真核表达载体
真核细胞常见表达载体
真核细胞常见表达载体真核细胞, 表达载体1、pCMVp-NEO-BAN载体特点:该真核细胞表达载体分子量为6600碱基对，主要由CMVp启动子、兔β-球蛋白基因内含子、聚腺嘌呤、氨青霉素抗性基因和抗neo基因以及pBR322骨架构成，在大多数真核细胞内都能高水平稳定地表达外源目的基因。
更重要的是，由于该真核细胞表达载体中抗neo 基因存在，转染细胞后，用G418筛选，可建立稳定的、高表达目的基因的细胞株。
插入外源基因的克隆位点包括Sal1、BamH1和EcoR1位点。
注意在此载体中有二个EcoR1位点存在。
2、pEGFP, 增强型绦色荧光蛋白表达载体(Enhanced Fluorecent Protein Vector)特点: pEGFP表达载体中含有绿色荧光蛋白，在PCMV启动子驱动下，在真核细胞中高水平表达。
载体骨架中的SV40origin使该载体在任何表达SV40 T抗原的真核细胞内进行复制。
Neo抗性盒由SV40早期启动子、Tn5的neomycin/kanamycin抗性基因以及HSV-TK基因的聚腺嘌呤信号组成，能应用G418筛选稳定转染的真核细胞株。
此外，载体中的pUC origin 能保证该载体在大肠杆菌中的复制，而位于此表达盒上游的细菌启动子能驱动kanamycin抗性基因在大肠杆菌中的表达。
用途: 该表达载体EGFP上游有Nde1、Eco47111和Age1克隆位点，将外源基因扦入这些位点，将合成外源基因和EGFP的融合基因。
借此可确定外源基因在细胞内的表达和/或组织中的定位。
亦可用于检测克隆的启动子活性(取代CMV启动子,Acet1-Nhe1)。
3、pEGFT-Actin, 增强型绿色荧光蛋白/人肌动蛋白表达载体特点:pEGFP-Actin表达载体中含有绿色荧光蛋白和人胞浆β-肌动蛋白基因，在PCMV启动子驱动下，在真核细胞中高水平表达。
载体骨架中的SV40origin使该载体在任何表达SV40 T 抗原的真核细胞内进行复制。
真核细胞常见的表达载体及真核细胞表达外源基因的调控(精)
真核细胞常见表达载体1. pCMVp-NEO-BAN载体特点: 该真核细胞表达载体分子量为6600碱基对，主要由CMVp启动子、兔β-球蛋白基因内含子、聚腺嘌呤、氨青霉素抗性基因和抗neo基因以及pBR322骨架构成，在大多数真核细胞内都能高水平稳定地表达外源目的基因。
更重要的是，由于该真核细胞表达载体中抗neo基因存在，转染细胞后，用G418筛选，可建立稳定的、高表达目的基因的细胞株。
插入外源基因的克隆位点包括Sal1、BamH1和EcoR1位点。
注意在此载体中有二个EcoR1位点存在。
2. pEGFP, 增强型绦色荧光蛋白表达载体(Enhanced Fluorecent Protein Vector特点: pEGFP表达载体中含有绿色荧光蛋白，在PCMV启动子驱动下，在真核细胞中高水平表达。
载体骨架中的SV40 origin使该载体在任何表达SV40 T 抗原的真核细胞内进行复制。
Neo抗性盒由SV40早期启动子、Tn5的neomycin/kanamycin抗性基因以及HSV-TK基因的聚腺嘌呤信号组成，能应用G418筛选稳定转染的真核细胞株。
此外，载体中的pUC origin 能保证该载体在大肠杆菌中的复制，而位于此表达盒上游的细菌启动子能驱动kanamycin抗性基因在大肠杆菌中的表达。
用途: 该表达载体EGFP上游有Nde1、Eco47111和Age1克隆位点，将外源基因扦入这些位点，将合成外源基因和EGFP的融合基因。
借此可确定外源基因在细胞内的表达和/或组织中的定位。
亦可用于检测克隆的启动子活性(取代CMV启动子,Acet1-Nhe1。
Excitation maximum = 488 nm; Emission maximum = 507图示为启动子分泌信号肽和多克隆位点区域：Ase1.pCMV…ccg cta gcg cta ccg gtc gcc acc atg- .EGFP…BamH1…SV40 poly A+Nhe1 Age13. pEGFT-Actin, 增强型绿色荧光蛋白/人肌动蛋白表达载体特点: pEGFP-Actin表达载体中含有绿色荧光蛋白和人胞浆β-肌动蛋白基因，在PCMV启动子驱动下，在真核细胞中高水平表达。
真核细胞表达系统的类型与常用真核细胞表达载体
真核细胞表达系统的类型与常用真核细胞表达载体标签：真核细胞酵母表达系统细胞表达载体真核表达系统昆虫表达系统动物表达系统摘要 : 原核表达系统是常被用来研究基因功能的成熟系统，由于原核表达系统具有包涵体蛋白不易纯化、蛋白修饰不完整等缺陷，人们也开始利用真核细胞表达系统来研究基因。
原核表达系统是常被用来研究基因功能的成熟系统，由于原核表达系统具有包涵体蛋白不易纯化、蛋白修饰不完整等缺陷，人们也开始利用真核细胞表达系统来研究基因。
自上世纪70年代基因工程技术诞生以来，基因表达技术已渗透到生命科学研究的各个领域。
并随着人类基因组计划实施的进行，在技术方法上得到了很大发展，时至今日已取得令人瞩目的成就。
随着人类基因组计划的完成，越来越多的基因被发现，其中多数基因功能不明。
利用表达系统在哺乳动物细胞内表达目的基因是研究基因功能及其相互作用的重要手段。
在各种表达系统中，最早被采用进行研究的是原核表达系统，这也是目前掌握最为成熟的表达系统。
该项技术的主要方法是将已克隆入目的基因DNA段的载体(一般为质粒)转化细菌(通常选用的是大肠杆菌)，通过iptg诱导并最终纯化获得所需的目的蛋白。
其优点在于能够在较短时间内获得基因表达产物，而且所需的成本相对比较低廉。
但与此同时原核表达系统还存在许多难以克服的缺点：如通常使用的表达系统无法对表达时间及表达水平进行调控，有些基因的持续表达可能会对宿主细胞产生毒害作用，过量表达可能导致非生理反应，目的蛋白常以包涵体形式表达，导致产物纯化困难;而且原核表达系统翻译后加工修饰体系不完善，表达产物的生物活性较低。
为克服上述不足，许多学者将原核基因调控系统引入真核基因调控领域，其优点是：①根据原核生物蛋白与靶DNA间作用的高度特异性设计，而靶DNA与真核基因调控序列基本无同源性，故不存在基因的非特异性激活或抑制;②能诱导基因高效表达，可达105倍，为其他系统所不及;③能严格调控基因表达，即不仅可控制基因表达的“开关”，还可人为地调控基因表达量。
原核&真核表达载体构建
原核、真核表达载体构建真核表达载体和原核表达载体的区别：主要是因为原核和真核表达系统所需的表达元件不同。
比如说启动子，终止子在两种表达系统中是不一样的。
