第三章 细胞的分离与破碎

细胞破碎的主要阻力来自细胞壁，破碎 率与微生物的种类和生长环境有关： 酵母细胞较细菌难破碎； 静止状态的细胞比快速生长状态的细胞 难破碎； 在复合培养基上培养的细胞较简单合成 培养基培养的细胞难破碎。 在工业规模中，酵母等难破碎的细胞及 高浓度的细胞，用多次循环破碎的方法。
不宜采用高压匀浆法破碎的细胞： 易造成堵塞的团状或丝状真菌； 较小的革兰氏阳性菌； 含有包含体的基因工程菌（包含体质地 坚硬，易损伤匀浆阀）。 在大规模操作中，高压匀浆机和珠磨机 是最常用的破碎机。一般，高压匀浆机最 适合于酵母和细菌，虽然珠磨机也可用于 酵母和细菌，但通常认为后者对真菌菌丝 和藻类更合适。
珠磨机的主体一般是立式或卧式圆筒型腔体，由 电动机带动。磨腔内装钢珠或小玻璃珠以提高研磨 能力。一般，卧式破碎效率比立式高，其原因是立 式机中向上流动的液体在某种程度上会使研磨珠流 态化，从而降低其研磨效率。
氧化锆珠
实验室规模：Mickle高速组织捣碎机和 Braum匀浆器。 中试规模：胶质磨 工业规模：高速珠磨机 破碎作用符合一级反应动力学，破碎程 度用细胞破碎率（%）或单位细胞释放的 内含物（mg/g）表示。
酵母和真菌由于细胞壁的组分和结构与 细菌明显不同，主要是纤维素、葡聚糖、 几丁质等，因此不能用溶菌酶裂解，常用 蜗牛酶、纤维素酶、多糖酶等，有时采用 几种酶的混合物会产生更好的效果。 植物细胞壁的主要成分是纤维素，常采 用纤维素酶和半纤维素酶裂解。
酵母细胞酶溶法 破碎：先用蛋白酶 打开Ⅰ层上的蛋白 质-甘露糖结构，使 两者溶解，裸露出 Ⅱ层，再用葡聚糖 酶作用葡聚糖层， 使原生质体露出， 这时改变缓冲液的 渗透压，即可使细 胞膜破裂，释放胞 内物质。
红面包霉菌的细胞壁具有 同心圆层状结构，主要存在 三种聚合物：葡聚糖、几丁 质（以微纤维状态存在）以 及糖蛋白。 最外层a是葡聚糖；第2层 b是糖蛋白的网状结构，葡聚 糖与糖蛋白结合起来；第3层 c主要是蛋白质；最内层d主 要是几丁质，几丁质的微纤 维嵌入蛋白质结构中。
4、细胞壁结构和细胞破碎 （1）微生物细胞壁的形状和强度取决于细 胞壁的组成、细胞壁组成物质的交链程度。 细胞破碎的主要阻力来自连接细胞壁网状 结构的共价键。 （2）在机械破碎中，细胞的大小、形状、 细胞壁厚度和聚合物的交链程度是影响破碎 的重要因素。 （3）在酶法和化学法中，细胞壁的组成是 主要因素，其次是细胞壁的结构。
11%~22%
5%~10%
图革 兰 氏 阳 性 菌 酵母菌细胞壁由特殊的酵母纤维素构成，其主 要成分是葡聚糖（30-34%）、甘露聚糖（30%）、 蛋白质（6%-8%）和脂类。 酵母细胞壁结构可分成三层：最里层葡聚糖层， 构成细胞壁的刚性结构，使细胞具有一定的形状； 最外层是甘露聚糖层；葡聚糖层和甘露聚糖层依靠 处于中间层的蛋白质交链在一起，形成网状结构。 酵母细胞壁破碎的主要阻力取决于壁结构交链 的紧密程度和壁的厚度。
第三章
第一节 第二节 第三节
细胞的分离与破碎
细胞壁的组成与结构 常用破碎方法 破碎率的测定与破碎技术的 研究方向
基本要求： 了解细胞壁的组成与结构和常用破碎方 法及破碎技术的研究方向，掌握破碎率的 测定方法。 重点： 细胞壁的组成与结构；细胞壁结构与细 胞破碎；常用破碎方法；破碎率的测定。
