内毒素检查的常见干扰及消除
凝血酶细菌内毒素检测干扰因素的分析与排除
山西医药杂志 ２ １ １ ０ ０年 １月第 ３ 卷第 １ 期上半 月 Ｓ ａ ｘ Ｍｅ ， ｏ ｅ ｂ ｒ ０ Ｖ Ｉ ！ ． ！！ ９ １ ｈ ｎ ｉ ｄＪＮ ｖｍ ｅ ２ ｌ ， ． ！！ ！
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研 究 生论 坛 ・
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凝 血酶细 菌 内毒 素检 测 干 扰 因素 的分 析 与排 除
外 ８ ０℃ 、０ １ ０℃ 中各 １瓶 保 温 ６ ｎ后 取 出 冷 却 ， 上 清 ０ ｍｉ 取 液 进 行 系列 稀 释 （ ２ ， 个 稀 释 度平 行 做 ２支 ， 格 按 文 表 ）每 严 献 Ｅ ］ 法 。凝 血 酶 溶 解 后 经 ８ ℃ 水 浴 保 温 ６ ｎ处 理 ３方 Ｏ ０ ｍｉ 后 ， 菌 内毒 素检 测 结 果 与 经 １ ０ ℃ 水 浴 保 温 ３ 、 ０ ｍｉ 细 ０ Ｏ ６ ｎ 处 理 后 细 菌 内 毒 素 检 测 结 果 不 一 致 ， １ ０ ℃ 水 浴 保 温 而 ０ ３ 、 ０ｍｉ 理 后 细 菌 内毒 素 检 测 结 果 一 致 。凝 血 酶 溶 解 Ｏ ６ ｎ处
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影响细菌内毒素检查结果可靠性的因素及克服方法
影响细菌内毒素检查结果可靠性的因素及克服方法华W西C药J学'杂P志S2加2,I7(11/:79～}}0n^J,l,l:一影响细菌内毒素检查结果可靠性的因素及克服方法王明清四川省广元市人民医院.四川广元628000摘要:目的探讨影响细菌内毒素检查法的因素及克服方法:方法查阅文献,结合实践和实验进行阐述.结果标准品,灵敏度,器具处理后的放置时间及操作环境,条件等均对内毒素检查结果有影响.结论克服以上因素可使内毒素检查法结果更加准确,可靠.关键词:细菌内毒素;影响因素;克服方法中圈分类号:R927.12文献标识码:B文章编号:1006—0103c2oo21ol一0079—02 细菌内毒素检查法仍被2000年版中国药典继续收载,并比1995年版规定更细,要求更高.我们在实际工作中发现,当具体执行时,仍存在不少值得研究和探讨的问题-,这些问题均可影响细菌内毒素检查法结果的可靠性.1细菌内毒素工作标准品对鲎试剂灵敏度的影响细菌内毒素标准品有两种,一种为细菌内毒素国家标准品,用于标定生产厂家生产的细菌内毒素及仲裁鲎试剂的灵敏度;另一种为厂家生产的细菌内毒素工作标准品,用于标定鲎试剂的灵敏度及试验中的阳性对照.可见内毒素工作标准品的质量,直接影响鲎试剂的灵敏度.1.1实验材料和方法鲎试剂(厦门,灵敏度标示值0.5EU?ml～,每支0.1ml,批号:951220);细菌内毒素工作标准品(每支10EU,批号:950101)及超纯水.鲎试剂(福州,灵敏度标示值0.5EU?rrd～,每支01rrd,批号: 960114);细菌内毒素工作标准品(每支5EL",批号: 950913)及超纯水.其它材料按药典实验要求进行灵敏度复核用各地生产的内毒素工作标准品对其鲎试剂的灵敏度进行复核,均符合标示值.当以厦门产细菌内毒素工作标准品复核福州产鲎试剂灵敏度时,其灵敏度有所提高;当以福州产细菌内毒素复核厦门鲎试剂灵敏度时,则灵敏度有所降低,复核时.仍存在差异.蔡红等报道.也证实这一点.这种现象的发生,是鲎试剂的质量问题,还是内毒素工作标准品的质量问题,因无国家标准品仲裁,故无法定论,但作者简介:王明清.男.副主任药师,从事医院药学工作应引起重视.在实际工作中,则建议使用某厂生产的鲎试剂,就用该厂供给的内毒素工作标准品或国家标准品来标定鲎试剂灵敏度,标示值与实测值符合规定,则可用于细菌内毒素的检测,使结果正确可靠.最好避免此厂产内毒素标准品复核彼厂产鲎试剂的灵敏度或用于样品内毒素的检测1.2鲎试剂灵敏度的选择厦复核正确选择灵敏度是保证鲎法检测内毒素结果可靠性的依据.热原大多数是微生物的内毒素,其检查方法仅为限量检查.而药品因其剂型,用量不同而热原限量亦不同,如果选用的鲎试剂灵敏度低于药品内毒素限量,则出现假阴性,若高于药品内毒素限量的灵敏度,则出现假阳性,均达不到检测热原以保证药品质量的目的.所以必须确定药品的细菌内毒素限值.根据确定的药品细菌内毒素限值而选择鲎试剂的灵敏度.鲎试剂是一种生物制品,使用前必须对购回的鲎试剂按中国药典2000年版规定对其灵敏度进行复核,当复核结果符合规定时方可用于细菌内毒素检查.试验前应按药典规定作"供试品干扰试验",否则其结果可疑.2供试品调pH值在细菌内毒素检查法中,对供试品DH的调试各国药典要求不同,美国药典和英国药典均规定pH6～8,而中国药典对此未作具体规定,高国政等则认为pH的调节很有必要.