光合作用部分实验
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光合作用实验总结
周二上午第二组 成员:蒲艳丽、李寅时、李悦、张涵超
光合作用
• 绿色植物吸收光能,同化二氧化碳和水,制造有机物并释放氧的过程。
• 叶绿体是光合作用的基础结构。 • 分为光反应和暗反应两个阶段:
✓光反应(light reaction):必须在光下进行,由光所引起的光化学反应, 它主要在基粒类囊体膜(光合膜)上进行;
实验组,溶液呈现蓝绿色 对照组,溶液呈现绿色
原理:在弱酸作用下,叶绿素中镁可被氢原子取
代而成为褐色的去镁叶绿素,后者遇铜则成为绿 色的铜代叶绿素。
• 分光镜观察
溶液/自然 光
自然光
叶绿素
皂化上层 皂化下层 取代反应
光谱描述
自然光的光 红橙光和蓝 与自然光光 与自然光相 该溶液透过
谱呈现从红 紫光条带几 谱相比,光 比,该光谱 的光线很弱,
✓暗反应(dark reaction):不需要光,由若干酶所催化的化学反应,暗 反应是在间质中进行的。
希尔反应 2H2O+2A → 2AH2+O2
• 希尔反应是指叶绿体借助光能使电子受体还原并放出氧的反应。将离 体叶绿体加到具有氢受体的水溶液中,照光后及发生水的分解而放出 氧气,这个反应即为希尔反应。本实验氧化剂采用2,6 -二氯酚靛酚。
操作(1)取新鲜菠菜叶片2克,擦干,去中脉,剪碎放入研钵;加入少许石英砂和 CaCO3,再加入无水丙酮10ml,研磨成匀浆,再加丙酮15ml;用漏斗滤去残渣,得叶绿 体色素提取液(置于暗处)。
(2)层析样纸制备,将优质滤纸剪成3cm×9cm的长条,将一端剪成中央留约 1cm×0.5cm的窄条;用细玻璃棒蘸取叶绿体色素提取液点于层析纸的窄条上端中央 部,吹干后在原处重复点样7-8次;在层析缸中加入3-5ml层析推动液,然后将已点样 的层析纸插入缸的側壁槽内,调节纸条使窄条1/2部分浸入推动液中,盖好盖子,于 阴暗处展层约10min,即可在层析纸上分辨出4种不同的清楚色层。
实验步骤
1.叶绿体色素的提取
取新鲜菠菜叶片0.25克,擦干,去中脉,剪碎放入研钵;加入 少许石英砂和CaCO3,再加入95%乙醇3ml,研磨成匀浆, 再加95%乙醇10ml,静置10分钟;用漏斗滤去残渣,用乙醇 反复冲洗研钵、残渣至无色;用容量瓶定容至50ml 。
2.吸光度的测定
取光径1cm比色杯,注入上述叶绿素提取液,以95%乙醇 注入另一同样的比色杯内作为空白对照,在波长665、649 和470nm下测定吸光度。
• 实验步骤
✓制备叶绿体悬浮液:用菠菜叶片和预冷提取液混合研磨,过滤,再将 提取液分低速、高速离心两次,得到破碎叶绿体沉淀,加入预冷提取 液制得叶绿体悬浮液。
✓证明离体叶绿体的还原作用:在悬浮液中加入2,6 -二氯酚靛酚→蓝黑 色;分为两组,一组置于光下,一组置于黑暗中。
希尔反应 2H2O+2A → 2AH2+O2
• 实验结果 • 实验意义 ✓证明光合作用在叶绿体中进行 ✓发现了光反应中有光诱导的电子传递和水的光解及O2释放;发现了水在光反
应中起到的是供氢体和电子供体的双重作用。
希尔反应 2H2O+2A → 2AH2+O2
实验影响因素: • 叶绿体含量 • 光照强度 • 缓冲液、 2,6 -二氯酚靛酚的酸碱度及温度
光 到 紫 光 完 乎完全消失 谱 中 的 蓝 紫 中 红 橙 光 和 红 橙 光 条 带
整的条带分
光条带几乎 蓝紫光的条 消失大部分,
布;
完全消失, 带均有明显 蓝紫光条带
但红橙光条 减弱,但并 几乎完全消