带有真核表达元件的是真核载体，能在真核生物内表达；带有原核表达元件的是原核载体，能在原核生物内表达。
两者都具有的为穿梭载体。
㈠原核表达载体指：能携带插入的外源核酸序列进入原核细胞中进行复制的载体。
原核表达载体调控原件1.启动子启动子是DNA链上一段能与RNA聚合酶结合并起始RNA合成的序列，它是基因表达不可缺少的重要调控序列。
没有启动子，基因就不能转录。
由于细菌RNA聚合酶不能识别真核基因的启动子，因此原核表达载体所用的启动子必须是原核启动子。
原核启动子是由两段彼此分开且又高度保守的核苷酸序列组成，对mRNA的合成极为重要。
在转录起始点上游5～10 bp处，有一段由6～8个碱基组成，富含A和T的区域，称为Pribnow 盒，又名TATA 盒或－10区。
来源不同的启动子，Pribnow 盒的碱基顺序稍有变化。
在距转录起始位点上游35 bp 处，有一段由10 bp组成的区域，称为-35区。
转录时大肠杆菌RNA聚合酶识别并结合启动子。
-35区与RNA聚合酶s亚基结合，-10区与RNA聚合酶的核心酶结合，在转录起始位点附近DNA被解旋形成单链，RNA聚合酶使第一和第二核苷酸形成磷酸二酯键，以后在RNA聚合酶作用下向前推进，形成新生的RNA 链。
原核表达系统中通常使用的可调控的启动子有Lac(乳糖启动子)、Trp(色氨酸启动子)、Tac(乳糖和色氨酸的杂合启动子) 、lPL (l噬菌体的左向启动子)、T7噬菌体启动子等。
2. SD序列1974年Shine和Dalgarno首先发现，在mRNA上有核糖体的结合位点，它们是起始密码子AUG和一段位于AUG上游3～10 bp处的由3～9 bp组成的序列。
这段序列富含嘌呤核苷酸，刚好与16S rRNA 3¢末端的富含嘧啶的序列互补，是核糖体RNA的识别与结合位点。
构建真核表达载体和融合载体经验pcr
此方法可能很多师兄师姐们都在用，只是当时的确没有找到相关的详细说明，学弟再次把自己摸索出来的一点心得写出来，高手就多多指正，没做过的就相互学习下，见笑）由于课题组所需，我需要构建数量可观的真核表达载体和融合载体起初我也查到相关菌落PCR的文献，和导师商量，导师一口回绝了他的理由和我所搜集到的理由一样：假阳性我们实验室一博士师姐需要做一个真核表达载体挑选了60个菌落，运用目的基因的上下游引物做PCR，出来条带的有有52个按照经验选取比较亮的14个提取质粒，酶切和PCR双鉴定结果仅有一个为阳性克隆，其余均为假阳性（假阳性主要考虑来源于未与载体结合的插入片段）也难怪老板一口回绝只是我需要做的基因太多，最凶猛的时候我一个星期要用两个200次的TianGen的质粒小提，累死人不偿命后来我自己对着图谱研究了一下（我所使用的是pCDNA3.0载体、pCDNA3.1 myc his C载体和pEGFP载体）.0的MCS两端有T7和SP6如果我用T7和SP6作为引物，则1.P出大小约150bp的片段，则为MCS序列，无插入片段2,若有插入片段，则应该为目的大小+152bp如下图所示：后再改进为T7+目的基因下游引物（目的基因-R），或者目的基因上游引物（目的基因-F)+SP6 因为即使用T7+SP6证明有插入但也不能确定为目的片段这样既解决了假阳性也解决了基因的特异性问题如下图：总结如下：1.PCR引物的选择（此点至关重要，这也是菌液PCR的独特魅力所在）选择一个载体上的特异性序列和一个目的基因上的特异性序列作为引物如：pCDNA3.0载体：T7+目的基因-R或SP6+目的基因-FpCDNA3.1 myc his C（只有上游T7无下游SP6）：T7+目的基因-RpEGFP（MCS两侧无通用序列）：自己设计靠近两侧的特异性引物（也可以求助于测序公司，如：上海英骏/Invitrogen，他们有绝大多数载体的测序用的引物序列）仔细的阅读你的载体图，选择针对阳性重组子的特异性引物组合2.菌落的处理（我用的是质粒小提，用15ml离心管摇菌，通常加5ml培养基）挑取新鲜菌落于含抗性的（LB）培养基中37°C 200rpm摇床摇2-4小时以上（通常赶时间的话我就在摇后3小时做，这时我的PCR循环数就要相应多些，设置为32-35个循环，若不赶时间的话，我都是取摇过夜的活化菌做模板，此时我的PCR循环数就相应少些，一般28-30个循环）3.菌液的处理无需特殊处理菌液或取1-2ul菌液稀释为100倍体积，沸水浴10-15mins甚至于在稀释体系中按1/1000加triton（这个我没做过）提出加triton的人说这是为了破膜，以便能够释放出带目的基因的质粒，不过我觉得此步骤多次一举，细胞膜在沸水浴中肯定会变形掉我试过沸水浴15mins，其效果和无需处理的菌液（实际上我在PCR的体系上做了手脚，后述）近似，所以后来我就没有再那么麻烦的去稀释，煮沸4.pcr体系：无特殊要求同普通PCR，我一般使用20ul或25ul体系，鉴定用嘛，不用太铺张，过少的体系也不推荐，除非你很信任你的“枪”和你的加样的力度5.模板的量：1-2ul未处理的和处理过的菌液均可以加1-2ul作为模板，需要说明的是PCR的反应是一个微量反应，用于检测10的负3-6次方级别，如果用未做任何处理的菌落来做PCR其量过于大，菌落通常都是10的6次方级别（因为我看到最近有一帖是一位仁兄直接用菌落做模板，我没有做过验证，但从原理上来说是不推荐的）6.退火温度：55-58°C此步我没有详细的论证，因为我的目的基因我都做过梯度PCR，其退火温度均可以用55°C 或者58°C完成T7，SP6的退火温度400-900bp的产物大概为55°我也有62度为最佳退火温度的产物，但是用T7+目的基因-R在58°C和55°C均可以P出目的条带7.循环数：取决于模板的拷贝数，最少的我试过28个，最多的也不过35个，均可以P出来8.预变形时间：因为嫌稀释菌液煮沸的过程很麻烦，所以后来我就直接取的活化菌液，考虑到的确可能细胞膜变形不完全，导致扩增的模板未能完全释放，以致扩增效率降低，我将预变形的时间改为10-15mins，效果不错，之前煮沸过的菌液自然不需要考虑这一步以上就是学弟的一点个人经验，绝大部分经过自己的验证，如有觉得不妥的地方还请大家多多指正！再次高呼：菌液PCR在阳性克隆的筛选中异常的方便和廉价，高度推崇！！！P.S. 通过长时间的魔鬼试验进程，我现在基本可以做到用肉眼高精度的识别菌落，一般挑取的菌落90%以上均为阳性菌落，所以这篇文章暂时定位于小鸟级别的分生试验者，老鸟。
真核细胞表达系统的类型与常用真核细胞表达载体
真核细胞表达系统的类型与常用真核细胞表达载体标签：真核细胞酵母表达系统细胞表达载体真核表达系统昆虫表达系统动物表达系统摘要: 原核表达系统是常被用来研究基因功能的成熟系统，由于原核表达系统具有包涵体蛋白不易纯化、蛋白修饰不完整等缺陷，人们也开始利用真核细胞表达系统来研究基因。