微生物的代谢产物可以分成两类：胞内 产物和胞外产物（多数）。 胞外产物：分泌到细胞外的代谢产物。 如大多数小分子代谢产物、细菌产生的碱 性蛋白酶、霉菌产生的糖化酶等。 胞内产物：微生物分泌并在细胞内累积 的代谢产物。如大多数酶蛋白、类脂、部 分抗生素、基因工程产品（胰岛素、干扰 素、白细胞介素-2等）。
第二节
细胞的破碎
细胞破碎是指利用物理、化学、酶 或机械的方法来破坏细胞壁或细胞膜 的过程。 细胞破碎的目的是破坏细胞外围使 胞内物质释放出来。微生物的外围通 常包括细胞壁和细胞膜。
细胞壁：为细胞外壁，具有固定细胞外 形和保护细胞免受机械损伤或渗透压破坏 的功能。 细胞膜：为细胞内壁，是一层具有高度 选择性的半透膜，控制细胞内外一些物质 的交换渗透作用。 细胞破碎的主要阻力来自细胞壁，不同 类型的微生物、处于不同生长时期的同一 种微生物，细胞壁的结构特性是不同的， 取决于遗传和环境因素。
2、高压匀浆法 (High-pressure homogenization)（液体剪 切方法 ） 高压匀浆法是大规模细胞破碎的常用方 法，所用的设备是高压匀浆器，由高压泵和 匀浆阀组成。 其工作原理：利用高压使细胞悬浮液通 过针形阀，由于突然减压和高速冲击撞击环， 使细胞破裂。
它有一个高压泵和一个可调节放料速度的 针形阀，通过阀门时会产生高剪切应力。
（1）外加酶法 常用的溶酶： 溶菌酶（lysozyme）； β-1，3葡聚糖酶（glucanase）； β-1，6葡聚糖酶； 蛋白酶（protease）； 肽链内切酶（endopeptidase）； 甘露糖酶（mannanase） 糖苷酶等。
细胞壁溶解酶由多种酶组成。 单一酶不易降解细胞壁，需要选择适宜 的酶及酶反应系统，确定特定的反应条件， 并结合其他的处理方法。如辐照、加入高 浓度盐及金属整合剂EDTA，或利用生物因 素促使生物对酶解作用敏感等。 溶酶具有高度专一性，使用时要根据细 胞壁结构和化学组成选择适当的酶，并确 定相应的次序。
3、超声破碎(Ultrasonication)（液相剪切 破碎法） 在高强度声能输入下可以进行细胞破 碎，其工作原理可能和空化现象引起的冲 击波和剪切力有关， 空化现象是在超强声波作用下，气泡 形成、长大和破碎的现象。 通常采用声频在15-25kHz的超声破碎 机。
超声波处理菌体细胞的效果：杆菌易于 球菌，革兰氏阴性菌易于革兰氏阳性菌， 对酵母菌效果差。 超声波破碎适合小规模细胞破壁，实验 室。大规模易导致敏感活性物质失活。 破壁时升温快，靠预加冰块或夹套冷却 控温。
溶菌酶能专一性地分解细胞壁上肽聚糖分子 的β-l，4糖苷键，因此主要用于细菌类细胞壁的 裂解。 但对于革兰氏阴性菌，单独采用溶菌酶无效果， 必须与鳌合剂EDTA一起使用。因为革兰氏阴性 菌结构中肽聚糖含量少，并处于细胞壁内层，外 表面含有大量脂类（脂蛋白、脂多糖），而脂多 糖层需钙镁离子才能维持稳定性，故需利用 EDTA除去钙镁离子，使脂多糖分子脱落，外层 膜出现洞穴，溶菌酶才能发挥作用。
细菌也可用糖苷酶、N-乙酰胞壁酰-L-丙 氨酸酰胺酶和多肽酶的混合物，将加速肽 聚糖的溶解。在破碎革兰氏阴性菌时，为 了去除外部双层脂质需要用表面活性剂进 行须处理。
放线菌的细胞壁结构类似于革兰氏阳性 茵，以肽聚糖为主要成分，所以也能采用 溶菌酶。 对于某些种类放线菌，有时为了增强被 酶作用的敏感性，在菌丝体培养过程中， 添加适量抑制剂，如甘氨酸和蔗糖等，使 细胞壁容易溶解。