带几乎不变 未完全消失 失
叶绿素的提取分离及其理化性质
• 影响实验因素 提取时加入的Caco3、石英砂过多,破坏了叶绿素结构 分离:将点的叶绿素小点浸入层析液中会使得色素直接溶解在层析液中,导致叶绿素线不清 晰。
各色素含量
Ca(叶绿素a)=13.95×0.241– 6.8×0.107=2.65mg/l Cb(叶绿素b)=24.96×0.107 – 7.32×0.241=0.907mg/l CT(叶绿素)=Ca+Cb=18.16×0.107 + 6.63×0.241=3.55mg/l Cx.c(类胡萝卜素)=(1000×0.269 – 2.05Ca114.8Cb)/248=0.644mg/l 叶绿素总含量=2.84mg/g
类胡萝卜素总含量=0.52mg/g
实验结果
(wk.baidu.com)全素培养番茄
波长/组别 1
2
3
平均
665nm 0.302 0.306 0.300 0.303
649nm 0.132 0.132 0.131 0.132
470nm 0.359 0.358 0.352 0.356
各色素含量 Ca(叶绿素a)=13.95A665 – 6.8A649=3.33mg/l Cb(叶绿素b)=24.96A649 – 7.32A665 =1.08mg/l CT(叶绿素)=Ca+Cb=18.16A649 + 6.63A665=4.41mg/l Cx.c(类胡萝卜素)=(1000A470 – 2.05Ca114.8Cb)/248=0.91mg/l 叶绿素总含量=11.025mg/g 类胡萝卜素总含量=2.275mg/g
实验讨论
讨论: 叶绿素a、b在蓝色区也有吸收峰,能否用这一吸 收峰波长进行叶绿素的定量分析?为什么?
不能,因为类胡萝卜素在蓝色区吸收光最大,所以在测 定叶绿素a、叶绿素b 时,为了排除类胡萝卜素的干扰, 所用单色光的波长应选择叶绿素在红光区的最大吸收峰。
叶绿素的提取分离及其理化性质
• 叶绿素提取与分离(纸层析法)
未 加 KOH- 甲 醇 溶 液的叶绿素,上层 溶液为叶绿素。
照射光下
皂化反应上 层,溶解的 是反应生成 的油脂。
叶绿素的提取分离及其理化性质
• 叶绿素分子中Mg2+的取代作用 操作:取2只试管,分别加入2ml叶绿体色素提取液, 第1只作为对照,第2只加入数滴5%HCl,摇匀,观察溶 液颜色变化.当溶液变褐后,再加入少量醋酸铜粉末, 并微加热.与对照比较,观察溶液颜色变化。
叶绿体色素含量= 色素浓度(mg.L1) 提取液体积(L) 稀释倍数 样品鲜重(或干重、面积,g或m2)
实验结果
(1)菠菜吸光值
波长(nm) 665 649 470
1 0.249 0.111 0.278
2 0.234 0.104 0.262
3 0.238 0.105 0.268
平均 0.241 0.107 0.269
叶绿素的提取分离及其理化性质
• 荧光现象的观察 操作:取浓的叶绿体色素提取液化3ml,在透射光 和反射光下观察叶绿体色素提取液的颜色. 原理:叶绿素具有荧光,故从与入射光相垂直的 反射光下 方向观察叶绿素溶液呈血红色
• 皂化作用 操作:在观察过荧光现象的叶绿体色素提取液中 加入2ml的20%KOH-甲醇溶液,充分混匀.吹打5分 钟;沿试管壁缓慢加入3ml乙醚+4ml的蒸馏水,边滴 加边摇动,直至看到溶液逐渐分为两层为止. 对照 不加KOH-甲醇溶液. 原理:叶绿素是一种二羧酸酯,在碱作用下,发 生皂化反应
原理
(1)提取:叶绿体中含有叶绿素(叶绿素a与b)和类胡萝卜素(胡萝卜素和叶黄素), 这两类色素均不溶于水,而溶于有机溶剂,故常用乙醇、丙酮等有机溶剂提取。