原核表达系统是常被用来研究基因功能的成熟系统，由于原核表达系统具有包涵体蛋白不易纯化、蛋白修饰不完整等缺陷，人们也开始利用真核细胞表达系统来研究基因。
自上世纪70年代基因工程技术诞生以来，基因表达技术已渗透到生命科学研究的各个领域。
并随着人类基因组计划实施的进行，在技术方法上得到了很大发展，时至今日已取得令人瞩目的成就。
随着人类基因组计划的完成，越来越多的基因被发现，其中多数基因功能不明。
利用表达系统在哺乳动物细胞内表达目的基因是研究基因功能及其相互作用的重要手段。
在各种表达系统中，最早被采用进行研究的是原核表达系统，这也是目前掌握最为成熟的表达系统。
该项技术的主要方法是将已克隆入目的基因DNA段的载体(一般为质粒)转化细菌(通常选用的是大肠杆菌)，通过iptg诱导并最终纯化获得所需的目的蛋白。
其优点在于能够在较短时间内获得基因表达产物，而且所需的成本相对比较低廉。
但与此同时原核表达系统还存在许多难以克服的缺点：如通常使用的表达系统无法对表达时间及表达水平进行调控，有些基因的持续表达可能会对宿主细胞产生毒害作用，过量表达可能导致非生理反应，目的蛋白常以包涵体形式表达，导致产物纯化困难;而且原核表达系统翻译后加工修饰体系不完善，表达产物的生物活性较低。
为克服上述不足，许多学者将原核基因调控系统引入真核基因调控领域，其优点是：①根据原核生物蛋白与靶DNA间作用的高度特异性设计，而靶DNA与真核基因调控序列基本无同源性，故不存在基因的非特异性激活或抑制;②能诱导基因高效表达，可达105倍，为其他系统所不及;③能严格调控基因表达，即不仅可控制基因表达的“开关”，还可人为地调控基因表达量。
真核载体构建
42℃、90sec
不含抗生素的培养基热休克 得到细菌的克隆
37℃ 涂布选择性平板 30-60min （合适抗生素） （使质粒扩增）
37℃ 10hr
2.感染（infection）：也称转导（transduction） 由噬菌体或病毒介导外源DNA进入宿主细胞的过程 有一个：体外包装过程
lDNA ®E-coli 动、植物病毒DNA ®动植物细胞
PCR扩增
vDNA polymerase 高保真酶 primerstar probest Phusion vRich GC sequence primerstar with GC buffer v热启动PCR，Nest PCR
载体构建步骤
v Get the target DNA sequence v Select appropriate vector v PCR primer design v Obtain cell or tissue v PCR amplification v Restriction, ligation and transformation
克隆载体→表达载体
A A
双 酶 切
表达载体
限制性内切酶
连接
v PCR product:vector 1：10~ 10:1（1：3 ~ 3：1）摩尔比 v At 25 °C for 23 hours or at 16 °C overnight v Inactive T4 DNA ligase (at 70 °C for 10min )
2. 缺点：①高水平表达基因产物易沉淀、凝集、不易折叠 ②基因产物纯化工艺复杂 ③基因产物易受污染（内毒素） ④基因产物对受体菌有毒害作用 ⑤基因产物易被水解 ⑥从安全角度——并不理想 ⑦缺乏基因产物表达后加工机制
基因工程中常用载体及其主要特点
基因工程中常用载体及其主要特点基因工程这一话题，听起来就像科幻小说里的情节，其实离我们并不遥远。
今天咱们就聊聊基因工程中的一些常用载体，简单明了，让你听得懂，明白得了！准备好了吗？那就跟我一起走进这奇妙的基因世界吧！1. 什么是载体？首先，得先搞清楚，什么是载体。
简单来说，载体就是那些能“背负”外来基因的“快递小哥”。
它们把我们想要的基因装上，然后送到目标细胞里。
这就像是你点了一份外卖，外卖小哥把美味的食物送到你家。
没有它们，我们的基因工程可就没法开展了。
想象一下，如果没有这些小哥，基因可怎么进得了细胞的大门呢？1.1 质粒载体说到载体，质粒可算是老前辈了。
质粒就像是细菌的“USB闪存”，它能自我复制，携带外来基因，简直就是基因工程的明星。
质粒的特点是操作简单、成本低，而且它们在细菌中可以很稳定地传递下去。
想想看，若是你把一张重要的文件放在闪存里，不仅可以在一台电脑上使用，还能借给朋友，这种“共享经济”在基因界也在不断上演。
质粒载体就是这样的存在，方便又实用，真是个好帮手！1.2 噬菌体载体再说说噬菌体载体。
这个名字听起来就有点威风，实际上它就是一种能感染细菌的病毒。
噬菌体载体像个特种部队，能精准地将目标基因送到细菌里。
它的特点是能在细菌中以极高的效率进行复制。
想象一下，像忍者一样悄无声息地完成任务，真是酷毙了！当然，它的使用相对复杂，需要一定的技术支持，不过一旦掌握，可是非常厉害的工具。
2. 常见的真核载体讲完细菌的载体，咱们再来看真核细胞的载体，这可得好好聊聊了。
2.1 真核表达载体真核表达载体，是为了在真核细胞中表达外来基因而设计的。
这就像是在高档餐厅里，得有专业的厨师才能把菜做好。
真核表达载体通常含有强大的启动子、终止子和选择标记。
它们能够确保外来基因在真核细胞中顺利表达。
举个例子，就像你去商场买了新衣服，得先试穿才知道合不合适，对吧？这载体也得确保外来基因在细胞中能够“穿”得合适，才能发挥作用。
载体选择
1、pCMVp-NEO-BAN载体特点: 该真核细胞表达载体分子量为6600碱基对，主要由CMVp启动子、兔β-球蛋白基因内含子、聚腺嘌呤、氨青霉素抗性基因和抗neo基因以及pBR322骨架构成，在大多数真核细胞内都能高水平稳定地表达外源目的基因。
更重要的是，由于该真核细胞表达载体中抗neo基因存在，转染细胞后，用G418筛选，可建立稳定的、高表达目的基因的细胞株。
插入外源基因的克隆位点包括Sal1、BamH1和EcoR1位点。
注意在此载体中有二个EcoR1位点存在。
2、pEGFP, 增强型绦色荧光蛋白表达载体(Enhanced Fluorecent Protein Vector)特点: pEGFP表达载体中含有绿色荧光蛋白，在PCMV启动子驱动下，在真核细胞中高水平表达。
载体骨架中的SV40 origin使该载体在任何表达SV40 T 抗原的真核细胞内进行复制。
Neo抗性盒由SV40早期启动子、Tn5的neomycin/kanamycin抗性基因以及HSV-TK基因的聚腺嘌呤信号组成，能应用G418筛选稳定转染的真核细胞株。
