酸性磷酸酶活性测定方法
实验四酸性磷酸酶Km及Vmax值测定
• 2、制作酶反应时间与产物生成量的关系曲线 • (目的：选取合适的反应时间)
管号
1
磷酸苯二钠 0.5
酶液
0.5
精确反应时间 3
碳酸钠溶液 2
酶液
－
Folin－酚溶液 0.5
加液程序表
2
3
4
5
6
0
0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
5
10 15
20
根据双倒数法计算出Km及Vmax
Vmax [S]
V=
Km + [S]
三、实验步骤：
• 1、豆芽中的酸性磷酸酶的粗提取 • 2、制作酶反应时间与产物生成量的关系曲线 • 3、制作酚标准曲线 • 4、[S]与V0关系实验 • 5、双倒数作图法计算Vmax和Km
blank
buffer substrate enzyme
25
2
2
2
2
22
－
－
－
－
－
0.5
0.5 0.5
0.5 0.5 0.5 0.5
35℃保温10分钟 Folin－酚溶液已稀释好！
注： 进行酶促反应时，注意预热，使所有的反应在同等条件下开始
• 3、制作酚标准曲线
• (目的：可从酚标准曲线上查出A680nm所相 当的酚含量,并计算出反应速度(用每分钟 产物生成量来表示)
1.5
2.5
1/[S]
A 680
phenol content (酚含量) V0 (μmole phenol per min) 1/ V
0
1、酚含量从酚标准曲线上查得 2、V0 反应初速率( μmol/min)为酚含量除以酶反应时间(15分钟)。 3、双倒数作图法计算Vmax和Km
土壤酶活性测定方法
土壤酸性磷酸酶活性的测定1．试剂配制(1)0.115M p-硝基苯磷酸钠溶液取10.67g p-硝基苯磷酸二钠（6HO,分子量为371.1），溶于pH4.5通用缓冲液中并稀释至2250ml.4摄氏度冰箱保存。
(2)通用缓冲液（pH4.5）（缓冲液久置会有沉淀）原液由以下成分组成:三羟甲基氨基甲烷12.1g顺丁烯二酸11.6g柠檬酸14g硼酸6.3g溶于500ml 1N NaOH（40g定容1L）中，加蒸馏水至1L。
取原液200 ml，再加入0.1N HCL 或浓HCL来调pH为4.5。
最后稀释至1L，即得。
(3)甲苯(4)0.5 mol/L Cacl2.2H2O溶液：36.75g Cacl2.2H2O定容500ml. (无水CaCl2: 11.1g定容200ml)(5)0.5 mol/L NaOH溶液：20g NaOH定容1L.2．测定步骤置于50ml三角瓶中，加4ml通用缓冲液（pH4.5）、0.25ml甲苯和1ml 0.115M p-硝基苯磷酸钠溶液,摇匀后，置于37℃恒温箱中1h。
培养结束后，加入1ml 0.5 mol/L氯化钙溶液和4ml 0.5 mol/L NaOH溶液，通过致密滤纸过滤到50ml容量瓶，用蒸馏水定容后在410nm处比色.3．计算方法土壤酸性磷酸酶的活性用单位时间内每克土中的对硝基苯酚的毫克数表示，W（mg·g-1·h-1）=M1/（m×t）式中：M1—标准曲线上查得样品中对硝基苯酚的质量（mg）；t —反应时间（h）；=1hm—样品土壤的重量（g）无土壤CK: 用1ml蒸馏水代替1g土壤；每批土样做2个；无基质CK: 用1ml蒸馏水代替1ml PNPP。
每个处理做1个。
标准曲线的制作：1）对硝基苯酚标液：1g对硝基苯酚定容1L，低温保存。
2）取标液0、1、2、3、4、5ml于0-6号硬质试管中，分别加pH6.5通用缓冲液4ml，Cacl2.2H2O 溶液1ml，NaOH溶液4ml，②混匀后，定量滤纸过滤到50ml容量瓶，定容后，再取各浓度标液1ml定容至50ml，以0号试管作为对照，在A410nm波长下测光吸收值，并记录光吸收值A410。
组织及血液酸性磷酸酶(ACP)活性检测试剂盒说明书 可见分光光度法
组织及血液酸性磷酸酶（ACP）活性检测试剂盒说明书可见分光光度法注意：正式测定前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。
货号：BC2130规格：50T/24S产品内容：提取液：液体30mL×1瓶，4℃保存。
试剂一：液体10mL×1瓶，4℃避光保存。
试剂二：液体10mL×1瓶，4℃避光保存。
试剂三：液体30mL×1瓶，4℃避光保存，变成蓝绿色不能使用。
标准品：液体1mL×1支，2μmol/mL酚标准液，4℃保存。
临用前蒸馏水稀释至0.5μmol/mL备用。
产品说明：ACP在酸性条件下催化磷酸单酯水解称无机磷酸，常见于巨噬细胞的溶酶体内。
ACP常用于前列腺癌的辅助诊断。
在酸性环境中，ACP催化磷酸苯二钠水解生成苯酚，苯酚与4-氨基安替比林和铁氰化钾反应生成红色亚醌衍生物，在510nm有特征光吸收；通过测定510nm吸光度增加速率，来计算ACP活性。