(2)分离当溶剂沿支持物不断向前推进时,由于叶绿体中不同色素分子结构不同, 在两相(流动相与固定相)间具有不同的分配系数,因此它们移动速率不同。对叶绿 体色素进行层析可将不同色素分离。
• 2,6 -二氯酚靛酚的用量
叶绿体色素含量的测定 ----分光光度法
实验原理
利用95%乙醇提取叶绿体色素,叶绿素a、叶绿素b和 类胡萝卜素最大吸收峰的波长分别是665nm、649nm和 470nm。
根据分光光度计测定的吸光度值,可以计算出乙醇提取 液中叶绿体色素含量。
实验目的
掌握分光光度法对叶绿素a、叶绿素b、叶绿素总浓 度和类胡萝卜素总浓度测定和计算的方法。
3.结果计算
依据下列乙醇提取液中色素浓度计算公式,分别计算出叶 绿素a、b的浓度及其叶绿素总浓度和类胡萝卜素的浓度。
计算公式
95%乙醇提取液中色素浓度的计算
Ca(叶绿素a)=13.95A665 – 6.8A649 Cb(叶绿素b)=24.96A649 – 7.32A665 CT(叶绿素)=Ca+Cb=18.16A649 + 6.63A665 Cx.c(类胡萝卜素)=(1000A470 – 2.05Ca-114.8Cb)/248
实验结果
(3)缺磷培养番茄
波长(nm) 1
2
3
平均
665
0.261 0.265 0.263 0.263
649
0.136 0.136 0.138 0.137
470
0.326 0.331 0.331 0.329
各色素含量 Ca(叶绿素a)=13.95 ×0.263– 6.8×0.137=2.74mg/l Cb(叶绿素b)=24.96×0.137 – 7.32×0.263 =1.50mg/l CT(叶绿素)=Ca+Cb=18.16×0.137+ 6.63×0.263=4.24mg/l Cx.c(类胡萝卜素)=(1000×0.329– 2.05Ca114.8Cb)/248=0.609mg/l 叶绿素总含量=0.848mg/g 类胡萝卜素总含量=0.122mg/g
周二上午第二组 成员:蒲艳丽、李寅时、李悦、张涵超
光合作用
• 绿色植物吸收光能,同化二氧化碳和水,制造有机物并释放氧的过程。
• 叶绿体是光合作用的基础结构。 • 分为光反应和暗反应两个阶段:
✓光反应(light reaction):必须在光下进行,由光所引起的光化学反应, 它主要在基粒类囊体膜(光合膜)上进行;
实验组,溶液呈现蓝绿色 对照组,溶液呈现绿色
原理:在弱酸作用下,叶绿素中镁可被氢原子取
代而成为褐色的去镁叶绿素,后者遇铜则成为绿 色的铜代叶绿素。
• 分光镜观察
溶液/自然 光
自然光
叶绿素
皂化上层 皂化下层 取代反应
光谱描述
自然光的光 红橙光和蓝 与自然光光 与自然光相 该溶液透过
谱呈现从红 紫光条带几 谱相比,光 比,该光谱 的光线很弱,
✓暗反应(dark reaction):不需要光,由若干酶所催化的化学反应,暗 反应是在间质中进行的。
希尔反应 2H2O+2A → 2AH2+O2
• 希尔反应是指叶绿体借助光能使电子受体还原并放出氧的反应。将离 体叶绿体加到具有氢受体的水溶液中,照光后及发生水的分解而放出 氧气,这个反应即为希尔反应。本实验氧化剂采用2,6 -二氯酚靛酚。
操作(1)取新鲜菠菜叶片2克,擦干,去中脉,剪碎放入研钵;加入少许石英砂和 CaCO3,再加入无水丙酮10ml,研磨成匀浆,再加丙酮15ml;用漏斗滤去残渣,得叶绿 体色素提取液(置于暗处)。