此外，载体中的pUC origin 能保证该载体在大肠杆菌中的复制，而位于此表达盒上游的细菌启动子能驱动kanamycin抗性基因在大肠杆菌中的表达。
用途: 该表达载体EGFP上游有Nde1、Eco47111和Age1克隆位点，将外源基因扦入这些位点，将合成外源基因和EGFP的融合基因。
借此可确定外源基因在细胞内的表达和/或组织中的定位。
亦可用于检测克隆的启动子活性(取代CMV启动子,Acet1-Nhe1)。
3、pEGFT-Actin, 增强型绿色荧光蛋白/人肌动蛋白表达载体特点: pEGFP-Actin表达载体中含有绿色荧光蛋白和人胞浆β-肌动蛋白基因，在PCMV启动子驱动下，在真核细胞中高水平表达。
载体骨架中的SV40 origin使该载体在任何表达SV40 T 抗原的真核细胞内进行复制。
几种表达载体
表达载体一、原核细胞表达载体1. pBAD载体:特点; 该表达质粒含有araBAD(arabinose)操纵子的P BAD启动子和编码该启动子的正负调控子基因araC，具有紧密调控功能和高水平表达外源蛋白质的原核细胞表达载体。
请注意:1. 当要扦入其他信号肽片段，改建此载体时，请不要利用该载体上的Nde1 EcoR1 BamH1 Kpn1和 Pst1位点，以免造成重组困难，因为前述内切酶在此载体上均有二个位点，最好使用只有一个酶切位点的Sac1和Hind111位点。
同时记住，如在不含任何信号肽的P BAD表达质粒扦入信号肽，其非编码N-末端要包含核糖体结合位点(RBS)核苷酸序列。
2在使用含Omp A分泌信号肽的P BAD表达质粒时，请应用Omp A分泌信号肽上的Sac1以及载体Hind111酶切位点，这些在载体序列上都是单个酶切位点。
本公司目前有含Omp A分泌信号肽和不含任何信号肽的二种P BAD表达质粒，其多克隆位点区域图谱如下:(a)、含Omp A分泌信号肽的P BAD表达质粒多克隆区域SDP BAD….TACCCGTTT TTTTCC….GCTAG CAGGAGGAAACG ATG AAA AAG ACA GCT ATC GCG ATT GCA GTG GCA CTG GCT GGTA M A E LTTC GCT ACC GTA GCC ATG GCC GAG CTC GGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGCCTGCAGGCATCCAAGCTTNco1 Sac1 Kpn1 Smal1 BamH1 Pst1 Hind111(b)、不含分泌信号肽的P BAD表达质粒多克隆区域EcoR1 Kpn1 BamH1 Pst1P BAD….TACCCGTTTTTTTGG….GCTAGCGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGCCTGCAGGCATCCAAGCTTNde1 Sac1 Smal 1 Hind111下图显示本公司应用pBAD表达载体完成的实验结果:pBAD载体驱动大分子蛋白质在原核细胞Origami(DE3)内高效表达2. pCAl-n & pCAl-pelB载体特点: 该原核细胞表达载体是来源于以T7 RNA聚合酶为基础的pET载体，含有T7/LacO启动子、编码钙调素结合多肽标鉴和凝血酶切点的核苷酸序列。
真核细胞常见表达载体复习过程
真核细胞常见表达载体真核细胞, 表达载体1、pCMVp-NEO-BAN 载体特点：该真核细胞表达载体分子量为6600碱基对，主要由CMVp启动子、兔B -球蛋白基因内含子、聚腺嘌呤、氨青霉素抗性基因和抗neo 基因以及pBR322 骨架构成，在大多数真核细胞内都能高水平稳定地表达外源目的基因。
更重要的是，由于该真核细胞表达载体中抗neo基因存在，转染细胞后，用G418筛选，可建立稳定的、高表达目的基因的细胞株。
插入外源基因的克隆位点包括Sall、BamHI和EcoRI位点。
注意在此载体中有二个EcoRI 位点存在。
2、pEGFP, 增强型绦色荧光蛋白表达载体(Enhanced Fluorecent Protein Vector)特点： pEGFP 表达载体中含有绿色荧光蛋白，在PCMV 启动子驱动下，在真核细胞中高水平表达。
载体骨架中的SV40origin使该载体在任何表达SV40 T抗原的真核细胞内进行复制。
Neo 抗性盒由SV40 早期启动子、Tn5 的neomycin/kanamycin 抗性基因以及HSV-TK 基因的聚腺嘌呤信号组成，能应用G418筛选稳定转染的真核细胞株。
此外，载体中的pUC origin 能保证该载体在大肠杆菌中的复制，而位于此表达盒上游的细菌启动子能驱动kanamycin 抗性基因在大肠杆菌中的表达。
用途：该表达载体EGFP上游有Nde1、Eco47111和Age1克隆位点，将外源基因扦入这些位点，将合成外源基因和EGFP的融合基因。
借此可确定外源基因在细胞内的表达和/或组织中的定位。
亦可用于检测克隆的启动子活性(取代CMV 启动子,Acet1-Nhe1) 。
3、pEGFT-Actin, 增强型绿色荧光蛋白/人肌动蛋白表达载体特点:pEGFP-Actin表达载体中含有绿色荧光蛋白和人胞浆B -肌动蛋白基因，在PCMV启动子驱动下，在真核细胞中高水平表达。
载体骨架中的SV40origin 使该载体在任何表达SV40 T 抗原的真核细胞内进行复制。
Neuritin真核表达载体的构建及鉴定
文 章 编 号 ：０ ７７ ８ （０ １０ —５８０ １０ —３３ ２ １ ）５０ ８—４
Ｎ ｕｉｎ真 核 表 达载 体 的构 建及 鉴 定 ｅ ｒｉ ｔ
钟 晨 ， 星 ， 娜 ， 瑾 罗 于 黄
（ 疆 地 方病 与 民族 高 发 病 教 育 部 重 点 实 验 室 ／ 河 子 大 学 医 学 院 ， 河 子 ８ ２ ０ ） 新 石 石 ３ ０ ２
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ＺＨＯＮＧ ｅ Ｌ ）Ｘｉ ＹＵ ， Ｃｈ ｎ， Ｕ（ ｎ， Ｎａ ＨＵＡＮＧ ｉ Ｊｎ
（ ｙＬ ｂ ｒ ｔｒ ｆＸｉｊ ｎ ｄ ｍｉ ａ ｄ Ｅｔ ｎｃＤｉｅｓ ｓ Ｍｅ ｉａ ｏ ｌｇ ， ｈｈ ｚ Ｕｎｖ ｒｉｙ Ｓ ｉｅｉ８ ２ ０ ， ｉａ Ｋｅ ａ ｏ ａｏ ｙｏ ｎｉ ｇＥｎ ｅ ｃ ｎ ｈ ｉ ｓａ ｅ／ ｄｃｌＣ ｌ ｅ Ｓ ｉｅｉ ｉｅ ｓｔ ． ｈｈ ｚ ３ ０ ２ Ｃｈｎ ） ａ ｅ