试验中所需的仪器和试剂：可见分光光度计、台式离心机、可调式移液器、1mL玻璃比色皿、冰和蒸馏水。
操作步骤：一、粗酶液提取：称取约0.1g组织，加提取液1mL充分研磨，4℃、10000rpm离心10min，取上清液待测。
血液可直接用于测定，如果浓度高的话，用提取液稀释。
二、测定步骤：1.分光光度计预热30min以上，调节波长到510nm，蒸馏水调零。
2.试剂一置于37℃水浴中预热30min以上。
试剂名称（μL）测定管对照管空白管标准管蒸馏水--100-0.5μmol/mL标准品---100上清液100---试剂一200200200200试剂二200200200200混匀后置于37℃水浴中保温15min试剂三600600600600上清液-100--混匀后于510nm测定吸光度，分别记为A测定管、A对照管、A空白管、A标准管。
三、ACP活性计算：1.按蛋白浓度计算活性单位定义：37℃中每毫克蛋白每分钟催化产生1μmol酚为一个酶活力单位。
土壤磷酸酶(酸性、中性和碱性磷酸酶
土壤磷酸酶测定（酸性、中性和碱性磷酸酶）1. 分析意义土壤有机磷转化受多种因子制约，尤其是磷酸酶的参与，可加速有机磷的脱磷速度。
在pH4-9的土壤中均有磷酸酶。
积累的磷酸酶对土壤磷素的有效性具有重要作用。
研究证明，磷酸酶与土壤碳、氮含量呈正相关，与有效磷含量及pH也有关。
磷酸酶活性是评价土壤磷素生物转化方向与强度的指标。
2. 试验原理Kroll等（1955）最早提出用苯基磷酸盐作基质，以酚的释放量表示磷酸酶活性。
测定磷酸酶主要根据酶促作用生成的有机基团量或无机磷量计算磷酸酶活性。
前一种通称为有机基团含量法，是目前较为常用的测定磷酸酶的方法。
后一种称为无机磷含量法。
研究证明，磷酸酶有三种最适pH：4-5，6-7和8-10。
所以，测定酸性、中性和碱性反应土壤的磷酸酶，要提供相应的pH缓冲液才能测出该土壤的磷酸酶最大活性。
测定磷酸酶常采用的pH缓冲体系有醋酸盐缓冲液（pH5.0-5.4），柠檬酸盐缓冲液（pH7.0），三羟甲基氨基甲烷缓冲液（pH7.0-8.5），硼酸缓冲液（pH9-10）。
测定磷酸酶时，用各种磷酸一酯作为基质。
常用的基质有苯磷酸二钠、酚酞磷酸钠、甘油磷酸钠、α或β萘酚磷酸钠、ρ-硝基苯磷酸钠等。
3. 试剂配制a. 0.5％磷酸苯二钠（用缓冲液配制）；b. pH5醋酸盐缓冲液、pH7柠檬酸盐缓冲液、pH9.4硼酸盐缓冲液；c. 氯代二溴对苯醌亚胺试剂：取0.125g 2.6-二溴苯醌氯酰亚胺，用10mL 96％乙醇溶解，贮于棕色瓶中，存放在冰箱里。
保存的黄色溶液未变褐色之前均可使用；d. 酚的标准溶液：酚原液－取1g重蒸酚溶于蒸馏水中，稀释至1L，贮于棕色瓶中；酚工作液－取10mL 酚原液稀释至1L（每毫升含0.01毫克酚）；e. 甲苯；f. 0.3％硫酸铝溶液。
4. 标准曲线绘制：取1、3、5、7、9、11和13mL酚工作液，置于50mL容量瓶中，每瓶加入5mL缓冲液和4滴氯代二溴对苯醌亚胺试剂，显色后稀释至刻度，即得0.0002、0.0006、0.0010、0.0014、0.0018、0.0022和0.0026mg ·g -1浓度的酚标准溶液梯度。
实验十五：酸性磷酸酶的显
如钼酸铵-硫酸溶液，用 于与水解产物反应生成
有色络合物。
用于提取植物组织中的 酸性磷酸酶。
用于调节实验溶液的pH 值。
03
实验操作过程
实验步骤一：样本制备
准备不同浓度的酸性磷酸酶溶液，以 便后续实验对比。
准备适量的底物溶液，以备后续使用。
将样本分别置于离心管中，标记好浓 度和编号。
实验步骤二：显色反应
中孵育15分钟。
02
03
4. 加入4-氨基安替比林和铁 氰化钾，混匀。
04
05
5. 用分光光度计测量各试管 在550nm处的吸光度。
02
材料与试剂
实验材料
新鲜植物组织样品
如菠菜叶片、豌豆叶片等。
缓冲液
用于保持实验环境的pH稳定。
实验试剂
酸性磷酸酶溶液
显色剂
无水乙醇
醋酸
用于催化磷酸酯的水解 反应。
混合液以及准确测量吸光度值等细节，以确保实验结果的准确性和可靠性。
04
结果分析
数据分析
01
02
03
实验数据整理
将实验过程中记录的数据 进行整理，包括不同时间 点的吸光度值、温度、pH 值等。
数据清洗
去除异常值和缺失值，确 保数据分析的准确性。
数据转换
对数据进行适当的转换， 如求平均值、中位数等， 以便更好地反映实验结果。
通过实验数据，可以得出酸性磷酸酶的浓度与显色深浅呈正相关，可以通过观察颜 色变化来间接判断酶的浓度变化。
结果应用与意义
酸性磷酸酶在生物学、医学和农业等 领域具有广泛的应用价值，例如在骨 代谢、癌症诊断和治疗以及植物抗病 研究中都发挥着重要作用。
本实验结果可以为这些领域的研究提 供参考，帮助人们更好地了解酸性磷 酸酶的性质和作用机制，从而为相关 研究和应用提供有益的启示。
酶活性测定方法