(2)层析样纸制备,将优质滤纸剪成3cm×9cm的长条,将一端剪成中央留约 1cm×0.5cm的窄条;用细玻璃棒蘸取叶绿体色素提取液点于层析纸的窄条上端中央 部,吹干后在原处重复点样7-8次;在层析缸中加入3-5ml层析推动液,然后将已点样 的层析纸插入缸的側壁槽内,调节纸条使窄条1/2部分浸入推动液中,盖好盖子,于 阴暗处展层约10min,即可在层析纸上分辨出4种不同的清楚色层。
实验步骤
1.叶绿体色素的提取
取新鲜菠菜叶片0.25克,擦干,去中脉,剪碎放入研钵;加入 少许石英砂和CaCO3,再加入95%乙醇3ml,研磨成匀浆, 再加95%乙醇10ml,静置10分钟;用漏斗滤去残渣,用乙醇 反复冲洗研钵、残渣至无色;用容量瓶定容至50ml 。
2.吸光度的测定
取光径1cm比色杯,注入上述叶绿素提取液,以95%乙醇 注入另一同样的比色杯内作为空白对照,在波长665、649 和470nm下测定吸光度。
• 实验步骤
✓制备叶绿体悬浮液:用菠菜叶片和预冷提取液混合研磨,过滤,再将 提取液分低速、高速离心两次,得到破碎叶绿体沉淀,加入预冷提取 液制得叶绿体悬浮液。
✓证明离体叶绿体的还原作用:在悬浮液中加入2,6 -二氯酚靛酚→蓝黑 色;分为两组,一组置于光下,一组置于黑暗中。
希尔反应 2H2O+2A → 2AH2+O2
• 实验结果 • 实验意义 ✓证明光合作用在叶绿体中进行 ✓发现了光反应中有光诱导的电子传递和水的光解及O2释放;发现了水在光反
应中起到的是供氢体和电子供体的双重作用。
希尔反应 2H2O+2A → 2AH2+O2
实验影响因素: • 叶绿体含量 • 光照强度 • 缓冲液、 2,6 -二氯酚靛酚的酸碱度及温度
光 到 紫 光 完 乎完全消失 谱 中 的 蓝 紫 中 红 橙 光 和 红 橙 光 条 带
整的条带分
光条带几乎 蓝紫光的条 消失大部分,
布;
完全消失, 带均有明显 蓝紫光条带
但红橙光条 减弱,但并 几乎完全消
带几乎不变 未完全消失 失
叶绿素的提取分离及其理化性质
• 影响实验因素 提取时加入的Caco3、石英砂过多,破坏了叶绿素结构 分离:将点的叶绿素小点浸入层析液中会使得色素直接溶解在层析液中,导致叶绿素线不清 晰。
各色素含量
Ca(叶绿素a)=13.95×0.241– 6.8×0.107=2.65mg/l Cb(叶绿素b)=24.96×0.107 – 7.32×0.241=0.907mg/l CT(叶绿素)=Ca+Cb=18.16×0.107 + 6.63×0.241=3.55mg/l Cx.c(类胡萝卜素)=(1000×0.269 – 2.05Ca114.8Cb)/248=0.644mg/l 叶绿素总含量=2.84mg/g
类胡萝卜素总含量=0.52mg/g
实验结果
(wk.baidu.com)全素培养番茄
波长/组别 1
2
3
平均
665nm 0.302 0.306 0.300 0.303
649nm 0.132 0.132 0.131 0.132
470nm 0.359 0.358 0.352 0.356
各色素含量 Ca(叶绿素a)=13.95A665 – 6.8A649=3.33mg/l Cb(叶绿素b)=24.96A649 – 7.32A665 =1.08mg/l CT(叶绿素)=Ca+Cb=18.16A649 + 6.63A665=4.41mg/l Cx.c(类胡萝卜素)=(1000A470 – 2.05Ca114.8Cb)/248=0.91mg/l 叶绿素总含量=11.025mg/g 类胡萝卜素总含量=2.275mg/g
实验讨论
讨论: 叶绿素a、b在蓝色区也有吸收峰,能否用这一吸 收峰波长进行叶绿素的定量分析?为什么?