摘 要 ： ｕｉｎ Ｃ Ｇ ５是 一 种 神 经 营 养 因子 ， 促 进 神 经 突 起 生 长 ， 了探 讨 Ｎｅｒ ｉ Ｎｅｒ ｉ（ Ｐ １ ） ｔ 能 为 ｕｉｎ可能 的 作 用 机 制 ， 研 究 构 ｔ 本 建 了人 类 ｎｕｉ ｎ基 因的 真 核 表 达 载 体 。采 用 Ｐ Ｒ 技 术 扩 增 编 码 人 ｎｕｉ ｎ基 因 ｃ Ｎ 全 长 序 列 ， 纯 化 回收 ， ｅｒｉ ｔ Ｃ ｅｒｉ ｔ Ｄ Ａ 并 酶 切 、 接 人 真 核 表 达 载 体 ｐＤ 连 ｃ ＮＡ３ １一Ａ 中 ， 化 大肠 杆 菌 ＤＨ５ ， 取 阳性 克 隆 ｐＤＮＡ ． （） ｅ ｔ ． （） 转 ａ挑 ｃ ３ １一Ａ ｎｕ ｉｎ扩 增 ｒｉ 后 ， 取 质 粒 ， 行 双 酶 切 鉴 定 以 及 ＤＮ 测 序 鉴 定 。结 果 显 示 ， 建 的 重 组 质 粒 ｐＤ 提 进 Ａ 构 ｃ ＮＡ３ １ 一 Ａ ｎ ｕｉｎ含 有 ． （） —ｅ ｒｉ ｔ ４ Ｏ ｐｎｕｉｎ片段 ， 重 组 质 粒 所 含 的 ｎｕｉｎ读 框 片 段 与 ＧｅＢ ｎ Ｍ １ ５ ８ ２序 列 同 源 性 １０ 。 由此 可 ５ ｂ ｅ ｒｉ ｔ 且 ｅｒｉ ｔ ｎ ａｋ Ｎ ０ ６ ８ ． ０ 知 ： 功 构 建 了 ｐ Ｄ ３ １ 一Ａ ｎｕ ｉｎ真 核 表 达 载 体 ， 进 一 步 研 究 该 基 因 的 功 能及 作 用 机 制 奠 定 良好 的 实 验 基 成 ｅ ＮＡ ． （） － ｅｒ ｉ ｔ 为
几种基因表达的真核载体系统与新型口蹄疫疫苗
与 新 型 口蹄
渠春
生 产 力 下 降 及 贸 易 限 制 会 带 来
极 大 的经 济损 失 。 ＭＤ在 世 界 上 Ｆ 流 行 广 且 持 久 。在 所 有 易 感 动 物 中 使 用 灭 活 病 毒 作 为 免 疫 原 构
成 了控 制 及 消 除 本 病 的基 础 ，然
Ｒ Ａ； 次 ， 的基 因组 具 有 中度 Ｎ 其 它 一 国农 业 科 学 院 兰 州 兽 医 研 中 复 杂 性 ，其 复 制 与 转 录依 赖 ９ｂ ＡＶ一３为基 础 的 复 制 型 病 毒 载
体 可 容 纳 ２ ３ ｂ外 源 Ｄ Ａ，可 包 括 大 多数 结 构 基 因 ．ｋ Ｎ
］
。
（Ｅ Ｓ Ｂ Ｖ ）的优 点 ： １ 较 大 的杆 状 病 毒 的核 衣 壳 和基 （）
１ 口 蹄 疫 及 其 防 治 现 、
状 ：口蹄疫 （Ｍ 是 由Ｅ蹄疫 Ｆ Ｄ） ｌ
病 毒 （ ＭＤ 感 染 引 起 的 偶 蹄 动 Ｆ Ｖ） 物 共 患 的急 性 、热 性 、接 触 性 传 染 病 。其 爆 发 流 行 时 ，由于 动 物
重 组 病 毒 载 体 。 腺病 毒是 研 究 真 核 基 因 表达 的 良好 模 型 ，这 是 因为 腺 病 毒 易 于 培 养 和纯 化 ，在 感 染 过 程 中可 以产 生 大 量 的病 毒
一
进 展 ：基因 表达分为原核表达
和真 核 表 达 两 大 类 。在 两 类 表 达
系统 中 ，真 核 表 达 系统 所 表 达 的
甘 肃
兰
蛋 白 的构 象 形 成 、分 泌 和 加 工 修
饰 类 似 于 天 然 蛋 白质 原 型 ，具 有
州
较 高 的 生 物 学 活 性 ，作 为 抗 原 来
真核载体的应用和原理
真核载体的应用和原理简介真核生物是指细胞内含有真核细胞核的生物，包括动植物、真菌等。
真核生物的细胞包含多个细胞器，如细胞核、线粒体等。
对于研究真核生物的基因功能和表达调控，研究人员常常利用真核载体作为工具进行基因转染和表达。
本文将介绍真核载体的应用领域和基本原理。
应用领域基因转染真核载体可以用于将外源基因导入真核生物细胞中，通过基因转染可实现以下应用： - 基因功能研究：通过敲除或过表达外源基因，研究其对细胞和生物体的影响。
- 蛋白质表达：利用真核载体实现外源蛋白质在真核细胞中的高效表达。
- 基因治疗：将治疗基因导入患者体内，用于治疗一些遗传性疾病等。
转基因生物研究真核载体也被广泛应用于转基因生物研究，通过在真核生物细胞中导入外源基因，研究人员可以： - 验证基因功能：通过外源基因的表达，研究其在生物体中的功能和调控。
- 制备抗体：将外源蛋白表达在真核细胞中，制备特异性抗体，用于蛋白质识别和研究。
基本原理选择适合的真核载体在进行基因转染实验时，选择适合的真核载体非常重要。
常用的真核载体有：- 原核真核双操作子表达载体：这种载体结构合理，适合真核生物的表达。
- mama 单元载体：这类载体包含起始子，终止子，选择子，选择子较为灵活。
载体构建和转染技术为了实现外源基因的转染，通常需要进行以下步骤：1. 基因克隆：将外源基因插入载体中，构建重组载体。
2. 载体扩增：利用细菌进行大量的载体扩增。
3. 纯化载体DNA：纯化扩增后的载体DNA，去除可能存在的杂质。
4. 细胞培养：培养要转染的真核细胞，使其进入合适的状态。
5. 转染：将纯化的载体DNA导入培养的真核细胞中，实现外源基因的表达。
表达调控真核载体的应用还包括对外源基因的表达调控，研究人员通过改变载体中的启动子、转录因子结合位点等元件，可以实现基因的定量、定位和时序调控。
成果分析在转染后，需要进行相关结果的分析以验证实验效果。
常用的方法包括： - 蛋白质表达分析：通过免疫印迹法或荧光染色等技术，检测外源蛋白的表达情况和定位。
真核细胞常见表达载体
真核细胞常见表达载体真核细胞, 表达载体1、pCMVp-NEO-BAN载体特点：该真核细胞表达载体分子量为6600碱基对，主要由CMVp启动子、兔β-球蛋白基因内含子、聚腺嘌呤、氨青霉素抗性基因和抗neo基因以及pBR322骨架构成，在大多数真核细胞内都能高水平稳定地表达外源目的基因。
更重要的是，由于该真核细胞表达载体中抗neo基因存在,转染细胞后，用G418筛选，可建立稳定的、高表达目的基因的细胞株。
插入外源基因的克隆位点包括Sal1、BamH1和EcoR1位点。
注意在此载体中有二个EcoR1位点存在。
2、pEGFP，增强型绦色荧光蛋白表达载体（Enhanced Fluorecent Protein Vector)特点：pEGFP表达载体中含有绿色荧光蛋白，在PCMV启动子驱动下，在真核细胞中高水平表达。
载体骨架中的SV40origin使该载体在任何表达SV40 T抗原的真核细胞内进行复制。
Neo抗性盒由SV40早期启动子、Tn5的neomycin/kanamycin抗性基因以及HSV—TK基因的聚腺嘌呤信号组成，能应用G418筛选稳定转染的真核细胞株。
此外，载体中的pUC origin 能保证该载体在大肠杆菌中的复制，而位于此表达盒上游的细菌启动子能驱动kanamycin抗性基因在大肠杆菌中的表达.用途: 该表达载体EGFP上游有Nde1、Eco47111和Age1克隆位点,将外源基因扦入这些位点,将合成外源基因和EGFP的融合基因。