因大输液所含成分对鲎法无干扰,可以不调DH,同时鲎试剂本身具有一定的缓冲能力.但除大输液以外的品种,应进行多次调与不调pH的平行对比试验及多个试验室的复试方可定论80华西药学杂志第l7卷3器具的处理及放置时间试验所用器具必须无热原化处理,2000年版药典已明确规定.工作中曾出现过同一品种使用,经无热原化处理放置24h后的器具作热原试验,出现阳性结果;复核时,器具除热原后放置12h后用于细菌内毒素检查,结果阴性故器具除热原后放置12h应立即使用,最好不超过24h.4严格控制细菌内毒素检查法的操作环境,条件和时间在中国药典2000年版二部细菌内毒素检查中,未规定在37±1℃保温60±2min前的操作环境,操作时间和室内温度,笔者认为这是药典不够完善的地方.为此,作了如下实验.鲎试剂(福州0.5EU?ml～,每支0.1ml,批号: 960503);细菌内毒素工作标准品(每支10EU,批号: 960326)及细菌内毒素检查用水(批号:960109,每支2m1).实验过程中,室内温度分别为l5℃,23℃,28℃, 30℃,32℃.操作时间分别为10,20,30min.内毒素工作标准的浓度分别为1,0.5,0.25,0.125EU? ml.于37±l℃保温60±2min,观察发现,在室温28℃以上时,随着操作时间的延长,鲎试剂的灵敏度有所提高.工作中曾出现过因放置室温不同,实验时间不同而出现假阳性的结果;复试时,室温降低, 操作时间缩短则结果阴性;临床验证,无热原反应. 因此,整个细菌内毒素检查,从溶解,稀释,混合到放人水浴保温及结果判定的总时间控制在室温28℃及以上时,不超过80rain;室温在28℃及以下时,不超过90n即保温前操作时间为28℃及以上时20min;28℃以下时30min.参考文献I郭录平浅谈影响鲎试验的因素[J:中国药学杂志1996,319 (3):1872蔡红,王豫蓉.粱平鲎试剂灵敏度对细菌内毒素限量硷查的影响初探J]中国医院药学杂志.1998.I8(2】:853高国政,颤锦值影响鲥苗内毒素测定的实验研究[』:中国药学杂志,1998.33(3):162收藕日期:200012(上接第78页)1.2.3碱液中的硫酸沙丁胺醇片的含量测定精密量取"1.2.2"项下的续滤液3ml置250ml量瓶中,加0.01mol?L氢氧化钠液稀释至刻度,摇匀,照分光光度法在244/lilt波长处测定吸光度,以沙丁胺醇的吸收系数为506计算,并将测定的结果乘以1.2049,即得(表1).1.2.4碱液中的加样回收试验取1.2.3"项下已知含量的溶液,精密加人一定量的沙丁胺醇标准溶液,同法测定.平均加样回收率为99.4%,RSD=O.73%(=4).1.2.5HPLC测定硫酸沙丁胺醇片的含量取"1.2.2"项下的续滤液5置25量瓶中,加流动相稀释至刻度,摇匀,照文献..方法测定,按内标法以峰面积计算,并将测定的结果乘以1.2049,即得(表1.襄l硫酸沙丁胺醇片的含量测定结果{H=32讨论2.1从实验结果及表l可以看出,碱液法与HPLC法结果基本一致,而酸液法结果明显偏高.碱液法所用的浓度最低,酸液法次之,HPLC法所用的浓度最高.显然,改变溶液的酸碱性和检测波长,可提高其检测灵敏度.2.2采用紫外分光光度法测定硫酸沙丁胺醇片的含量,在碱液中较酸液中检测灵敏度提高7倍以上.文献[1]的测定方法改为高效液相色谱法,但操作较繁琐,灵敏度较低,且需使用对照品和内标物质此外,新版药典中硫酸沙丁胺醇注射液及硫酸沙丁胺醇胶囊的含量测定仍为灵敏度较低的吸收系数59的紫外分光光度法,均有待改进2.3试验表明,碱液法中样品宜先加水溶解过滤后再用氢氧化钠液碱化后测定,若直接将样品溶于氢氧化钠溶液中,过滤稀释后再测定,则结果偏高约5%,其原因有待进一步考证参考文献l中华人民共和国国家药典委员会中国药典【s]二部北京:化学工业出版杜,20oo.8712英国药典[s]上册199819213张晓橙喘乐宁气雾剂古量测定方法的改进J]药物分析杂志, 1992.I2(2):80收稿日期:2'001—02。
影响内毒素G试验结果的常见因素
影响内毒素、G试验结果的一些常见因素
一、采血严格按照无菌要求采集，须用专门配套耗材，采血后及时送检。
二、黄疸、溶血、乳糜血会影响检测结果。
三、引起细菌内毒素假阳性原因是：使用某些抗生素类药物，如磺胺类、以细菌为原料加工成的药物。
四、引起G试验假阳性原因有：
1、应用纤维素膜进行血液透析患者；
2、某些纱布或其他医疗物品中含有葡聚糖；
3、某些品牌的静脉制剂（白蛋白、凝血因子、免疫球蛋白等）含有葡聚糖；
4、某些细菌败血病患者（尤其是链球菌败血症）；
5、抗肿瘤药物（如香菇多糖、裂殖菌多糖等）；
6、含有菌类食物。
五、隐球菌和接合菌不能检出。
六、内毒素检测的灵敏度大概为88%，特异性为90%；G试验的灵敏度为88%，特异性为85%。
七、一次检测结果不能成为确诊依据，须由临床医生根据检测结果并结合临床症状及其他检测结果综合分析。
八、G试验适用于深部真菌，浅部真菌在体内血液中含量并不增高。
