一 些零乱的物质类似于核糖核蛋白体的颗粒，显然是有丝分 裂中核仁崩溃时的残存物。而低渗处理后，这些物质就消 失了。可见，低渗处理不只是凭借反渗透作用使细胞膨胀 染色体铺展，而且还可使粘附于染色体的核仁物质散开， 这样就能看清楚每一个扭曲的染色体。现在知道，覆盖在 染色体上的核仁物质大大地阻碍着染色体的分散。
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1.3处理过程 培养终止前在培养基中加入浓度为20μg/ml的秋水仙 素0.05~0.1ml（1ml注射器滴垂直3-5滴）使其最终浓度为 0.4~0.8μg/ml，置5%CO2、37º C±0.5º C培养箱中处理 2~4h。
1 纺锤体抑制剂
1.4注意事项 应当注意的是经秋水仙素处理后的细胞虽可用各种 不同的固定液(金属固定液或非金属固定液)予以固定，但 一定要在固定之前把秋水仙素从组织或细胞上冲洗掉，否 则沉积在细胞表面的秋水仙素不仅会影响染色体的形态， 而且还会阻碍固定液的穿透性。为此，在低渗处理后，应 尽早地加快速穿透液，如甲醇—冰醋酸固定液。要不然在 固定的时候，细胞核仍可能进入代谢期。
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• 醋酸是染色体的一种理想的固定剂，它可使染色体结构保