酵 母 细 胞 壁 的 结 构 示 意 图
30%
6%~8%
30%~34%
M—甘露聚糖 P —磷酸二酯键 G —葡聚糖
3、霉菌细胞壁 霉菌细胞壁主要由多糖（80-90%）组 成，其次含较少的蛋白质和脂类。 霉菌的多糖壁是由几丁质和葡聚糖构 成，几丁质的结构和纤维素很相似。 由于霉菌细胞壁中含几丁质或纤维素的 纤维状结构，其强度比细菌和酵母菌的细 胞壁有所提高。
一、细胞壁的组成与结构
1、细菌细胞壁 肽聚糖是细菌细胞壁的主要化学成份， 它是一个大分子复合体，由多糖链借短肽 交链而成。 细菌破碎的主要阻力来自肽聚糖的网 状结构，其网状结构的致密程度和强度取 决于多糖链上存在的肽键数量和其交链程 度，交链程度越大，网状结构越致密，破 碎难度越大。
革兰氏阴性菌细胞壁结构模式图
（二）非机械法 非机械方法很多，包括酶解、渗透压 冲击、冻结和融化、干燥法和化学法溶胞 等，其中酶法和化学法应用最广。 1、酶溶法(Enzymatic lysis) 酶溶法研究较广的方法。 工作原理：利用酶反应，分解细胞壁上 的特殊键，从而达到破壁的目的。 酶溶法分外加酶法和自溶法两种。
酶溶法的优点： （1）产品释放的选择性高； （2）抽提的速率和收率高； （3）产品的破坏最少； （4）酶解条件温和、对pH值和温度等外界条 件要求低； （5）细胞外形较完整、不残留细胞碎片； （6）胞内核酸等泄出量少、便于后步分离等。 酶溶法的不足： （1）是溶酶价格高，限制了大规模应用。 （2）酶溶法通用性差，不同菌种需选择不同的 酶，且不易确定最佳的溶解条件； （3）存在产物抑制现象，甘露糖对蛋白酶有抑 制作用，葡聚糖抑制葡聚糖酶。
细胞破碎动力学方程：
影响反应速率常数K的因素： 珠体直径：以细胞大小、浓度为选择依据； 珠体的装量要适中； 搅拌速度应适当：速度高，破碎率提高，能耗大； 操作温度：温度高，易破碎，控制在5~40℃，使 目的产物不受破坏； 细胞浓度； 料液性质
延长研磨时间、增加珠体量、提高搅拌 转速和操作温度等都可有效地提高细胞破 碎率。 高破碎率将大大增加能耗；温度升高； 大分子物质损失增加；细胞碎片较小，不 易分离。 珠磨法的破碎率一般控制在80%以下。
机械方法破碎细胞的缺点： ①需要高的能量并且产生高温和高的剪 切力，易使不稳定产品变性失活； ②被破碎的有机体或释放的产物是非专 一的，并且产生的碎片微粒的尺寸范围分 布大，大量细颗粒给分离带来了因难。 为减少机械方法的影响，采取在机械方 法破碎之前，先用非机械方法来削弱细胞 壁的强度或直接使细胞破碎。
二、细胞破碎的方法 细胞破碎方法按是否使用外力分为机械 法和非机械法。 机械法有：珠磨法、高压匀浆法、超声 破碎法、 X-press法等。 使用机械法时，机械能转为热量，温度 升高，多数情况下采用冷却措施。 非机械法有：酶溶法、化学法、物理法、 干燥法等。
高压匀浆器和 珠磨机在实验室 和工业上得到应 用；超声波法和 非机械法处在实 验室应用阶段。
高压匀浆法和珠磨法的比较： （1）高压匀浆法适合小批量，每次最少可处 理20mL，珠磨法最少需要85mL，只能得到50mL 的浆液。 （2）珠磨法兼具破碎和冷却，而高压匀浆法 只能间接冷却。 （3）珠磨法一次破碎效率高，高压匀浆法需 循环2-4次。 （4）珠磨法适用范围广，几乎所有的微生物 细胞都适用。高压匀浆不适合于丝状菌和有包含 体的工程菌。