九、尽管假阳性原因不清，需进行动态监测（1-3）-β-D葡聚糖的变化，可以降低假阳性的发生。
内毒素鲎实验,如何消除样品干扰？
内毒素鲎实验，如何消除样品干扰？在鲎试剂检验内毒素试验中有些样品严重干扰鲎试验生化反应，甚至使反应不能进行。
这就需要采用特殊方法对样品进行预处理。
1 稀释法相当大一部分样品的干扰因素在一定浓度下才起作用，把样品适量稀释后即可按常规方法测定。
如甘露醇、庆大霉素、人血白蛋白、肝素钠和维生素 C 等注射液等。
2 加热法有些干扰因素为不耐热的物质，将样品在适当温度下保温一段时间，即可按常规方法测定。
如某些血液制品和生物药品等。
3 调整 pH 值法有些样品 PH 值偏高或偏低，且鲎试剂中 pH 缓冲剂不能将反应液调整至正常范围。
这时可用预先处理并已确认无菌无热原的盐酸或氢氧化钠液调整样品液 pH。
然后按常规方法测定，如氨基酸注射液。
4 超滤─反冲法一般中草药注射液成份复杂，干扰因素较多，难以用普通方法加以消除，即可用超滤法。
取样品适量，进行超滤，样品药液全部压滤通过滤膜，内毒素被阻滤在超滤膜片上，再取少量无热原水冲洗滤器、滤膜。
卸开滤器，将超滤膜反向放置滤器上，严密固定。
再用无热原水将内毒素从超滤膜上冲至一量瓶中，精密加水至刻度。
冲洗液按常规方法测定。
5 固体样品若固体样品为可溶性物质，用无热原水溶解，按上述方法进行干扰样品试验。
手术器械、一次性输液器等固体物品的内毒素测定，用适量无热原水按规定方法浸泡或冲洗即可。
内毒素的水溶性较大，器具内表面或外表面的内毒素经适当时间、适当温度浸泡或冲洗，即可溶入液体，按常规方法测定。
对于复杂样品还需将上述各法联合应用。
但不管单独用其一法，或二法、三法联用，在操作过程中均有可能出现抑制或增敏等干扰作用，使测定浓度高于或低于实际浓度，这时必须做回收率实验，并根据测得的回收率求算内毒素。
内毒素问题总结报告
内毒素问题总结报告1.目的1.1解决内毒素反复的问题1.2找出内毒素反复的原因2.背景从200501批次验证到200701批次验证一直存在内毒素反复不合格的问题，为了确认内毒素不合格的原因并予以解决，现进行内毒素问题筛查与解决。
3.试验过程3.1初步筛查准备SAM溶液、活化I、活化II、匀浆后溶液按照以下列表取样：按照上述样品取样后，每组样品加入内毒素用水13ml置于37℃、100rpm摇床振摇浸提。
取浸提液100ul加入1.5ml内毒素用水稀释16倍，置于漩涡混合机混合，取100ul 内毒素用水至0.03EU鲎试剂，然后加入100ul混合液封口置于内毒素测定仪37℃反应1h，倒转观察鲎试剂凝固或滴落，以此判定待测产品内毒素是否合格。
试验结果如下：初步筛查结果显示为活化II步骤存在问题，下一步主要针对活化II 进行筛查。
准备活化II、溶液＋CaCl2、溶液＋EDC、清洗未匀浆、200501二楼冻干成品、200501三楼冻干成品样品，按照下表取样：按照上述样品取样后，每组样品加入内毒素用水13ml置于37℃、100rpm摇床振摇浸提。
取浸提液100ul加入1.5ml内毒素用水稀释16倍，置于漩涡混合机混合，取100ul 内毒素用水至0.03EU鲎试剂，然后加入100ul混合液封口置于内毒素测定仪37℃反应1h，倒转观察鲎试剂凝固或滴落，以此判定待测产品内毒素是否合格。
试验结果如下：根据当前两次筛查结果显示，可能在活化II阶段存在干扰，其他步段无法检出干扰因素，分别针对溶液加CaCl2、EDC进行筛查，结果显示均为阴性，因此结合文献推断可能是Ca2+和β-葡聚糖组合干扰。
当前阶段，可供选择的解决方案有：1.采用物理方法排除干扰因素2.采用试剂排除干扰因素3.增大稀释倍数，采用精度更高的鲎试剂4.采用抗增液，结合更高精度鲎试剂3.3物理方法排除干扰针对活化II溶液，采取离心、过滤的方法进行试验。
离心方案为取2.4g溶液在3000rpm离心10min，然后对上清液进行浸提、稀释、检测，结果发现3000rpm离心10min无明显分层现象，且上层呈阳性；过滤方案为取2.4g溶液使用0.22um和0.45um的过滤器进行过滤，对滤液进行浸提、稀释、检测，结果发现溶液使用过滤器容易堵塞过滤器且过滤效率慢，且检测滤液呈阳性。
内毒素消除干扰的方法
内毒素消除干扰的方法内毒素啊，这玩意儿就像个调皮的小恶魔，老在我们不注意的时候出来捣乱。
那怎么对付这个小恶魔，把它的干扰给消除掉呢？咱先来说说物理方法。
就好比家里有灰尘，我们可以用扫帚把它扫出去一样，对于内毒素，我们也可以通过一些物理手段来处理。
比如过滤，就像筛子筛东西似的，把那些大颗粒的内毒素给拦住，不让它们到处乱跑。
还有超滤，这就像是个更精细的筛子，能把更小的内毒素也给截留下来。
再说说化学方法。
这就像是给内毒素喂了一颗“毒药”，让它失去作恶的能力。
比如说酸碱处理，让内毒素在不合适的环境里没法嚣张。
还有一些特殊的化学试剂，能和内毒素发生反应，把它给“收拾”了。
然后呢，还有生物方法。