借此可确定外源基因在细胞内的表达和/或组织中的定位.亦可用于检测克隆的启动子活性（取代CMV启动子,Acet1-Nhe1）。
3、pEGFT-Actin，增强型绿色荧光蛋白/人肌动蛋白表达载体特点:pEGFP—Actin表达载体中含有绿色荧光蛋白和人胞浆β-肌动蛋白基因，在PCMV启动子驱动下，在真核细胞中高水平表达.载体骨架中的SV40origin使该载体在任何表达SV40 T抗原的真核细胞内进行复制。
真核表达系统
真核表达系统原核表达系统因其工艺简单、速度快而为人类带来许多便利，eg制药业由原先的脏器提取→发酵制备(IFN)，降低了本钱，扩大了来源，也缩短了生产周期。
可是由于原核细胞中没有转录后加工系统，不能识别、剪除内含子，因此很多真核基因就无法在原核细胞中表达；另外，原核细胞缺乏翻译后加工系统，不能对翻译的蛋白质进一步修饰加工。
因此许多糖蛋白在原核细胞中表达后，尽管一样形成蛋白质具有抗原性，却因为不能糖基化，而不产生功能。
例如，C1INH是一种高度糖基化的单链蛋白(49%分子量为糖基)，因其不可逆结合C1q而阻断补体活化途径，是一种极好的补体抑制剂，若是C1INH缺点可致使遗传性血管神经性水肿(HANE)，表现为全身水肿，尤其是喉头水肿，能够输血，以正常人血中的C1INH来补充医治，但长期输血价钱高，易引发副反映，故可用基因工程产品来医治HANE，但因C1INH为高度糖基化蛋白，在中表达没有活性，现已有人利用CHO表达C1INH，拟用于医治。
一、优势1.具转录后加工系统；2.具翻译后修饰系统；3.可实现真正的分泌表达，分泌至细胞外简化了纯化工艺。
二、真核基因结构及表达调控特点：(一)、基因结构特点：1.DNA极为丰硕，具全能性——mRNA丰度(选材)克隆真核基因的经常使用方式是提取细胞mRNA，反转录合成为cDNA。
尽管真核生物各类细胞中基因含量、种类相同，但却不是选择任一细胞提取其mRNA就可反转录合成出目的基因cDNA,因不同细胞间存在mRNA的丰度问题，基因在不同细胞中转录情形不一样，产生不同的功能蛋白，才表现出各类细胞的丰硕多样性。
故应选择mRNA丰度高的细胞为材料，eg. TNFα基因的克隆是以前髓细胞或早幼粒细胞为材料来源(Alice,1985)。
2.结构复杂，DNA与组蛋白结合，并在其外有核膜——真核生物转录、翻译不可能持续进行。
3.不持续性：内含子、外显子。
内含子可能参与基因调控，不同剪切方式产生不同蛋白质。
表达载体之原核VS真核
酿酒酵母表达系统常用启动子
1）糖酵解途径中关键酶的强启动子，受葡萄糖诱导：
甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因GAPDH
磷酸甘油激酶基因PKG
乙醇脱氢酶基因ADH
2）半乳糖激酶启动子（GAL1）
半乳糖诱导、葡萄糖抑制
GAL8
GAL4
UAS
GAL1
GAL7
GAL1
A、 GAL1、GAL7和 GAL10基因连锁在一起，独立转录，共同调控
3、甲醇酵母表达系统操作原理
宿主株与标记基因 甲醇酵母系统的整合事件 胞内表达与分泌表达
甲醇酵母系统宿主
二大宿主系统主要特点
项目 最适温度 毕赤酵母 30℃ 汉森酵母 37℃
最适pH值
甘油阻遏 糖基化 高密度发酵
4.5
是 部分过度 100g/L
4.5
否 较正常 100g/L
二大宿主系统主要选择标记
表 达 载 体 之 原 核 真 核
VS 万 佩
原 核 真 核
都原 是核 我表 们达 表体 达系 重与 组真 基核 因表 蛋达 白体 的系 重， 要亦 载如 体阴 ，阳 也， 各相 有辅 优相 劣成
目的基因
构建
转化
培养，诱导表达载体重组载体表达菌株
“基因——载体——菌株——培养”
常见启动子 λpL启动子： trp启动子： trc启动子： 热诱导启动子 化学诱导启动子 trp+lac杂交启动子
（一） 酿酒酵母表达系统
酿酒酵母系统启动子 酿酒酵母分泌系统 酿酒酵母糖基化系统 酿酒酵母表达系统存在的问题
1、酿酒酵母启动子
起始 位点 mRNA
40-120bp
DAS
编码序列
UAS
EBNA2基因真核表达载体的构建及表达产物的功能(一)
EBNA2基因真核表达载体的构建及表达产物的功能(一)【关键词】EBNA2 ConstructionofeukaryoticexpressionvectorofEBNA2andfunctionaldetection ofitsproduct【Abstract】AIM:ToconstructtheeukaryoticexpressionvectorofEBNA2andtoexpressitine ukaryoticcellsanddetectthefunctionofitsproduct.METHODS:EBNA2genewa sobtainedbyPCRandDNArecombinationfromtheplasmidpSG5EBNA2.PCRpr oductofEBNA2bwastheninsertedintoplasmidpMD18Tandsequenced.Thefull lengthEBNA2genewascutandinsertedintoeukaryoticexpressionplasmidpCM ingLipofectamineTM2000,theplasmidpCMVEBNA2wastransfectedin toCos7andthendetectedbyWesternblotandimmunofluorescence.Theactivit yofEBNA2wasdetectedbyluciferasereporterassay.RESULTS:TheEBNA2gene wassuccessfullyclonedanditssequencewasidenticaltothatinGenBank.Afterp lasmidpCMVEBNA2wastransfectedintoCos7,theexpressedproductofEBNA2 wasdetectedbyWesternblotandimmunofluorescence.Thetranscriptionalacti vityofEBNA2wasdemonstratedbyreporterassay.CONCLUSION:Theeukaryoti cexpressionvectorpCMVEBNA2hasbeensuccessfullyconstructedandsuccess fullyexpressedineukaryoticcellline.TheEBNA2proteinhastranscriptionalactiv ation.