酶活性测定1、碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase)试剂：0.1% p-nitrophenylphosphate disodium salt（P-硝基苯磷酸二钠）0.2mol/L 碳酸盐/碳酸氢盐缓冲溶液(pH: 9.6)——buffer0.2mol/L NaOH测定步骤：(1) 加入样品之前，0.1% P-硝基苯磷酸二钠及buffer 37°C孵化30 min；(2) 1mL污泥样品+1mL0.1% P-硝基苯磷酸二钠+2mL buffer 37°C孵化30 min；(3) 加入2mL 0.2mol/L NaOH终止反应；(4) 2500g 离心，上清液在410nm测定吸光度。
计算：每个污泥样品酶活性的测定均包含两个平行样S+一个空白样品S0。
[(S1- S0)+(S2- S0)]/2*0.704 (Eu)2、酸性磷酸酶(Acid phosphatase)试剂：0.1% p-nitrophenylphosphate disodium salt（P-硝基苯磷酸二钠）0.2mol/L HAc/Ac缓冲溶液(pH: 4.8)——buffer0.2mol/L NaOH测定步骤：(1) 加入样品之前，0.1% P-硝基苯磷酸二钠及buffer 37°C孵化30 min；(2) 1mL污泥样品+1mL0.1% P-硝基苯磷酸二钠+2mL buffer 37°C孵化30 min；(3) 加入2mL 0.2mol/L NaOH终止反应；(4) 2500g 离心，上清液在410nm测定吸光度。
计算：每个污泥样品酶活性的测定均包含两个平行样S+一个空白样品S0。
[(S1- S0)+(S2- S0)]/2*0.719 (Eu)3、a-葡萄糖甘酶(a-glucosidase)试剂：0.1% p-nitrophenyl a-D glucopyranoside（p-硝基苯-Α-D-葡吡喃糖苷）0.2mol/L Tris-HCl (pH: 7.6)测定步骤：(1) 加入样品之前，0.1% p-硝基苯-Α-D-葡吡喃糖苷及Tris-HCl 37°C 孵化30 min；(2) 1mL污泥样品+1mL 0.1% p-硝基苯-Α-D-葡吡喃糖苷+2mL Tris-HCl 37°C孵化60 min；(3) 沸水加热3min 终止反应；(4) 2500g 离心，上清液在410nm测定吸光度。
实验四 酸性磷酸酶Km及Vmax值测定
• 2、制作酶反应时间与产物生成量的关系曲线 • （目的：选取合适的反应时间）
管号
1
磷酸苯二钠
0.5
酶液
0.5
精确反应时间 3
碳酸钠溶液 2
酶液
－
Folin－酚溶液 0.5
加液程序表
2
3
4
5
6
0
0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
Certain Time
Stop the reaction
Color developed
• 生化实验课老师：于晓虹 • 实验报告请交到讲台上来 • 酶液稀释 取上清液３００微升，稀释
３０倍，用大试管装
• 科代表 李博恒
1、磷酸酶原液的制备：
称取5g绿豆芽茎（去头去根），加入pH5.6的 HAC缓冲液2ml研磨成浆并静置30分钟。纱布过滤， 取1.8ml滤液,以6000rpm，离心20min，取上清。
Folin-phenol reagent
加液程序表
01 2 3 4 5 6 7 8 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 1 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 22 2 2 2 2 2 2 2 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
实验四 酸性磷酸酶Km及 Vmax值测定
一、概述
酸性磷酸酶：
催化磷酸单酯的水解反应 存在于人的肝脏，前列腺等处 植物中以发芽的种子中含量最为丰富。
是生物体中重要的一种酶类，为某些疾病的检测 指标。
二、实验原理
磷酸苯二钠
酶液
苯酚 ＋ 磷酸氢二钠
酸性磷酸酶的
4000rpm，10min离心
（溶解ACP，
沉淀杂蛋白） 上清液 IV
EDTA9ml，饱和硫酸铵 10ml /100ml上清液 IV，
4000rpm，10min离心
2倍体积预冷甲醇
（ 沉淀ACP）
缓慢搅拌
沉 淀（酶纯化物）
蒸馏水溶解，洗涤 4000rpm，10min离心
上清液 V （酶液）
二、 ACP的比活性分析 1.各上清液中蛋白质含量测定
原理：染料结合比色法——CBBG-250， max=595nm；
步骤：标准曲线制作
各上清液中总蛋白测定（做平行管，进 行重复实验，减少随机误差。
2.各上清液中ACP活性测定
酚-4-AAP显色法:以磷酸苯二钠为底物，由 ACP催化生成苯酚，在碱性条件下苯酚与4AAP缩合最终生成红色醌类化合物，max = 510 nm；