想象一下，内毒素就像是入侵的敌人，而我们的身体里有自己的“军队”，比如一些酶，它们就能专门对付内毒素，把它给降解掉，让它没法再兴风作浪。
还有啊，我们在日常生活中也得注意一些细节。
比如保持环境清洁，别让那些可能带有内毒素的东西随便进入我们的“领地”。
使用的器具要经常清洗消毒，这就像是给它们穿上一层“铠甲”，让内毒素没法轻易附着。
在处理内毒素的时候，可不能马虎大意啊！要是不认真对待，那不是给自己找麻烦吗？就像出门不看天气预报，结果被雨淋成了落汤鸡，多冤啊！我们得时刻保持警惕，用各种方法把内毒素的干扰降到最低。
想想看，如果内毒素肆意妄为，那我们的身体、我们的实验、我们的工作不都得乱套了吗？所以啊，一定要重视内毒素消除干扰的方法，把这个小恶魔牢牢地控制住。
别让它在我们的生活和工作中捣乱，让我们的一切都能顺顺利利的。
这可不是小事，这是关系到我们健康和工作质量的大事啊！大家可千万别不当回事儿，一定要认真对待，积极采取措施，让内毒素乖乖听话，别再给我们制造麻烦啦！。
细菌内毒素检查法常见问题与探讨
此文章来源：/s/blog_4fcb513e01000bgj.html细菌内毒素检查法常见问题与探讨摘要: 目的总结归纳细菌内毒素检查法中的常见问题，方法收集整理工作中发现的问题，查阅国内外有关文献资料，对照分析应用情况并比较其差异。
结果与结论：从五个方面较为全面的总结了细菌内毒素检查法所涉及到的问题，认为在应用方面还需要进一步完善、规范。
关键词：细菌内毒素检查法；问题Discussion of common issues in the BactarilEndutoxin Test, BETZHOU Su-Wen.（Pharmacology Laboratory, Hubei Institute of Drug Examination,Wuhan 430064）ABSTRACT: OBJECTIVE to summarize and conclude the common problems in the bacterial endotoxins test. METHODS by collecting the practical problems in work and referring to the related articals and information, we compared and analyzed their differences. RESULTSand CONCLUSION the problems concerning the bacterial andotoxins test were comprehensively generalized in the review from five aspects and the conclusion showed that the application of the bacterial endotoxins test need to be further enhanced and standardized.Key word: Bactaril Endutoxin Test；problems细菌内毒素检查法(BactarilEndutoxinTest,BET )是近二十年来发展起来的用于检测药品及其中间品中内毒素污染的一种方法；作为家兔热原检查法的一种替代，已经十分成熟，美国药典迄今已为八百余种药品制定了该项检查法，中国药典自1990年版开始收载以来，每版药典细菌内毒素检查品种也逐步增多，2005年版已增加到204种，并且在增补本中将继续增加收载数量，该方法相对家兔热原检查法而言，有劳动强度低、快捷、经济、灵敏和易于标准化等优点，受到广大药品质检人员高度关注。
内毒素检测影响因素
内毒素检测影响因素
1．有些物质对鲎试剂一内毒素凝胶反应有干扰作用，得出假阳性结果。
据报道：氨基酸、抗生素、碳水化合物、电解质、维生素、络合剂和添加剂产生抑制干扰；二价阳离子、右旋糖酐一40、鲎试剂反应物质、某些蛋白质、凝血酶等则能产生强化干扰得出假阳性结果。
2．葡聚糖的存在可致阳性结果，却不引起家兔发热，具有葡聚糖结构的物质包括血制品里的白蛋白、抗凝血酶、免疫球蛋白等故目葡聚糖及其类似物又称真菌多糖，这些成分在药品制备过程中有可能存在，此外．抗凝血酶、胰蛋白酶，免疫球蛋白、多棱苷酸、棕榈酰右旋糖酐磷酸盐、铜铵人造膜、纤维索膜等都能与TAL发生凝胶反应．导致实验结果的假阳性；
3．弃G因子鲎试剂排除了某些激活G因子这一旁路的干扰，使鲎试剂对内毒素发生反应具有专一性．去G因子鲎试剂即是一种只对内毒素起反应，而对r1—31一B—D—Glucan及类似物不起反应的鲎试剂因此．在有条件的情况下，采用去G因子鲎试剂，也是减少假阳性发生的有欢方法之～。
4．鲎试剂与内毒素的反应的最适宜pH值在6．5—8．0；TAL最佳反应pH值为6．5～7，低于5．7时TAL几乎没有反应活性，pH小于3或大于9时，酶的活性受到抑制，直接检查，甚至改变整个酶分子系统使其变性失活。
