G筛选稳定表达细胞系经验总结图文稿

G筛选稳定表达细胞系

经验总结

Company number【1089WT-1898YT-1W8CB-9UUT-92108】

G418筛选稳定表达细胞系经验总结

我做了稳定转染，从G418浓度确定到最后的单化鉴定。有自己的体会也有其他战友遇到的情况,和大家分享.没有总结好的地方，大家补充。

筛选之前确定G418浓度：

1、由于每种细胞对G418的敏感性不同，而且不同的厂家生产的G418有效成分的比重不同，一般1g的粉剂中有效的G418含量大约为0.722g。

2、G418是新霉素的类似物，两者都是通过抑制核糖体的功能和蛋白质的合成而杀死细胞的。但是新霉素对真核细胞无作用而G418对细菌和真核细胞都起作用。neo就是编码3‘磷酸转移酶的基因，它表达的蛋白能够分解新霉素G418。在进行转染时细胞膜受到影响，抗生素可能对细胞产生较大影响，加上G418有杀菌作用，所以有人主张转转染时不加其它抗生素。

3、汇合度对G418筛选结果的影响很大，一般筛选时汇合度不宜超过50%

4，G418的活性不尽相同，所以在筛选之前，一定要确定G418的最佳筛选浓度。具体如下：将细胞稀释到1000个细胞/ml，在100ug/ml~1mg/ml的G418浓度范围内进行筛选，选择出在10~14天内使细胞全部死亡的最低G418浓度来进行下一步的筛选试验。一个具体试验：3x106个细胞电转后，分别接种1/4000，1/1000，1/300细胞到24孔板中，48h后加药筛选，此时1/300细胞孔内大约50%汇合度。理论上1/4000孔内应有4%的汇合度。筛选9天后，观察1/4000孔内有两三个，按比例1/300孔内应该有几十个，事实上，它们几乎全死光了，只有几个。

加药时间和维持浓度

1，由于基因转染到细胞内之后要一段时间才能表达出蛋白质。所以筛选不能太早；但是也不能太晚，因为转染了外源基因的细胞代谢负荷较大，增值较慢，时间长了就会被没有外源基因转入的细胞所淹没，最终导致筛选不出阳性，一般要在转染24小时之后才开始加G418筛选。随着细胞的代谢G418的浓度和活性都会下降，所以每3~5天都要更换一次含有G418的筛选液。这时药物浓度可以降至200ug/ml。

2，加抗生素的时机，主要是考虑插入到细胞的抗性基因是否已经得到表达。一般是转染48小时后加入抗生素。挑出单后就可以用维持浓度，一般是筛选浓度的1/2。

关于维持浓度，有人说细胞会出现对抗生素的抗性，应不断提高其浓度。而且，如果你要挑选到几个阳性克隆中较高表达的的话，可以调整抗生素的浓度。当然，抗性基因高表达，目的基因不一定就跟着高表达。

筛选时的培养液

加药筛选约6天左右，细胞会大量死亡，孔中只剩下的细胞寥寥无几。这时会出现两个问题：

1，死亡的细胞会裂解释放出有害物质，导致那些有neo表达的阳性细胞死亡，即非选择性死亡，因此要及时换液

2，孔中细胞数目很少，细胞之间的信号会变得很弱，也会导致阳性细胞的状态不佳甚至死亡。这个时候需要一种特殊的培养液：假如你要转染3T3细胞，在3T3细胞汇合度达到80%的时候，换液，培养过夜之后收集培养液，通过滤器消

毒，和新鲜的培养液按1：1混合备用。再转染后筛选过程中就可以应用这种培养基。

3，适当增加血清浓度。

筛选时出现的问题及其解决办法：

1，问题1。做hela细胞的筛选，现在已经筛选3周，在6孔板中已经长出一些细胞簇，想把它挑到96孔板中，就用2ul胰酶消化，在消化过程中，胰酶扩散，细胞已经四散开，和周围的其它细胞簇融合在一起（我的细胞簇离的很近），就是说几个细胞簇被胰酶融合在一起，那样根本没有办法做下去了，该怎么办？

a、可以减少胰酶量；胰酶在加入之前要用37度温箱预热，并且PBS润洗细胞层，以减少可能残存的血清的影响；

b、加入胰酶后，稍过几秒钟就可以吸走消化液了，不用吸干净，然后放到37度温箱中继续作用1MIN，这时，消化酶可以继续作用的，又可避免胰酶扩散；

c、显微镜下观察细胞完全松散开，就可以在你感兴趣的局部加培养基，并吸走你的可隆了呀

d、具体消化的时间，你注意摸索一下，如果在步骤2中显微镜下见细胞尚未完全松散开，可以再重复的，直到松散开，能够被吸走为止。

我的建议：1、在100mmdish中挑克隆，细胞分的稀一点。2、把细胞全部消化下来，在96孔板中逐步稀释获得单

2，问题2。筛选成功的概率：只要有抗性加压筛选，挑选到的机率还是比较大的。一般能挑到稳定表达的概率我认为大概有70－80％，但是想挑到表达量高

且能稳定表达的，不大容易。这个可能是在染色体上，合适的整合位点太少的缘故。

3，问题3。细胞形态的改变：稳定转染后阳性均出现不同程度的细胞形态的改变。

想请教各位有经验的高手，你们做稳定转染时有此发现吗？我的也是，而且好象还有好几种不同类型的细胞。不过，我转的是一种抑癌基因。

4，问题4。单克隆化的时机和个数：加药筛选时,一般等到确认的转染细胞长到70%以上时,再做有限稀释法,以克隆出阳性细胞,同时要保持适当的药物浓度,以防突变和污染。若细胞长好了,如有40%以上,就可以有限稀释了一般，筛选5，6个克隆就有需要的，但保险起见，筛10个吧。

5，从单化时开始，就要加大营养，清和生长因子。单化的操作方法；

1.方法1。单克隆细胞的培养就是这样的,我现在作了15个96孔板的单克隆,总共才得到大约50株单克隆在做时候应保证每个孔中的细胞是一个,因此,我一般在200毫升的培养液中加入小于96个的细胞,这样平均到每个孔中因该可以由满意的结果你所说的现象我也遇到过,我也百思不得其解,只好做多一点的96孔板来补充。培养SPC-A1（人肺癌细胞），转染了EGFP，然后进行了G418抗性筛选和96孔板单筛选，最终获得了成功将我的实验步骤写出来，希望对你有所帮助。

2.方法2。实验步骤大致为：预先对96孔板除第一排之外的所有孔加含15%胎牛血清的液，0.1ml/孔，并放于箱中温育，然后胰酶消化稳定表达GFP的细胞，细胞液稀释至密度为1000cell/ml的单细胞悬浮液，上述细胞液接种于96孔板的第一排，0.2ml/孔，从中吸取0.1ml细胞溶液接种于第二排，混合后，