上清液I 中ACP的比活性
各上清液中ACP的活性 总体积 酶的回收率= 上清液I中ACP的活性总体积
还可以计算蛋白回收率，反映纯化效果，代表方法的特异性。
三、 ACP的动力学分析 1. 时间进程（t-A ）曲线
酚生 A 成量
时间（t）
ACP的 t-A 曲线
2. 酶浓度-速度（[E]-A）曲线
反应 速度
实验安排
1. 实验分组 2. 实验时间安排 3. 实验内容选择与分工 4. 实验报告书写
活性测定的原理、方法和影响因素； 4. 熟悉酶活性测定的条件选择和方法建立。
试剂与器材
一、ACP的分离纯化试剂：见实验 教材P31； 二、ACP动力学分析试剂：见实验 教材P35；
三、器材：普通离心机，721分光光 度计，恒温水浴箱，研钵等。
实验内容
实验八酸性磷酸酯酶活力的测定
实验八-酸性磷酸酯酶活力的测定实验目的通过对酶促反应速度的测定，计算出酶的活力，掌握可见分光光度计的使用。
实验原理酸性磷酸酯酶（Acid Phosphatase，E．C．3．1．3．2．）存在于植物的种子、霉菌、肝脏和人体的前列腺之中，能专一水解磷酸单酯键。
本实验选用绿豆芽的酸性磷酸酯酶为材料，磷酸苯二钠为底物。
磷酸苯二钠经过酸性磷酸酯酶作用，水解后生成酚和无机磷，其反应式如下：：由上式可见，当有足量的底物磷酸苯二钠存在时，酸性磷酸酯酶的活力越高，所生成的产物酚和无机磷也越多。
根据酶活力单位的定义，在酶促反应的最适条件下每min生成1微摩尔（μmol）产物所需要的酶量为一个活力单位，因此可用Folin-酚法测定产物酚或用定磷法测定无机磷来表示酸性磷酸酯酶的活力。
本实验所采用的是Folin-酚法。
实验操作检查试管内是否干燥、洁净；若否，将其洗净并置于干燥箱内120℃烘干。
1.标准曲线的制作取试管6支，按0到5的顺序逐管编号，空白为0号。
按照表8-3-1，向各试管中依次加入0.4mmol/L酚标准应用液、0.2mol/L的pH5.6的乙酸盐缓冲液、1mol/L碳酸钠溶液和Folin-酚试剂，注意加样顺序不得搞错，否则显不了色。
摇匀，在35℃保温10min以上（先用烧杯盛35℃的水，置于水浴锅中，再将试管放入烧杯中保温，以防试管滑落入水中），参见实验八（2）的图8-2-4。
以0号试管为空白，在可见光分光光度计上680nm波长处读取各管的吸光度A680，以A680为横坐标、酚标准应用液的mL数为纵坐标作一条标准曲线，它应该是一条直线。
保留该数据，以便实验八（4）直接引用。
以上操作总结为表8-3-1。
表8-3-1标准曲线的制作试管123450.4mmol/L酚标准应用液（mL）0.10.20.30.40.50.2mol/L的pH5.6的乙酸盐缓冲液（mL）0.90.80.70.60.511mol/L碳酸钠溶液（mL）5Folin-酚试剂（mL）0.5摇匀，在35℃保温显色10min以上A680图8-3-7酶促反应加热操作2.酶活力的测定取2支试管，编号1＇、0＇，将0＇号试管作为空白。
检测酶的活性的方法
检测酶的活性的方法酶活性是指酶分子在特定条件下催化底物转化的速率。
酶活性的研究对于深入理解生化过程、疾病发生机制以及药物开发具有重要意义。
本文将介绍酶活性检测的一些常用方法。
1. p-Nitrophenyl Phosphate（pNPP）法：pNPP法是一种常用的颜色反应法，适用于检测酸性和碱性磷酸酶以及碱性酮糖酸酶的活性。
该方法的原理是将酶催化底物pNPP水解为p-nitrophenol（黄色）和磷酸，利用p-nitrophenol的比色特性（pH 10时吸光度λ=405 nm），通过检测吸光度的变化来间接测定酶活性。
2. 毛细管电泳法：毛细管电泳法（Capillary Electrophoresis, CE）是利用酶对底物的催化作用导致电泳迁移率发生变化的原理来检测酶活性。
该方法具有高灵敏度、高分辨率、快速分析等优点。
一般通过分离、富集和检测等步骤来实现。
3. 酶标记法（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA）：ELISA是一种常用的酶标记技术，适用于定量检测酶活性。
该方法的原理是利用酶标记的抗体与底物结合后，通过酶对底物的催化作用产生信号。
常用的酶标记有辣根过氧化物酶（Horseradish Peroxidase, HRP）和碱性磷酸酶等。
4. 荧光检测法：荧光检测法是利用酶对底物的催化作用改变溶液中荧光分子的性质来实现酶活性的检测。
其中，常用的荧光标记物有荧光素（Fluorescein）、羧酮荧光素（Tetramethylrhodamine, TAMRA）等。
通过测量荧光的强度和寿命来反映酶活性。
5. 放射性同位素法：放射性同位素法是一种高灵敏度的检测方法，利用酶对标记同位素底物的催化作用来测定酶活性。
