最新食品微生物检验方法

食品微生物检验方法（FDA与ISO对比）

内容提要：

●菌落总数检测

●大肠菌群及大肠杆菌检测

●金黄色葡萄球菌检测

●沙门氏菌检测

●单核细胞增生李斯特氏菌检测

菌落总数测定——菌落总数的概念

●菌落总数是指在被检样品的单位重量（g）、容积（ml）或表面积（cm2）内，所含能于某种固体培养基上，在一定条件下培养后所生成的菌落的总数。

菌落总数测定——卫生学意义

●判定食品被细菌污染的程度及卫生质量。

●及时反映食品加工过程是否符合卫生要求，为被检食品卫生学评价提供依据。

●通常认为，食品中细菌数量越多，则可考虑致病菌污染的可能性越大，菌落总数的多少在一定程度上标志着食品卫生质量的优劣。

FDA BAM 菌落总数测定流程

检样xg/mL+9xml稀释液（磷酸盐缓冲液）

适当十倍稀释样品

选择2~3个连续适宜稀释度

各取1mL分别加入灭菌平皿内

（每个稀释度做两个平行）

每皿内加入适量平板计数琼脂（PCA）

35 ℃48 ±2h

菌落计数

FDA BAM 菌落计数方法

●选择25~250CFU之间的菌落进行计数，计算公式如下：N=∑C/（1*n1+0.1*n2）*d

●所有平板的菌落数都不足25CFU，报告EAPC/ml（g）为＜25*1/d。EAPC：estimated aerobic plate count

●所有平板的菌落数都超过250CFU，但不足100/cm2，报告EAPC/ml（g）为最接近250CFU的平板菌落数的估计值，乘以相应的稀释度。

●所有平板的菌落数都超过100/cm2，计算平板的面积（直径为90mm的平板面积为65cm2），估计最高稀释度每cm2的菌落数，乘以相应平板面积作为该稀释度的菌落计数结果，报告EAPC/ml （g）为＞65*100* 1/d。

●无法计数的平板报告LA（Laboratory Accident）。

●最终结果保留前两位有效数字。按照4舍6入，5是奇进偶不进。

ISO4833-2003 菌落总数测定流程

检样xg/mL+9xml稀释液（磷酸盐缓冲液）

适当十倍稀释样品

选择2~3个连续适宜稀释度

各取1mL分别加入灭菌平皿内

（每个稀释度做两个平行）

每皿内加入适量（12~15mL）

平板计数琼脂（PCA），

30±1 ℃，72 ±3 h

ISO4833-2003菌落计数方法

●选择连续2个稀释度不超过300CFU的平板，且一个平板至少含15CFU进行计数，计算公式如下：N=∑C/（n1+0.1*n2）*d

●所有平板的菌落数都不足15CFU，计算2平板菌落的算术平均值m，液体样品：N E=m 固体样品：N E=m×d-1

●无菌生长：液体样品：less than 1; 固体样品：less than 1 ×d-1

●最终结果保留前两位有效数字。

菌落总数测定几点说明

●由于检样中采用30/35℃有氧条件下培养，因而并不是样品中实际的总活菌数，一些特殊营养要求的细菌、厌氧菌、微需氧菌、以及非嗜中温细菌，均难以反映出来。

●鉴于食品检样中的细菌细胞是以单个、成双、链状、葡萄状或成堆的形式存在，因而在平板上出现的菌落可以来源于细胞块，也可以来源于单个细胞，因而平板上所得菌落的数字不应报告活菌数，而应以单位重量、容积或表面积内的菌落数或菌落形成单位（colony forming units，CFU）报告。

菌落总数测定几点要求

●每个样品从开始稀释到倾注最后一个平皿所用的时间不得超过15min，主要为防止细菌增殖和产生片状菌落。样液与琼脂应充分混合，避免将混合物溅到平皿壁和皿盖上。皿内琼脂凝固后，不要长时间放置，然后倒置培养，可避免菌落蔓延生长。

●检样过程中应用稀释剂做空白对照，用以判定稀释液、培养基、平皿或吸管可能存在的污染。同时，检样过程中应在工作台上打开一块空白平板计数琼脂，其暴露时间应与检样时间相当，以了解检样在检验操作过程中有无受到来自空气的污染。

●检样稀释液有时带有食品颗粒，为避免与细菌菌落发生混淆，可作一检样稀释液与平板计数琼脂混合的平皿，不经培养，于4 ℃放置，以便在计数检样时用作对照。

大肠菌群的定义

●大肠菌群系指一群能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。

●大肠菌群不是细菌学上的分类命名，而是根据卫生学方面的要求，提出的与粪便污染有关的细菌，即作为食品、水体等是否受过人畜粪便污染的指示菌，这些细菌在生化及血清学方面并非完全一致。根据进一步的生化试验，可将这群细菌再分为大肠艾希氏菌（俗称大肠杆菌）、弗氏柠檬酸杆菌、肺炎克雷伯氏菌和阴沟肠杆菌等。

大肠杆菌的定义

●大肠杆菌（也称大肠埃希氏菌），分类于肠杆菌科，归属于埃希氏菌属。

●大肠杆菌指革兰氏阴性无芽孢杆菌、乳糖发酵产酸产气、IMViC试验（靛基质、MR、V-P、柠檬酸盐试验）为++--或-+--的细菌。

●与人类有关的大肠杆菌统称为致泻性大肠杆菌，包括五种：肠毒素性大肠杆菌（ETEC）、致病性大肠杆菌（EPEC）、出血性大肠杆菌（EHEC）、侵袭性大肠杆菌（EIEC）、黏附性大肠杆菌（EAEC）。

卫生学意义

●大肠菌群和大肠杆菌是评价卫生质量的重要指标，作为食品中的粪便污染指标。

●食品中检出大肠菌群，表明该食品有粪便污染，既可能有肠道致病菌存在，因而也就有可能通过污染的食品引起肠道传染病的流行。大肠菌群数的高低，表明了粪便污染的程度，也反映了对人体健康危害性的大小。

●大肠杆菌在外界存活时间与一些主要肠道致病菌接近，它的出现预示着某些肠道病原菌的存在，因此该菌是国际上公认的卫生监测指示菌。近年来，有些国家在执行HACCP管理中，将大肠杆菌检测作为微生物污染状况的监测指标和HACCP实施效果的评估指标。

大肠杆菌的生物学特性

基本形态：

此菌为两端钝圆的短小杆菌，一般约0.5-0.8μm*1.0-3.0 μm，多单独存在或成双，但不呈长链排列。约50%的菌株有周生鞭毛，但多数只有1-4根，一般不超过10根，故菌体动力弱。多数菌株有菌毛，有的有荚膜或微荚膜，不形成芽孢，对普通碱性染料着色良好，革兰氏染色阴性。

培养特性：

●大肠杆菌合成代谢能力强，在含无机盐、铵盐、葡萄糖的普通培养基上生长良好。最适生长温度为37℃，在42-44 ℃条件下仍能生长，生长温度范围15-46 ℃。