不能,因为类胡萝卜素在蓝色区吸收光最大,所以在测 定叶绿素a、叶绿素b 时,为了排除类胡萝卜素的干扰, 所用单色光的波长应选择叶绿素在红光区的最大吸收峰。
叶绿素的提取分离及其理化性质
• 叶绿素提取与分离(纸层析法)
未 加 KOH- 甲 醇 溶 液的叶绿素,上层 溶液为叶绿素。
照射光下
皂化反应上 层,溶解的 是反应生成 的油脂。
叶绿素的提取分离及其理化性质
• 叶绿素分子中Mg2+的取代作用 操作:取2只试管,分别加入2ml叶绿体色素提取液, 第1只作为对照,第2只加入数滴5%HCl,摇匀,观察溶 液颜色变化.当溶液变褐后,再加入少量醋酸铜粉末, 并微加热.与对照比较,观察溶液颜色变化。
叶绿体色素含量= 色素浓度(mg.L1) 提取液体积(L) 稀释倍数 样品鲜重(或干重、面积,g或m2)
实验结果
(1)菠菜吸光值
波长(nm) 665 649 470
1 0.249 0.111 0.278
2 0.234 0.104 0.262
3 0.238 0.105 0.268
平均 0.241 0.107 0.269
叶绿素的提取分离及其理化性质
• 荧光现象的观察 操作:取浓的叶绿体色素提取液化3ml,在透射光 和反射光下观察叶绿体色素提取液的颜色. 原理:叶绿素具有荧光,故从与入射光相垂直的 反射光下 方向观察叶绿素溶液呈血红色
• 皂化作用 操作:在观察过荧光现象的叶绿体色素提取液中 加入2ml的20%KOH-甲醇溶液,充分混匀.吹打5分 钟;沿试管壁缓慢加入3ml乙醚+4ml的蒸馏水,边滴 加边摇动,直至看到溶液逐渐分为两层为止. 对照 不加KOH-甲醇溶液. 原理:叶绿素是一种二羧酸酯,在碱作用下,发 生皂化反应
原理
(1)提取:叶绿体中含有叶绿素(叶绿素a与b)和类胡萝卜素(胡萝卜素和叶黄素), 这两类色素均不溶于水,而溶于有机溶剂,故常用乙醇、丙酮等有机溶剂提取。
(2)分离当溶剂沿支持物不断向前推进时,由于叶绿体中不同色素分子结构不同, 在两相(流动相与固定相)间具有不同的分配系数,因此它们移动速率不同。对叶绿 体色素进行层析可将不同色素分离。
• 2,6 -二氯酚靛酚的用量
叶绿体色素含量的测定 ----分光光度法
实验原理
利用95%乙醇提取叶绿体色素,叶绿素a、叶绿素b和 类胡萝卜素最大吸收峰的波长分别是665nm、649nm和 470nm。
根据分光光度计测定的吸光度值,可以计算出乙醇提取 液中叶绿体色素含量。
实验目的
掌握分光光度法对叶绿素a、叶绿素b、叶绿素总浓 度和类胡萝卜素总浓度测定和计算的方法。
3.结果计算
依据下列乙醇提取液中色素浓度计算公式,分别计算出叶 绿素a、b的浓度及其叶绿素总浓度和类胡萝卜素的浓度。
计算公式
95%乙醇提取液中色素浓度的计算
Ca(叶绿素a)=13.95A665 – 6.8A649 Cb(叶绿素b)=24.96A649 – 7.32A665 CT(叶绿素)=Ca+Cb=18.16A649 + 6.63A665 Cx.c(类胡萝卜素)=(1000A470 – 2.05Ca-114.8Cb)/248
实验结果
(3)缺磷培养番茄
波长(nm) 1
2
3
平均
665
0.261 0.265 0.263 0.263
649
0.136 0.136 0.138 0.137
470
0.326 0.331 0.331 0.329
各色素含量 Ca(叶绿素a)=13.95 ×0.263– 6.8×0.137=2.74mg/l Cb(叶绿素b)=24.96×0.137 – 7.32×0.263 =1.50mg/l CT(叶绿素)=Ca+Cb=18.16×0.137+ 6.63×0.263=4.24mg/l Cx.c(类胡萝卜素)=(1000×0.329– 2.05Ca114.8Cb)/248=0.609mg/l 叶绿素总含量=0.848mg/g 类胡萝卜素总含量=0.122mg/g