故鲎试验时，供试品pH最好应预调到6．5—7．0为好。
凝胶法细菌内毒素检查中常遇的问题及解决方法
凝胶法细菌内毒素检查中常遇的问题及解决方法陈邦树广西壮族自治区药品检验所广西南宁530021[摘要] 目的：探讨凝胶法细菌内毒素检查中常遇的问题及解决方法。
方法：对实际工作中遇到的一些具体问题进行多侧面的分析。
结果：对凝胶法细菌内毒素检查中常遇的问题进行分析并提出了解决方法。
结论：凝胶法细菌内毒素检查法影响因素较多，存在的问题仍需多方努力进行克服。
[关键词] 凝胶法环境内毒素鲎试剂问题Some commonly encountered problems and Solution methods on Gel-clot bacterial endotoxins testCHEN Bang-shu（Guangxi zhuang Autonomous Region Institute for Drug Control ，Nanning 530021）[Key words] Gel-clot; natural bacterial endotoxins; TAL; problems细菌内毒素检查法的优越性已为大多数质检人员所体会和认识。
但在实际工作中，也有一些问题使实验者感到困惑。
因此，作者认为有必要对这些问题提出并加以探讨，供大家参考。
1. 选择鲎试剂（TAL）的灵敏度值等于样品原液细菌内毒素限值进行试验是最佳方案吗？未必！选择TAL的灵敏度值等于样品原液细菌内毒素限值进行试验，无疑可节省对样品的稀释，但却不利于减少样品溶液对细菌内毒素试验干扰的可能性。
中国药典从1998年增补本[1] 开始的细菌内毒素检查法已增加了供试品阳性对照（PPC）管，如因样品溶液浓度较高而出现PPC管不凝的情况，会导致试验无效，结果“最佳方案”可能变成重试方案。
如今，国内TAL的制备技术得到了较大的发展，更高灵敏度（0.25 EU.ml -1 、0.125 EU.ml -1 、0.06 EU.ml -1 、0.03 EU.ml -1 ）的TAL供应已不成问题。
细菌内毒素检查常见干扰及消除
常见干扰及消除湛江安度斯生物有限公司2016年7月实验助手APP授权发布BET干扰的普遍性！70%！•一项对人用药品与鲎试验相容性的研究证实了干扰的影响范围，在所研究的品种中仅30%的药品可以不经任何处理直接进行BET；有97%的干扰问题可以通过稀释供试品的方法去消除。
2干扰的表现•凝胶法ChP（2015年）规定无干扰条件：当溶液A和溶液D的所有平行管都为阴性，并且系列溶液C的结果符合鲎试剂灵敏度复核试验要求时，试验方为有效。
当系列溶液B的结果符合鲎试剂灵敏度复核试验要求时，认为供试品在该浓度下无干扰作用。
3干扰的类型•抑制–供试品含有的内毒素浓度≥2倍检测试剂的灵敏度，但检测结果仍为阴性，称之为假阴性。
•增强–供试品含有的内毒素浓度低于检测试剂灵敏度的1/2，但检测结果仍为阳性，称之为假阳性。
4光度法的判断？无干扰可接受范围：50%≤回收率≤200%抑制：回收率＜50%增强：回收率＞200%550%200%无干扰增强抑制鲎试剂内毒素 二价阳离子浓度不足聚集高渗透压酶、酶抑制剂LAL-RM 脂质体吸附洗涤剂表面活性剂pH值干扰的因素！pH值的影响鲎试剂中的酶需要在 pH值6~8的范围内才能正常反应，极端的pH环境影响酶的活性，造成抑制一般来说鲎试剂配方中都添加了缓冲剂以帮助样品的pH值的调节，但这不足以解决所有样品的pH问题测定以1:1为比例混合的样品稀释液+鲎试剂的pH值 以获得准确的pH值7解决有关pH的问题1•用BET水对供试品在允许的范围内进行稀释2•用缓冲液制备供试品3•用酸、碱或缓冲液来调节pH8二价阳离子浓度不足Mg2+离子是鲎试剂重要的辅因子，没有Mg2+离子，内毒素将无法激活鲎试剂的酶。
供试品中的螯合剂成分会螯合试剂中的二价阳离子（如Mg2+离子），造成抑制常见的螯合剂有：EDTA、柠檬酸钠、肝素钠、喹诺酮类药物等9解决二价阳离子浓度不足问题1•用BET水对供试品在允许的范围内进行稀释2•使用含Mg 2+或Ca 2+离子的稀释剂稀释样品，降低活性螯合剂含量3•注意过高的二价阳离子（如Ca 2+）浓度可能会带来抑制10高渗透压问题较高浓度的糖或者盐通常会抑制鲎试剂反应，如50%葡萄糖或5%氯化钠溶液。
内毒素的检测和去除
内毒素的检测和去除1 内毒素及其来源1.1内毒素内毒素（endotoxin）是存在于革兰氏阴性菌细胞壁外膜表面的一种大分子物质，一般只有在细胞死亡或分解时自行释放到周围介质中，特殊条件下也可以从活细胞中直接泄漏出来。
内毒素又被称为热原，是一种脂多糖物质，具有耐热性，不易被去除。
若疫苗中存在一定浓度的内毒素，接种动物后，可引起动物发热，休克等，严重时甚至造成死亡。
1.2内毒素的来源因为革兰氏阴性菌无处不在，所以内毒素几乎存在于任何地方。
在疫苗生产中一定要重视和尽可能减少内毒素的污染。