常用的标记同位素有^14C、^32P、^3H等。
通过测定样品中放射性荧光的强度来反映酶活性。
以上仅介绍了一小部分常用的酶活性检测方法，每种方法都有其特点和适用范围。
酸性磷酸酶活性测定方法
实验九酸性磷酸（酯）酶活性测定1．目的要求掌握酸性磷酸（酯）酶活性测定的原理和方法。
2．方法原理酸性磷酸（酯）酶是一种存在于生物体内水解有机磷酸酯键的酶。
以对硝基酚磷酸钠作为底物，在酸性磷酸酯酶的作用下，在碱性条件下水解生成黄色的对硝基酚，可用分光光度计进行比色测定。
它们在各类种子中普遍存在，且含量较多，在萌发前期，随着种子的萌发进程活性增加，通常酸性磷酸酶活性与种子活力呈正比。
3．主要实验仪器及材料干种子或吸胀种子、电子天平、分光光度计、恒温水浴箱、带塞刻度试管、小烧杯、研钵、塑料管、剪刀。
4．掌握要点掌握常用的测定酸性磷酸（酯）酶活性的方法——对硝基酚磷酸钠法。
5．实验内容（1）酶液提取。
称取1g样品，用5mL研磨缓冲液在研钵中冰浴研磨成浆，再用5mL 研磨缓冲液冲洗，转移至离心管中，在20000rpm下离心10min。
吸出上清液，即为酶粗提液。
可放在冰箱中储存备用。
（2）活力测定。
取酶液0.1—1mL（视酶含量多少而定），加水至1mL，然后加入缓冲液1mL和对硝基酚磷酸钠溶液0.1mL。
空白对照用1mL研磨缓冲液代替酶制剂。
充分混匀后，放在30℃恒温箱中保温10min，时而摇动。
10min后，加入1m0.5mol/LNaOH溶液，充分混合，终止反应，并使对硝基酚呈黄色。
在400nm波长下测吸光度A。
（3）计算酶活性，以每毫克种子每分钟水解底物的nmol数表示。
酶活性nmol/min.mg=）（）（试样的gWVVA⨯⨯⨯min1011.3019.0式中0.019为pH=14时，对硝基酚的µmol吸光系数，即对硝基酚的浓度为1mol/L时，其A=0.019；3.1为0.0031×1000，反应混合液的体积为3.1，将µmol化为nmol乘上1000；V为酶制剂总体积；V1为每次用酶体积。
在实验中要保持酶制剂处于低温下以免酶活性下降，可在冰箱中提取和保存。
实验七：酸性磷酸酯酶反应进程曲线制作、酶活力测定
由上式可见，当有足量的底物磷酸苯二钠存在时，酸 性磷酸酯酶的活力越大，所生成的产物酚和无机磷也 越多。
二、实验原理
溶液颜色深浅与混合物的含量成正比关系；
本实验用A680对反应时间作图，可得到酶促反应进程曲线。
三、器材及试剂
三、器材及试剂
1、器材：
冷冻高速离心机，分光光度计，电子天平，水浴锅，干燥箱；
酚标准曲线制作
四、实验步骤
三、酶活力测定
管号 试剂
空白
0.5
样品
10倍稀释 0.5 20倍稀释 0.5 30倍稀释 0.5
磷酸苯二钠溶液/mL
35℃预热2 min 稀释的酶液（35℃）/mL, 一加入便计时
0
0.5
0.5
0.5
摇匀，35℃精确反应10min后立即各加入Na2CO3溶液5mL Folin-酚试剂/mL 0.5 0.5 0.5 0.5
绿豆芽质量
上清液体积
粗酶液得率（mL/g）
四、实验步骤
三、酶促反应曲线制作
管号 磷酸苯二钠溶液 稀释酶液（35℃） 不加 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
各0.5mL后35℃预热2min 各0.5mL，一加入便计时
反应时间/min
Na2CO3溶液 Folin-酚试剂
酶液
3
5
7
10
酶促反应的加样顺序不能出错；
制作酶促反应进程曲线时，要保持温和条件，反应液避免
剧烈搅拌和震荡，加样顺序、量、反应时间均需精确；
测定前请检查分光光度计波长是否为所需的； 样品测定时同样需要空白组对分光光度计进行调零； 制作标准曲线时，各管试剂添加量要准确； 最好用同一台仪器同一时间测定标准曲线和样品的吸光度。
酸性磷酸酶测定SOP_ACP临床意义_检验科生化项目SOP
严格按照标本接收程序签收标本。
4.3标本处理
以2500~3000r/min,离心6~10min，分离血清上机测定。如不能及时检测，分离血清于2-8℃保存。
4.4标本检测
4.4.1手工编排测试项目：样品按编号装入样品架，主屏幕按F1:ENTER DATA，在Position处输入样品所在样品架字母及所在位置号，按enter，在Patient Name处选择性输入病人名字，按enter，在Sample No处输入样品号，按enter，在Tests处使用检验键或检验组合键选择相应项目，根据需要选择相应的按键改变Mode（按F7:MEXT MODE选择样品管类型）、Priority（按F4:NEXT PRIORITY选择样品的处理模式）、Fluid（按F8:NEXT FLUID选择标本类型）。
Product和批号Lot，以及最低值校准液在样品架上的位置Start at Position，最后把校准液各个水