【Keywords】EBNA2;clone;expression;geneticvector【摘要】目的：构建EB病毒核心抗原2（EBNA2）的真核表达载体，在真核细胞中表达,并检测其表达产物的功能.方法：应用DNA重组和PCR方法从质粒pSG5EBNA2中亚克隆EBNA2的编码基因，插入到真核表达载体pCMVHA中.应用脂质体的方法将重组质粒pCMVEBNA2瞬时转染Cos7细胞，通过Westernblot和免疫荧光方法检测EBNA2的表达.应用荧光素酶报告实验检测EBNA2蛋白的活性.结果：克隆EBNA2的编码基因，经序列分析证实与GenBank中的序列完全一致.以含有EBNA2编码基因的真核表达载体瞬时转染Cos7细胞，EBNA2基因的表达产物通过Westernblot和免疫荧光方法得到证实.荧光素酶报告实验显示所表达的蛋白具有转录激活活性.结论：成功构建EBNA2的真核表达载体，证实其在真核细胞Cos7可以表达，并具有转录激活功能.【关键词】EBNA2基因；克隆；表达；遗传载体0引言EB病毒核心抗原2（EBNA2）的编码产物是EB病毒体外感染细胞时最先表达的蛋白，作为一种转录因子，它可以调节病毒及细胞内多种基因表达，如LMP1，LMP2A〔1〕，CD21，CD23及cmyc等，同时还可以抑制细胞免疫球蛋白重链的转录.Notch信号途径是体内一个非常保守的信号途径，在体内分布十分广泛〔2〕.EBNA2可以与Notch信号途径中的重要分子RBPJκ相结合，激活下游靶基因，并通过模仿Notch信号途径对体内淋巴细胞的分化和发育方向起调控作用〔3〕.同时EBNA2还可以促进抑癌分子p53的磷酸化〔4〕，调节癌基因的表达.我们对EBNA2基因进行了克隆，并在真核细胞中表达，为进一步探讨其对小鼠免疫系统发育过程的影响奠定基础.1材料和方法1.1材料大肠杆菌XL10；质粒载体pCMVHA，pBluscript（-），pGA9816为本室保存.载体pMD18T购自TaKaRa公司.Cos7细胞为本室保存.脂质体LipofectamineTM2000及细胞培养试剂均购自Invitrogene公司.抗EBNA2抗体购自Dako公司，HRP标记抗小鼠IgG,FITC标记抗小鼠IgG 购自博士德公司.小量质粒提取试剂盒、DNA胶回收试剂盒均购自华瞬生物工程公司.PCR试剂盒、各种限制性内切酶购自TaKaRa公司.根据GenBank中EBNA2基因的序列，设计2条引物：引物2的5＇端加入XhoⅠ位点，引物1和引物2用于扩增EBNA2基因的3＇端部分（EBNA2b）.引物1：5＇CTCGGGGCCACCATGGTGGC3＇；引物2:5＇CGCCTCGAGTTACTGGATGGAGGGG3＇.1.2方法1.2.1EBNA2基因的克隆及真核表达载体的构建EcoRⅠ/BglⅡ/SalⅠ三酶切质粒pSG5EBNA2，胶回收 4.0kb大小片段，将回收片段插入经EcoRⅠ/BamHⅠ双酶切开的pBluscript（-）载体中，命名为pBSSKEBNA2.以pSG5EBNA2为模板，用引物1和引物2进行常规PCR反应，扩增EBNA2基因的3＇部分EBNA2b.PCR反应条件：于94℃变性5min后，按下列参数循环35次：即94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，最后于72℃延伸7min.PCR产物克隆到pMD18T载体中，NcoⅠ/XhoⅠ酶切鉴定阳性克隆，命名为pMDEBNA2b.用NcoⅠ/XhoⅠ从pMDEBNA2b 中切下EBNA2b片段插入用NcoⅠ/XhoⅠ切开的pBSSKEBNA2载体pBSSKEBNA2a中，NcoⅠ单酶切和EcoRⅠ/XhoⅠ双酶切鉴定，命名为pBSSKEBNA2（a+b）.pCMVEBNA2用EcoRⅠ/XhoⅠ双酶切质粒pBSSKEBNA2（a+b），回收1500bp片段，将其插入EcoRⅠ/XhoⅠ切开的pCMVHA载体中，酶切鉴定阳性克隆，命名为pCMVEBNA2.1.2.2EBNA2表达的检测①WesternblotCos7细胞于转染前1d接种于直径60mm中皿，接种4×105个细胞,接种16h后，应用LipofectamineTM200010μL转染质粒pCMVEBNA24μg.转染60h后裂解细胞收集蛋白上清，加入2×加样缓冲液，煮沸5min.然后进行120g/LSDSPAGE电泳，于180mA稳压状态下转膜3h.于室温用20g/L蛋白干粉封闭1h后，一抗antiEBNA2（1∶1000）4℃过夜.PBST洗涤3次，每次5min.二抗抗鼠IgGHRP（1∶4000）室温作用1h，同上洗涤后，进行放射性显影.②免疫荧光Cos7细胞于转染前1d接种于直径60mm中皿，于皿底事先加入圆形玻片，转染过程同上，对照组转染质粒pCMVHA.转染60h后取出爬有细胞的玻片，PBS洗涤3次，每次5min；10g/LBSA37℃封闭1h；一抗antiEBNA2（1∶200）37℃避光湿盒中染色1h；同上洗涤；二抗抗鼠IgGFITC（1∶500）37℃避光湿盒中染色1h；同上洗涤后，荧光显微镜观察.1.2.3共转染报告质粒检测荧光素酶强度细胞准备和转染过程同上，对照组转染：pGA98160.2μg，βgal0.2μg，pCMVHA1.6μg；检测组转染：pGA98160.2μg，βgal0.2μg，pCMVEBNA20.2μg，pCMVHA1.4μg.转染48h 后收细胞.反复液氮中冻溶裂解，充分震荡混匀，样品与反应底物1∶5比例混合后，照度仪中检测荧光素酶强度.。
真核荧光蛋白表达载体pEGVP-C3-B7.2-MAGE-1的构建与表达
Ｊｕｎｌ ｆ ｈｎｚｏ ｎ ｅ ｉ （ ｄｃｌ ｃ ｎｅ） Ｓｐ ｏｒａ ｏ ｅｇｈｕＵ ｉ ｒｔ Ｍｅｉ ｉ ｃｓ ｅ ． Ｑ Ｚ ｖ ｓｙ ａＳ ｅ
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真核荧光蛋 白表达载体 ｐ Ｇ － ３Ｂ ．－ Ｇ － Ｅ 】 Ｃ －７２ＭＡ Ｅ １的构建与表达
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＃ 讯 作 者 ， ，４岁 ， 授 ， 究 方 向 ： 瘤 免 疫学 ，－ ａｌ ｈｙｎ＠ ＺＵ ｅｕ ｅ 通 男 ５ 教 研 肿 Ｅｍ ｉ ｓｌ ｇ Ｚ．ｄ ．ｎ ： ａ
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关键词