生产用水中内毒素的含量是导致疫苗安全性的关键因素之一。
大量研究表明，疫苗生产过程中内毒素主要来源于培养液和配制用水，其在贮存过程中易受到革兰氏阴性菌的污染。
贮水罐，纯水系统的过滤器和连接管道，以及培养液容器等都可能受到革兰氏阴性菌的污染。
工作人员进出车间携带的物品，以及空气净化系统久不维护，都有可能造成生产车间内的空气尘埃浓度升高，导致内毒素污染。
生产用具、管道、泵、阀门、滤器等的清洗消毒不彻底也会造成内毒素污染。
生产原料的污染，如血液制品，细胞培养基。
人为操作不规范也会引起内毒素污染。
2内毒素的检测目前，内毒素的检测方法较多，但是各存在利弊，因此，选取检测方法要根据实际需求，不建议采取单一的检测方法。
2.1鲎试验法鲎试验法是通过酶的级联反应而实现，内毒素在二价阳离子的参与下激活C因子（FC），然后激活其它酶原，产生一系列凝集酶反应。
该方法是目前检测内毒素最特异和最灵敏的方法。
2.2重组C因子法重组C因子法是使用一个单一的蛋白（重组C因子）作为有效活性成分。
反应中内毒素激活重组C因子，活化的重组C因子将荧光底物裂解，产生荧光复合物，定量检测荧光复合物来量化内毒素。
这种方法可有效避免假阳性的产生。
该方法可用于药品生产，环境，器械生产中的内毒素检测。
2.3热原试验法该方法是比较广泛的检测热原的方法，利用微量内毒素可引起动物体温升高的特性来测试其含量。
内毒素的检测方法及去除方法。
一、热原的性质及除去热原的方法
1．高温法
热原的耐热性能良好，60℃加热1h不被分解破坏，100℃不降解，但180℃3～4h、200℃60min、金属制品、生产过程中所用的容器和其它用具以及注射时使用的注射器等，均可采用此法破坏热原。但在通常使用的注射剂热压灭菌条件下不足以破坏热原。
6．其它
包括离子交换法、凝胶滤过法、反渗透法等。
二、热原的检查方法
《中国药典》2005年版规定热原检查采用家兔法，细菌内毒素检查采用鲎试剂法。
1．热原检查法
由于家兔对热原的反应与人基本相似，目前家兔法仍为各国药典规定的检查热原的法定方法。
《中国药典》2005年版规定的热原检查法系将一定剂量的供试品，静脉注入家兔体内，在规定时间内，观察家兔体温升高的情况，以判定供试品中所含热原的限度是否符合规定。检查结果的准确性和一致性取决于试验动物的状况、试验室条件和操作的规范性。家兔法检测内毒素的灵敏度为0.001μg/ml,试验结果接近人体真实情况，但操作繁琐费时，不能用于注射剂生产过程中的质量监控，且不适用于放射性药物、肿瘤抑制剂等细胞毒性药物制剂。
2．吸附法
热原在水溶液中可被活性炭、石棉、白陶土等吸附而除去。由于活性炭性质稳定、吸附性强兼具助滤和脱色作用，故广泛用于注射剂生产，但应注意吸附药液所造成的主药的损失。
3．超滤法
热原分子量为1×106左右，体积较小，约1～5nm，可以通过一般滤器和微孔滤膜，但采用超滤法如用3.0～15nm超滤膜可将其除去。
2．细菌内毒素检查法
细菌内毒素检查法系利用鲎试剂来检测或量化由革兰阴性菌产生的细菌内
毒素，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法．细菌内毒素的量用内毒素单位（EU）表示。
凝胶法细菌内毒素检查及干扰综述
凝胶法细菌内毒素检查及干扰综述细菌内毒素是革兰氏阴性细菌的细胞壁组分之一，当细菌死亡或自溶后便会释放出内毒素。
凝胶法测定细菌内毒素，作为《中国药典》的“仲裁”方法，具有简单、经济、快速等特点，已成为细菌内毒素检查的常用方法。
但是凝胶法是一种基于鲎试剂中的多个酶蛋白在模拟的生理环境下进行的反应，反应过程中会受到各种干扰因素的影响。
1.凝胶法细菌内毒素的检查1.1细菌内毒素标准溶液的制备取标准品一支，轻弹瓶壁，使粉末落入瓶底，然后用砂轮在瓶颈上部轻轻划痕，75%酒精棉球擦拭后开启，开启过程中注意防止玻璃碎屑落入瓶内。
按照标准品说明书，加入规定量的细菌内毒素检查用水溶解内溶物，用封口膜将瓶口封严，置旋涡混合器上混合15分钟。
然后进行稀释，制备成对应浓度的细菌内毒素标准品溶液。
1.2加入样品取0.1ml/支的鲎试剂8支，轻弹瓶壁，使粉末落入瓶底，用砂轮在瓶颈轻轻划痕，75%酒精棉球擦拭后开启，防止玻璃碎屑落入瓶内。
八支鲎试剂每两支分为一组，第一组每支加入0.2ml检查用水溶解，作为阴性对照，第二组每支先加入0.1ml检查用水溶解，后加入制备好的标准品溶液0.1ml，作为阳性对照。
第三组每支先加入0.1ml检查用水溶解，后加入0.1ml的样品溶液。
第四组每支先加入0.1ml的样品溶液，后加入制备好的标准品溶液0.1ml。
最后分别轻轻转动瓶壁，使内容物充分溶解，避免产生气泡。
1.3孵育加样结束后，将鲎试剂用封口膜封口，轻轻振动混匀，避免产生气泡，放入37℃±1℃恒温器中，确保安瓿瓶放入底部，保温60±2分钟。
1.4判断结果观察并记录结果。