平的值按照由低到高的顺序输到对应位置，按F4：ASSIGN CUPS指定样品杯，校准液按顺序排列在样品架上，按F7：LOAD/RUN→F4：RUN或“RUN”运行键运行校准程序。
酸性磷酸酶测定
5.2校准条件
在室内质控失控、更换试剂批号、更换仪器主要配件或进行大保养后均需校准。无特殊情况校准周期为3个月。
5.3校准程序
主屏幕按F5:PROCESS CTRL→F1:CALIBRATION,按enter→F2:SET-UP＆RUN,按项目键选择所需要校准的项目名称METHOD，选中相应试剂批号LOT，输入操作者姓名Operator、校准液货号Calibrator
TMP ACP麝香草酚酞+无机磷酸盐
麝香草酚酞OH-麝香草酚酞阴离子
酸性磷酸酶的检测实验报告
酸性磷酸酶的检测实验报告一．实验目的1.以Gomori铅法为例学习细胞化学方法检测水解酶的原理和方法。
2.掌握小鼠等实验动物腹腔巨噬细胞采集和制片的方法。
3.观察巨噬细胞内酸性磷酸酶的分布进一步了解溶酶体的结构和功能。
二．实验原理1.向小鼠腹腔内注射无菌淀粉肉汤，排异反应使小鼠产生大量巨噬细胞，且巨噬细胞吞噬淀粉肉汤后不会对细胞造成伤害，反而被“喂养”。
连续多天注射使小鼠腹腔内聚集大量巨噬细胞。
2.由于无法直接观察酸性磷酸酶的分布，可以通过检测酸性磷酸酶代谢产物的方法间接观察。
酸性磷酸酶催化反应。
再通过福尔马林-钙固定，再通过显色与染色过程。
在光镜油镜下可观察到黑色颗粒，也就是硫化铅沉淀，从而观测酸性磷酸酶在巨噬细胞中的分布。
三．实验材料及设备1.实验材料：a)连续三天向腹腔中注射1mL6%淀粉肉汤的小鼠一只b)酸性磷酸酶工作液，c)福尔马林-钙固定液d)2%硫化铵溶液e)0.1%沙黄染液2.实验设备：a)普通光学显微镜b)载玻片若干c)4摄氏度冷藏柜d)染色皿若干、吸水纸、滴管、剪刀、白瓷板等四．实验方法及步骤（一）实验组：1.巨噬细胞采集与附着a)配置6%淀粉肉汤，连续三天向小鼠腹腔内注射，注意不要伤害小鼠器官。
b)用脊髓脱臼法快速处死小鼠。
在白瓷板上用剪刀打开小鼠腹腔，用适量生理盐水冲洗小鼠内脏。
c)用胶头滴管吸取生理盐水冲洗液，滴于洁净的载玻片上，注意不要涂抹，每个载玻片各滴两滴，注意做好编号与正反标记。
d)将载玻片置于有U形玻璃支架的大型培养皿中。
培养皿在4摄氏度的冷藏柜中放置30min。
用吸水纸吸去多余生理盐水，注意不要让细胞完全干燥。
2.酶的反应将玻片置于37摄氏度的酸性磷酸酶工作液中，温浴30min。
生理盐水小心冲洗，吸去多余水分。
3.细胞的固定将玻片置于福尔马林-钙固定液的染缸中，固定5min。
蒸馏水冲洗，吸去多余水分。
4.显色a)2%硫化铵溶液中处理3~5min，取出载玻片，用蒸馏水漂洗。
酸性磷酸酶检测试剂盒（PNP比色法）
酸性磷酸酶检测试剂盒（PNP比色法）酸性磷酸酶(ACP)检测试剂盒(PNP 比色法)简介：酸性磷酸酶(acid phosphatase ，ACP)分布极广泛，遍布各种组织，主要存在于细胞的溶酶体内，所以常作为溶酶体标志酶。
溶酶体外的酸性磷酸酶存在于内质网和胞质内，各种动物中的酸性磷酸酶各有不同，酸性磷酸酶的适宜pH 为4.5～5.5。
酸性磷酸酶是一个蛋白家族，哺乳动物中其分子量从18kD 到100kD 不等，该酶分为两类，一类为酒石酸盐敏感型，一类为氟离子敏感型。
溶酶体中的酸性磷酸酶为酒石酸盐敏感型，而红细胞和巨噬细胞中的酸性磷酸酶为氟离子敏感型。
Leagene 酸性磷酸酶(ACP)检测试剂盒(PNP 比色法)(Acid Phosphatase Colorimetric Assay Kit)检测原理是利用Para-nitrophenyl phosphate (pNPP)为一种常用的磷酸酶显色底物，在酸性条件下，可在酸性磷酸酶的作用下生成p -nitrophenol 。
在碱性条件下p -nitrophenol 呈黄色，产物黄色越深，说明酸性磷酸酶活性越高，反之则酶活性越低，通过分光光度比色法(分光光度计)测定处吸光度，据此通过比色分析就可以计算出酸性磷酸酶活性水平。
该试剂盒可用于检测细胞或组织的裂解液或匀浆液、血浆、血清、尿液等样品中内源性的酸性磷酸酯酶活性。
该试剂盒仅用于科研领域，不宜用于临床诊断或其他用途。
组成：自备材料：1、比色杯2、水浴锅或恒温箱3、分光光度计操作步骤(仅供参考)：1、准备样品：①血浆、血清和尿液样品：血浆、血清按照常规方法制备后可以直接用于本试剂盒的测定，编号名称TE0034 60T Storage试剂(A): ACP Assay buffer 50ml 4℃ 试剂(B): pNPP2支 -20℃ 避光试剂(C): p -nitrophenol(10mM) 0.2ml-20℃ 避光使用说明书1份尿液通常也可以直接用于测定，冻存，用于酸性磷酸酶的检测。
植物根系酸性磷酸酶活性测定