Ｂ ． ； Ｇ ．； ７ ２ ＭＡ Ｅ １ 真核 表 达 载 体 ； 瘤 免 疫 肿
ＱБайду номын сангаас８ ７２
中图分类号
摘 要 目的 ： 建 表达 Ｂ ． 构 ７ ２和 ＭＡ Ｅ １ 绿 色 荧 光 共 表 达 载 体 ｐ Ｇ ＰＣ 一７ ２ＭＡ Ｅ ｌ并 在 真 核 细 胞 中表 Ｇ ．的 Ｅ Ｆ －３Ｂ ．－ Ｇ －， 达 。方 法 ： 据 Ｇ ｎ ａｋ中的 序 列 ， Ｂ ． 、 Ｇ － 根 ｅＢ ｎ 对 ７２ ＭＡ Ｅ１各设 计 一 对 两 端 带 有 特 定 限制 性 酶 切 位 点 的引 物 ， 别 从 乳 分 腺组 织 、 癌 组 织 提 取 总 Ｒ Ａ， 行 Ｒ ．Ｃ 乳 Ｎ 进 ＴＰ Ｒ后 ， 两 扩 增 产 物 分别 克 隆 在 ｐ Ｅ Ｔ载 体 ， 测 序证 实 碱 基 序列 无 误 将 Ｇ Ｍ． 经
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真核细胞常见表达载体
1、pCMVp-NEO-BAN载体
特点: 该真核细胞表达载体分子量为6600碱基对，主要由CMVp启动子、兔β-球蛋白基因内含子、聚腺嘌呤、氨青霉素抗性基因和抗neo基因以及pBR322骨架构成，在大多数真核细胞内都能高水平稳定地表达外源目的基因。
更重要的是，由于该真核细胞表达载体中抗neo基因存在，转染细胞后，用G418筛选，可建立稳定的、高表达目的基因的细胞株。
插入外源基因的克隆位点包括Sal1、BamH1和EcoR1位点。
注意在此载体中有二个EcoR1位点存在。
2、pEGFP, 增强型绦色荧光蛋白表达载体(Enhanced Fluorecent Protein Vector)
特点: pEGFP表达载体中含有绿色荧光蛋白，在PCMV启动子驱动下，在真核细胞中高水平表达。
载体骨架中的SV40 origin使该载体在任何表达SV40 T 抗原的真核细胞内进行复制。
Neo抗性盒由SV40早期启动子、Tn5的neomycin/kanamycin抗性基因以及HSV-TK基因的聚腺嘌呤信号组成，能应用G418筛选稳定转染的真核细胞株。
此外，载体中的pUC origin 能保证该载体在大肠杆菌中的复制，而位于此表达盒上游的细菌启动子能驱动kanamycin抗性基因在大肠杆菌中的表达。
用途: 该表达载体EGFP上游有Nde1、Eco47111和Age1克隆位点，将外源基因扦入这些位点，将合成外源基因和EGFP的融合基因。
借此可确定外源基因在细胞内的表达和/或组织中的定位。
亦可用于检测克隆的启动子活性(取代CMV启动子,Acet1-Nhe1)。
3、pEGFT-Actin, 增强型绿色荧光蛋白/人肌动蛋白表达载体
特点: pEGFP-Actin表达载体中含有绿色荧光蛋白和人胞浆β-肌动蛋白基因，在PCMV启动子驱动下，在真核细胞中高水平表达。
载体骨架中的SV40 origin使该载体在任何表达SV40 T 抗原的真核细胞内进行复制。
Neo抗性盒由SV40早期启动子、Tn5的neomycin/kanamycin抗性基因以及HSV-TK基因的聚腺嘌呤信号组成，能应用G418筛选稳定转染的真核细胞株。
此外，载体中的pUC origin 能保证该载体在大肠杆菌中的复制，而位于此表达盒上游的细菌启动子能驱动kanamycin抗性基因在大肠杆菌中的表达。
用途: pEGFP-Actin载体在真核细胞表达EGFP-Actin融合蛋白，该蛋白能整合到胞内正在生的肌动蛋白，因而在活细胞和固定细胞中观察到细胞内含肌动蛋白的亚细胞结构。
4、pSV2表达载体
特点：该表达质粒是以病责SV40启动子驱动在真核细胞目的基因进行表达的，克隆位点为Hind111。
SV40启动子具有组织/细胞的选择特异性。
此载体不含neo基因，故不能用来筛选、建立稳定的表达细胞株。
5、CMV4 表达载体
特点:该真核细胞表达载体由CMV启动子驱动，多克隆区域酶切位点选择性较多。
含有氨苄青霉素抗性基因和生长基因片段以及SV40复制原点和fl单链复制原点。
但值得注意的是，该表达载体不含有neo基因，转染細胞后不能用G418筛选稳定的表达细胞株。
其他常用克隆Vector：
pBluscript II KS DNA 15 ug
pUC18 DNA 25 ug
pUC19 DNA 25 ug
说明:
pBluescript II kS、pUC18 & Puc19载体适合于DNA片段的克隆、DNA测序和对外源基因进行表达等。
这些载体由于在lacZ基因中含有多克隆位点，当外源DNA片段扦入，转化lacZ基因缺乏细胞，并在含有IPTG 和X-gal的培养基上培养时，含有外源DNA载体的细胞将为白色菌落，而无外源DNA片段载体的细胞则为兰色菌落，由此易于筛选有无外源DNA片段的载体。
此外，这些载体中有便于测序的M13、T7和T3的通用引物进行DNA测序。
保存液: TE Buffer
TE Buffer组成:
10mM Tris.HCL(Ph 8.0)
1mM EDTA
用途:
克隆外源DNA片断.
进行基因表达.
使用M13、T7和T3引物进行测序.
存在的问题
细胞的生命活动是一个复杂的调控过程，有些生命活动的机理还不完全清晰，由于插人的目的基因不同，载体构建栗用的顺式组件不同，组装的空间位置不同，采用的表达系统不同，目的基因表达水平和阳性克隆筛选率都会有很大差异。
另外，由于所有的顺式元件存在种属和组织特异性，所构建的高效表达载体不一定在所有细胞株中均高效表达。
再者，细胞生长状态的差异，转染方法的不同培养时阉的长短，筛选药物浓度的高低，对表达量都有很大影响。
所以，需要综合评价一个表达载体和表达系统，排除一些不定因素，筛选出最佳组合
真核表达载体趋向于既有利于扩增目的基因又有利于筛选阳性克隆的载体的构建。
许多有效的应用范围广的强启动子和增强子被人发现并应用于载体中，大大提高了目的基因的表达量，另外一些强的组成型启动子，如SV40早期启动子+PHTLv，已应用于大规模生产的细胞系中。
应用以GS为筛选标志的表达载体可兼有筛选和扩增目的基因两种功能，是目前研究的重点。
以IRES连接的双顺反子表达载体已成为核表达载体的主体。
在同一启动子操纵下，筛选基因或报告基因与目的基因转录在同一mRNA上通过IRES的作用，表达出两种蛋白，因而在理论上可认为，通过了筛选或表达了报告基因的克隆必为阳性克隆，即表达目的基因的克隆，有报道说这种双顺反子的共表达率为90％。
这就大大提高了筛选率，简化了实验过程。
将强启动子、增强子和可扩增的筛选标志组装在同一载体上，构建高效表达和筛选的表达载体并将其运用于最合适的表达系统中，是当今真核表达载体构建研究发展方向。