将安瓿瓶从恒温器中轻轻取出，避免振动，每管缓缓倒转180°观察，2，4组管内形成凝胶，并且凝胶不变形，不从管壁滑脱，为阳性，1，3组未形成凝胶或形成的凝胶不坚实、变形并能从管壁滑脱，为阴性。
表明该样品内毒素合格。
2.凝胶法干扰因素2.1 鲎试剂的干扰因素2.1.1PH值的影响鲎试剂与内毒素的反应是一个复杂的酶促反应，鲎试剂中的酶要求PH值在6-8的范围内才能正常反应，极端的PH环境会影响酶的活性。
细菌内毒素检查 (干扰试验)
细菌内毒素检查
3.干扰试验
3.1将供试品稀释至预试验中确定的不干扰稀释倍数。
3.2再用此稀释液将同一支细菌内毒素标准品稀释制成4个浓度，2λ，1λ，0.5λ，0.25λ
的含内毒素的供试品溶液。
标准品：10EU→1EU/ml→0.5EU/ml→0.25EU/ml→0.125EU/ml
供试品溶液的稀释：
2λ1λ0.5λ0.25λNC（加检查用水）○○○○
○○○○○
○○○○
○○○○○
供试品阳性对照：
2λ1λ0.5λ0.25λNC（加供试品溶液）○○○○
○○○○○
○○○○
○○○○○
3.3前提：1）当两组最大浓度2λ，均显“+”；最低浓度0.25λ，均显“—”，
阴性对照管（NC），均显“—”，结果方为可靠，有效。
2）内毒素检查用水制成的标准溶液的反应终点浓度的几何平均值（E S）
E S=lg-1（∑Xs/4）Xs,X t——反应终点浓度的对数值。
E t=lg-1（∑X t/4）E S，E t——反应终点浓度的几何平均值。
当E S∈[0.5λ,2λ],E t∈[0.5E S,2E S]则认为供试品在该浓度下不干扰试验，
可在该浓度下对供试品进行试验。
注：建立新品种的细菌内毒素检查方法，每个厂家至少取3个批号（不包括亚批）的供试品，用2个以上的鲎试剂生产厂家的鲎试剂进
行干扰试验。
浅析细菌内毒素检查法的干扰因素
［ 摘
要 ］ 细菌 内毒素检 查法具有 景 作简 望 、 属性 强、 专 灵敏 度高 、 验 结果 易争 等优 点． 得 试 获
厂 泛应用 。本 文对干扰 细菌 内毒 素试验 的 因豪避｜ 亍了探 讨， 对如／ 排 除这些 千扰 固素进行 了舟 绍。 可 ［ 关键词 ］ 细 菌内毒 素噎 查 法 ； 菌 匈毒 素 ； 细 鲎试剂 ： 干扰 固素 细菌 内毒 素检 查法 （ Ｅ 是以堂 试 剂 （ ＡＩ 检 Ｂ Ｔ） Ｌ ） 测 供 试 品 中 存 在 细 菌 内 毒 素 （ Ｅ） 试 验 ， Ｅ 在 Ｂ 的 Ｂ ｃ 、 的参 与下 ， 先激活 Ｉ ａ Ｍｇ 首 ＡＬ中凝 固酶 系统 的 Ｃ因子 等， 终 将 凝 固 蛋 白原 变成 凝 固 蛋 白， 最 来 判断 Ｂ Ｅ的 限量是 否符合 要 求。Ｂ Ｔ法 较 热 原检杳 Ｅ 法 （ Ｔ） Ｐ 有着操 作简单 、 属性 强 、 专 灵敏 度高 、 验结 试 ｌ Ｌ的质 量如 灵敏 度 、 Ａ 自身凝 集 、 冲容量 、 缓 稳 定性 、 ・ 等 都 直接 影 响检 测结 果 。不 同厂家 生 均 性 产 的 同批 号 的 Ｌ ＡＬ质 量也不 相 同， 灵敏 度差 异也 较大 ～ 国内生产 的 Ｌ Ｌ系 鲎科 动 物 东方 堂 的 血 液 Ａ 变形 细胞溶 解 物 的无 菌 冻 干 品，Ａ Ｌ冻 干 时 ， 顽 Ｉ 常 加入 支持剂 （ 如甘 露醇 等 ）经 检测 可使 Ｉ ， ＡＬ的 活 陛 及稳 定性 下降 ， 明不 加支 持剂 的 Ｌ 证 ＡＬ的稳 定性更
剂清 洗 后， 应反 复 冲洗 干 净， 免 残 留的 Ｂ 避 Ｅ。如玻 璃容 器预在 ２ ０ 消毒 至少 ｌ ５Ｃ ｈ或 １ ０ ｈ ８ ℃２ 。采样 用 注射器 及 吸管 应 有 良好 的 精 密度 ， 璃 容 器 质量 应 玻 选 用耐酸 、 的硬 质 玻璃 ， 管 、 碱 胶 胶塞 应 使 用优 质 医 田产品。操 作 人员在试验 过 程 中勿大声讲 话和 急速 行动 ， 防止 尘埃 和唾液溅 入检 品 中。 ２ 鲎试 剂 的影响
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BET干扰的普遍性
一项对人用药品与鲎试验相容性的研究证实了干扰 的影响范围，在所研究的品种中仅30%的药品可以 不经任何处理直接进行BET；有97%的干扰问题可 以通过稀释供试品的方法去消除。
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解决方法
湛江安度斯公司的TAL可以抵抗一般水平的β-葡聚糖干扰。 用湛江安度斯公司的抗增液复溶鲎试剂可以消除（1-3）β-D葡聚糖
的干扰。
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E3.0
NC E0.03 E0.3
每个浓度的标准内毒素溶液分别与抗增液复溶的 鲎试剂及BET水复溶的鲎试剂反应
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2019/12/30抑制的来源 由内毒素激活的酶反应受抑制