植物根系酸性磷酸酶活性测定1.原理该方法以对硝基苯磷酸二钠（即p-NPP）为底物，该底物在土壤酸性磷酸酶的催化下水解生成黄色的对硝基苯酚（即p-NP），该黄色溶液在410nm处有最大吸收光值，根据对硝基苯酚的生成数量与黄色溶液的吸光度呈正比来进行定量分析，以此来反映土壤酸性磷酸酶的活性。
酶活性是以单位时间内单位重量鲜根或单株根系水解p-NPP生成的对硝基苯酚（p-NP）的量来表示（μg·h-1·g-1鲜根或μg·h-1/株）。
2.测定方法1）称取（1.2±0.1）g鲜根，加入8 mL 0.2mol/L醋酸钠缓冲液（pH 5.8），然后进行冰浴研磨，双层纱布过滤，12000 r/min离心15min，静置。
2）取上清液1mL于15mL离心管中，加入2mL 0.05mol/L对硝基苯磷酸二钠（醋酸钠缓冲液配制），摇匀后加盖，于37℃水浴30min。
3）水浴后加入2mL 0.5mol/L CaCl2及2mL 2mol/L NaOH以终止反应，摇匀。
4）2500r/min离心5min，取上清液于15mL离心管中，4000r/min下再离心5min。
5）取上清液在410nm波长比色，并记录吸光值A410。
3.标准曲线的制作1）取13支15mL离心管，按顺序编号，并按表1加入试剂。
表1对硝基苯酚标准曲线配制表2）混匀后，在2500r/min 下离心5min ，再在4000r/min 下离心5min 以0号作为对照，在410nm 波长下测光吸收值，并记录光吸收值A 410。
3）以吸光值为横坐标、对硝基苯酚的含量为纵坐标计算直线回归方程y=a+bx 及相关系数R ，即对硝基苯酚含量410)(A b a mol n ⨯+=μ。
4.计算方法根系酸性磷酸酶活性是以单位时间内单位重量鲜根或单株根系水解p-NPP 生成的对硝基苯酚（p-NP ）的量来表示（μg·h -1·g -1鲜根或μg·h -1/株）。
根系表面组织酸性磷酸酶活性的测定
根系表面组织酸性磷酸酶活性测定一、实验目的掌握根表面和跟组织酸性磷酸酶活性测定的原理和方法二、实验原理以对硝基苯酚磷酸盐为底物，对硝基苯酚磷酸盐在酸性磷酸酶作用下生成对硝基苯酚，对硝基苯酚在碱性条件下水解生成黄色的酚黄，酚黄在波长405nm处具有最大光吸收。
因此，可以利用分光光度计法，通过测量吸光值的确定溶液中酚黄的含量，再换算成酸性磷酸酶活性。
三、材料大蒜根系、芹菜根系四、方法步骤1、标准曲线溶液配制1 2 3 4 5 6 7 0.05mg/mL PNP (ml)0 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 50mM柠檬酸缓冲溶液 4.5 4.4 4.3 4.1 3.9 3.7 3.5 1M NaOH0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 PNP(μg/管）0 5 10 20 30 40 50 A4050 0.097 0.176 0.375 0.569 0.727 0.941标曲方程：y =0.0187x - 0.0012 R² = 0.99912、样品测定2.1根系表面酸性磷酸酶活性测定称取大蒜根尖2cm，共0.2g，芹菜根尖0.5g，分别加入5ml反应液（反应液由0.25mg/mlPNP及柠檬酸缓冲液配制），28℃暗培养10min，然后加0.5ml NaOH 终止反应，然后在405nm处测吸光值。
2.2根组织酸性磷酸酶活性测定取0.2g大蒜根尖，芹菜根尖0.5g，分别加入50mM缓冲溶液4℃研磨成匀浆，定容至10ml，然后4000rmp离心10min，取上清液备用。
量取上清液0.5ml，加入4.5ml柠檬酸缓冲液，在28℃下放置10min,加入0.5mlNaOH液，在405nm处测量其吸光度值。
五、结果计算1.根系表面酸性磷酸酶活性测定：蒜苗根尖m=0.196g，A405=0.862，PNP浓度=46.16μg/5ml蒜苗根系表面酸性磷酸酶活性=1413.06(μg·h-1·g-1Fw)芹菜根系m=0.499g，A405=0.901，PNP浓度=48.25μg/5ml芹菜根系表面酸性磷酸酶活性=580.16(μg·h-1·g-1Fw)2.根组织酸性磷酸酶活性测定：蒜苗根尖m=0.218g ，A405=0.015，PNP浓度=0.866μg/5ml蒜苗根系组织酸性磷酸酶活性=23.84（μg·h-1·g-1Fw）芹菜根系m=0.480g ，A405=0.106，PNP浓度=5.73μg/5ml芹菜根系组织酸性磷酸酶活性=71.66（μg·h-1·g-1Fw）六、讨论。
2.1土壤酸性磷酸酶活性测定
土壤酸性磷酸酶活性测定土壤有机磷转化受多种因子制约，尤其是磷酸酶的参与，可加速有机磷的脱磷速度。
在pH 4-9 的土壤中均有磷酸酶。
积累的磷酸酶对土壤磷素的有效性具有重要作用。
研究证明，磷酸酶与土壤碳、氮含量呈正相关，与有效磷含量及pH也有关。
磷酸酶活性是评价土壤磷素生物转化方向的强度的指标。