pH值不适宜 二价阳离子不足 酶的改良及活性不足
内毒素损耗
吸附 损耗
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抑制的鲎解试验决的办正法常反应需要中性的pH值、一定浓度的钠离子及二
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增强 的来源来源和解决方法
β-葡聚糖是造成鲎试剂结果假阳性的一个已知来源。 美国药典BET法的要求： “除了内毒素，鲎试剂还与某些β-葡聚糖反应。一些经特殊制备的 鲎试剂不会与β-葡聚糖反应，应使用这种鲎试剂检测含β葡聚糖的样 品”
价阳离子； 用BET水稀释供试品可以解决绝大多数的抑制
pH值
鲎试验的反应混合液（TAL+供试品）的pH值应在6~8范围内 用BET水在容许范围对供试品进行稀释 用缓冲液制备样品稀释液 用酸、碱或缓冲液来调节pH
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＋ ＋
－ －
数1 2
＋ ＋
＋ ＋
＋ ＋
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平行 3 4 管
＋ ＋
SE2λ
＋
＋
＋
＋
溶SE液λ B（EStE）½λ
－ －
SE¼λ
平行 3 4 管
＋ ＋
SE2λ
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溶SE液λ B（EStE）½λ
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SE¼λ
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3
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4
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－
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0.1Mg/ml葡聚糖（抗增液）
0.1Mg/ml葡聚糖 +E0.3（抗增液）
0.1Mg/ml葡聚糖
0.1Mg/ml葡聚糖 +E0.3
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－
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＋
＋
－
出现表b或表c的极端情况均为不适宜的实验结果，需要检查实验条件。
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干扰的类型
抑制
供试品含有的内毒素浓度≥2倍检测试剂的灵敏度，但检测结 果仍为阴性，称之为假阴性
增强
供试品含有的内毒素浓度低于检测试剂灵敏度的1/2，但检 测结果仍为阳性，称之为假阳性
0.1Mg/ml葡聚糖出现明 显的增强
0.1Mg/ml葡聚糖（抗 增液）不存在干扰
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＋
0.5λ ≤ Es ≤ 2λ；0.5λ ≤ Et ≤ 2λ
光度法
CP、USP规定无干扰条件：
2 3 平4 行
＋ ＋
＋
50% ≤ R ≤ 200% FDA规定无干扰条件：
管数 1 2
SE2λ ＋ ＋
50% ≤ R ≤ 150%
3
＋
4
＋
溶λ液C（E½s）λ
＋
－
＋
－
＋
－
＋
－
S溶E液λ B（EStE）½λ
干扰凝的胶法表现
最理想的无干扰状 况
FDA的鲎试验指南中规定，同一标准内毒素的阳性对照与阳性样品对
照系列的反应终点存在显著差异时，即可确定为存在干扰。
CP2005规定无干扰条件： 表平a行
0.5λ≤Es ≤ 2λ；0.5Es ≤ Et ≤ 2Es 管数
2λ
USP27规定无干扰条件：
1
＋
－
＋
－
＋
－
＋
－
¼λ － － － －
SE¼λ － － － －
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表平b
不符合CP要求，但 符合USP要求
符合CP要求，但不 符合USP要求
表平c
行 管
2λ
溶λ液C（E½s）λ
¼λ
行 管
2λ
溶λ液C（E½s）λ
¼λ
数1 2
＋ ＋
＋ ＋
二价阳离子
在含有鳌合剂的样品制备中使用MgSO4或CaCl2缓冲剂可维 持Ca++、Mg++离子的浓度
蛋白和酶的改良
血浆和血清中的丝氨酸蛋白酶可经加热处理使其变性； 某些蛋白的变性或酶的抑制原料需要用超滤方法去除
内毒素损耗
在标准内毒素制备及使用过程，需要经常旋涡混合其溶液 避免使用对标准内毒素有吸附作用的实验器具