磷酸苯二钠比色法1.试剂配制（1）0.5%磷酸苯二钠（用缓冲液配制）。
（2）pH5醋酸盐缓冲液。
a.醋酸盐缓冲液（pH=5.0）A：0.2mol/L 醋酸溶液（11.5mL，稀释至1000mL）B：0.2mol/L 醋酸钠溶液（16.4g C2H3O2Na 或27.2g C2H3O2Na·3H2O 定容至1000mL）14.8ml A + 35.2ml B混合即得（3）氯代二溴对苯醌亚胺试剂：取0.125g 2,6-二溴苯醌氯酰亚胺，用10ml 96%乙醇溶解，贮于棕色瓶中，存放在冰箱里。
保存的黄色溶液未变褐色之前均可使用。
（4）酚的标准溶液：酚原液——取1g重蒸酚溶于蒸馏水中，稀释至1L，贮于棕色瓶中。
酚工作液——取10ml 酚原液稀释至1L（每毫升含0.01mg酚）。
（5）甲苯。
（6）0.3%硫酸铝溶液。
标准曲线绘制：取1、3、5、7、9、11、13ml 酚工作液，置于50ml容量瓶中，每瓶加入5ml 缓冲液和4滴氯代二溴对苯醌亚胺试剂，显色后稀释至刻度，30min后比色测定。
以吸光度为横坐标，浓度为纵坐标（mg）绘成标准曲线。
2.操作步骤称5g风干土置于200ml三角瓶中，加2.5ml 甲苯，轻摇15min后，加入20ml 0.5%磷酸苯二钠（用醋酸盐缓冲液配制），仔细摇匀后放入恒温箱，在37℃下培养24h后于培养液中加100ml 0.3%硫酸铝溶液并过滤。
吸取3ml 滤液于50ml 容量瓶中，然后按绘制标准曲线所述方法显色。
用硼酸缓冲液时，呈现蓝色，在分光光度计上于660nm 处比色。
3.结果计算磷酸酶活性，以24h后1g土壤中释出的酚的毫克数表示。
土壤酸性磷酸酶(S-ACP)检测
土壤酸性磷酸酶（S-ACP）检测
土壤酸性磷酸酶（Soil acid phosphatase, S-ACP）是土壤磷酸酶的一种，土壤磷酸酶是一类催化土壤有机磷化合物矿化的酶，其活性的高低直接影响着土壤中有机磷的分解转化及其生物有效性，是评价土壤磷素生物转化方向与强度的指标。
土壤磷酸酶受到土壤碳、氮含量、有效磷含量和pH显著影响。
通常按照其最适pH 范围，分为碱性、中性和酸性三种类型磷酸酶。
酸性环境中，土壤酸性磷酸酶催化磷酸苯二钠水解生成苯酚和磷酸氢二钠，通过测定酚的生成量即可表征土壤酸性磷酸酶的活性。
迪信泰检测平台采用生化法，利用醋酸盐缓冲液-比色法可高效、精准的检测土壤酸性磷酸酶活性变化。
此外，我们还提供其他土壤酶类检测服务，以满足您的不同需求。
生化法测定土壤酸性磷酸酶样本要求：
1. 请确保样本量大于0.2g或者0.2mL。
周期：2~3周
项目结束后迪信泰检测平台将会提供详细中英文双语技术报告，报告包括：
1. 实验步骤（中英文）
2. 相关参数（中英文）
3. 图片
4. 原始数据
5. 土壤酸性磷酸酶活性信息。
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实验九酸性磷酸（酯）酶活性测定1．目的要求
掌握酸性磷酸（酯）酶活性测定的原理和方法。
2．方法原理
酸性磷酸（酯）酶是一种存在于生物体内水解有机磷酸酯键的酶。
以对硝基酚磷酸钠作为底物，在酸性磷酸酯酶的作用下，在碱性条件下水解生成黄色的对硝基酚，可用分光光度计进行比色测定。
它们在各类种子中普遍存在，且含量较多，在萌发前期，随着种子的萌发进程活性增加，通常酸性磷酸酶活性与种子活力呈正比。
3．主要实验仪器及材料
干种子或吸胀种子、电子天平、分光光度计、恒温水浴箱、带塞刻度试管、小烧杯、研钵、塑料管、剪刀。
4．掌握要点
掌握常用的测定酸性磷酸（酯）酶活性的方法——对硝基酚磷酸钠法。
5．实验内容
（1）酶液提取。
称取1g样品，用5mL研磨缓冲液在研钵中冰浴研磨成浆，再用5mL 研磨缓冲液冲洗，转移至离心管中，在20000rpm下离心10min。
吸出上清液，即为酶粗提液。
可放在冰箱中储存备用。
（2）活力测定。
取酶液0.1—1mL（视酶含量多少而定），加水至1mL，然后加入缓冲液1mL和对硝基酚磷酸钠溶液0.1mL。
空白对照用1mL研磨缓冲液代替酶制剂。
充分混匀后，放在30℃恒温箱中保温10min，时而摇动。
10min后，加入1m0.5mol/LNaOH溶液，充分混合，终止反应，并使对硝基酚呈黄色。
在400nm波长下测吸光度A。
（3）计算酶活性，以每毫克种子每分钟水解底物的nmol数表示。
酶活性nmol/min.mg=
）
（
）
（
试样的
g
W
V
V
A
⨯
⨯
⨯
min
10
1
1.3
019
.0
式中0.019为pH=14时，对硝基酚的µmol吸光系数，即对硝基酚的浓度为1mol/L时，其A=0.019；
3.1为0.0031×1000，反应混合液的体积为3.1，将µmol化为nmol乘上1000；
V为酶制剂总体积；
V1为每次用酶体积。
在实验中要保持酶制剂处于低温下以免酶活性下降，可在冰箱中提取和保存。